ارزیابی خواص آنتی اکسیدانی عصاره تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه با پیش تیمار اولتراسوند به روش سطح پاسخ

بهداشت مواد غذایی

مقاله 6، دوره 4، 4 (16) زمستان، اسفند 1393، صفحه 55-67   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

رقیه اشرفی یورقانلو^{* 1}؛ محمد علیزاده خالدآباد²؛ محمود رضازاد باری³؛ لطیفه پوراکبر⁴

¹مدرس دانشگاه فنی و حرفه‌ای - دانشجوی دکتری گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

²دانشیار گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

³دانشیار گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

⁴استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران.

چکیده

   آنتی اکسیدان‌ها به دلیل ویژگی‌های گسترده بیولوژیکی و نقش آنها در جلوگیری از بروز بیماری‌های مختلف، به عنوان ترکیبات سلامت بخش مورد توجه می‌باشند. تفاله انگور واریته ریش بابا (vitisviniferacv.rish baba ) حاوی مقدار بالایی از ترکیبات آنتی اکسیدانی است. تخمیر تفاله انگور با آسپرژیلوس اریزه باعث استخراج بیشتر این ترکیبات می گردد. استخراج به کمک امواج فراصوت یکی از مهم‌ترین روش‌های استحصال ترکیبات ارزشمند از منابع گیاهی است و باعث تسریع روند استخراج می‌گردد. هدف از انجام این پژوهش، بررسی تاثیر فاکتورهای مختلف بر استخراج ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی و خواص آنتی‌اکسیدانی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه و با بهره‌گیری از امواج فراصوت و با استفاده از روش سطح پاسخ بود. دما ( 67 – 55 درجه سلسیوس)، زمان (32 – 24 دقیقه)، غلظت حلال (49-37 درصد) و میزان پودر آب پنیر (50 -10 گرم) فاکتورهای مورد مطالعه بودند. نتایج این تحقیق نشان داد با افزایش دما و غلظت حلال میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی افزایش یافته است. بالاترین میزان استخراج ترکیبات فنلی (23/90 میلی گرم اسید گالیک در 100 گرم نمونه) و بالاترین میزان استخراج ترکیبات فلاونوئیدی (81/71 میلی‌گرم کوئرسیتین در 100 گرم نمونه) در دمای 64 درجه سلسیوس و مدت زمان 30 دقیقه و با غلظت حلال 46% به دست آمدند. بالاترین میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH(9/87%) و فعالیت ضد اکسایشی کل FRAP ( µmol/g203)در دمای 58 درجه سلسیوس و مدت زمان 30 دقیقه و با غلظت حلال 46%  و میزان پودر آب پنیر 20 گرم بدست آمدند. با افزایش زمان استخراج میزان ترکیبات فنلی، فلاونوئیدی، DPPHو FRAPسیر صعودی نشان دادند. نتایج به دست آمده، بهره‌گیری از تخمیر به کمک آسپرژیلوس اریزه و فرآیند استخراج با بکارگیری تکنیک اولتراسوند را به عنوان روشی مناسب جهت استخراج مواد بیولوژیک از تفاله انگور با مزایایی از جمله میزان استخراج بالا، کاهش میزان حلال و دمای مورد نیاز و صرفه‌جویی در زمان را به اثبات می‌رساند.

کلیدواژه‌ها

آسپرژیلوس اریزه اولتراسوند؛ ترکیبات فنلی؛ تفاله انگور

اصل مقاله

مقدمه

   اکسیداسیون چربیها بدطعمی، کاهش کیفیت تغذیه‌ای و تشکیل ترکیبات سمی را به دنبال داشته و یک عامل خطر جدی برای مصرف کننده محسوب می‌شود (Esterbauer et al., 1993; Markesbery et al.,1998). یکی از راه‌های جلوگیری از اکسیداسیون چربیها به کارگیری آنتی‌اکسیدانها در سیستم‌های غذایی می‌باشد. BHA،BHT و TBHQ از مهم‌ترین آنتی‌اکسیدانهای سنتزی هستند که کاربرد گسترده‌ای در صنعت روغن دارند ولی از سوی دیگر استفاده از آنها سلامتی انسان را تهدید می‌کند (X Hou, 2003) در سالهای اخیر به دلایل مربوط به سلامتی توجه محققین به آنتی‌اکسیدانهای طبیعی معطوف گردیده است و تحقیقات گسترده‌ای به منظور بکارگیری این ترکیبات به عنوان جایگزین‌های آنتی‌اکسیدانهای سنتزی در دست اجراست (Madhavi et al., 1996).

   مطالعات نشان داده است که فعالیت آنتی‌اکسیدانی بعضی از میوه‌ها و سبزیجات به مقدار کل ترکیبات فنلی آنها بستگی دارد (Mour et al., 2001). ترکیبات فنلی یک گروه متابولیت‌های ثانویه آروماتیک گیاهی هستند که به طور گسترده‌ای در سراسر گیاه پخش شده‌اند و دارای تاثیرات بیولوژیکی متعدد همچون فعالیت آنتی‌اکسیدانی و فعالیت ضد باکتریایی هستند (Lee et al., 2000). امروزه به منظور حفظ و افزایش سلامت مصرف کنندگان و نیز دستیابی به منابع جدید و ارزان قیمت آنتی‌اکسیدانهای طبیعی، تحقیقات در این مورد ضروری است. به همین دلیل، در سال‌های اخیر توجه زیادی به ضایعات محصولات کشاورزی حاوی آنتی‌آکسیدانهای طبیعی معطوف گردیده است. یکی از این منابع پسماندهای کارخانجات تولیدکننده آبمیوه و کنستانتره است. از این قبیل پسماندها میتوان به تفاله‌های مرکبات، گوجه فرنگی، سیب و انگور اشاره نمود. انگور یکی از میوه‌هایی است که به طور گسترده در سراسر جهان کاشته می‌شود. مطابق آمار FAOFAOSTAT, 2005) ) تولید انگور در سال 2005 به 66 میلیون تن رسیده است. انگور به دلیل غنی بودن از ترکیبات فنلی مانند اسید گالیک، کاتچین و رزوراترول و انواع وسیعی از پروسیانیدین‌ها، میوه ارزشمندی است. تحقیقات سال‌های اخیر حاکی از فعالیت‌های بیولوژیکی وسیع این ترکیبات است که می‌توان به جلوگیری از اکسیداسیون لیپوپروتئین‌های با دانسیته کم بدن انسان، خواص آنتی‌اکسیدانی، اثرات محافظتی در مقابل اشعه و تابش، جلوگیری از آب مروارید، اثرات ضد قند خون بالا، تعدیل بیان سیستم‌های آنزیمی آنتی‌اکسیدانی، اثرات ضدالتهابی و درمان سرطان اشاره نمود (Lee et al., 2000).

   تفاله انگور یکی از پسماندهایی است که سالیانه به مقدار زیاد (50000 تن در سال) در کارخانجات آبمیوه‌گیری به دست می‌آید. تفاله انگور حاوی ترکیبات آنتی‌اکسیدانی است که به دلیل وجود همین ترکیبات، استفاده از آن به عنوان خوراک دام و یا کود زراعی با مشکلاتی همراه است. تعدادی از دام‌های اهلی قادر به تحمل این ترکیبات نیستند و میل چندانی به خوردن آن ندارند (Van Soest, 1994) و در صورت استفاده به عنوان کود زراعی نیز این ترکیبات باعث کاهش حاصل خیزی خاک می‌گردند (Northup et al., 1998). به هر حال این ترکیبات سلامت بخش بوده و می‌توانند کاربردهای زیادی در صنایع غذایی داشته باشند. استخراج ترکیبات فنلی عموما با استفاده از روش استخراج با حلال انجام می‌گیرد، نوع و غلظت حلال، زمان و دما مهم‌ترین پارامترها برای دستیابی به بالاترین میزان استخراج محسوب می‌شوند. حلال‌های مختلفی در سال‌های گذشته برای استخراج ترکیبات فنلی از بافت‌های گیاهی مورد استفاده قرا گرفته‌اند، حلالیت ترکیبات فنلی بسته به نوع حلال، در جه پلیمریزاسیون آنها و برهم کنش آنها با سایر ترکیبات موجود در بافت‌های گیاهی متفاوت است. در کل حلال‌های اتانول و متانول به صورت مخلوط با آب (80 – 40%) توانائی بیشتری نسبت به حالت خالص و در مقایسه با سایر حلال‌ها در استخراج ترکیبات فنلی از بافت‌های گیاهی دارند و بنا به دلایل زیست محیطی اتانول از ارجحیت بیشتری برخوردار است (Spingo et al., 2007). امروزه استفاده از امواج فراصوت با توجه به اثرات موثر آن، رو به گسترش می‌باشد. اثرات مکانیکی امواج فراصوت و کاویتاسیون های تولید شده، باعث افزایش نفوذپذیری حلال به داخل سلول‌های گیاهی و به دنبال آن افزایش بازدهی استخراج در دماهای پایین می‌گردد (Cho et al., 2006). اخیرا قارچ‌ها به عنوان منابع جدیدی از آنتی‌اکسیدانها مورد توجه قرار گرفته‌اند، برخی گونه‌های قارچ‌ها آنتی‌اکسیدانها را به عنوان متابولیت‌های ثانویه تولید می‌کنند. تعدادی از تحقیقات نشان می‌دهند برخی از قارچ‌ها در طی تخمیر آنزیم‌های متابولیسمی تولید می‌کنند و در نتیجه فعالیت این آنزیم‌ها ترکیبات فنلی آزاد می‌گردند. فرایند تخمیر توسط آسپرژیلوس‌ها باعث افزایش قابل توجه در میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی حاصل می‌گردد. در طی تولید furu و rice koji و Kinema میزان ترکیبات فنلی افزایش می‌یابد. به عنوان مثال Kinema دارای 144%ترکیبات فنلی بالاتری نسبت به لوبیای سویای پخته شده و تخمیر نشده است (Moktan et al., 2008).

   در این تحقیق تاثیر شرایط استخراج شامل دما، زمان، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر (wp) بر روی میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و خواص آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های به دست آمده از تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه بررسی شد.

 

مواد و روش‌ها

   میوه انگور رقم ریش بابا از مرکز تحقیقات کشاورزی استان آذربایجان غربی تهیه شد. نمونه‌ها پس از آب‌گیری در فریزر 18- درجه سلسیوس تا زمان آزمایش نگه‌داری شدند. در هنگام شروع آزمایشات ابتدا به100 گرم از نمونه تفاله پودر آب پنیر در مقدار مشخص (50-10گرم) بر اساس طرح آزمایش افزوده شد و سپس با 5/1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون آبی آسپرژیلوس اریزهبا غلظت سلولی 10⁸×2/1 تلقیح و به مدت 5 روز در دمای 30 درجه سلسیوس انکوبه شد. آسپرژیلوس اریزه PTCC No.5163 از مرکز کلکسیون قارچ و باکتری سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی به صورت لیوفلیزه خریداری شد.

مواد شیمیایی با خلوص بالای مورد نیاز از شرکت مرک خریداری شدند.

استخراج

   استخراج نمونه‌ها بر اساس شرایط دما، زمان و غلظت حلال مطابق با طرح آزمایش (جدول1) در یک حمام اولتراسونیک (ایتالیا Tecno-Gas.S.P.A) در معرض امواج اولتراسوند (فرکانس 30 کیلوهرتز) انجام گرفت. سپس عصاره‌های استخراج شده با استفاده از کاغذ صافی از مواد جامد جداسازی شده و تا زمان انجام آزمایشات در یخچال نگه‌داری شدند.

اندازه‌گیری مقدار کل ترکیبات فنلی

مقدارکل ترکیبات فنلی موجود در عصاره‌ها از طریق رنگ‌سنجی به روش فولین- سیوکالتوFolin-ciocalteu)) اندازه‌گیری شد (.(McDonald et al., 2001 بعد از آماده‌سازی نمونه‌ها و مخلوط شدن با معرف، مقدار جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر دو پرتویی ماوراءبنفش- مرئی (PG instruments, UK) در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. برای تعیین محتوای فنل کل بر حسب میلی‌گرم در گرم نمونه از منحنی استاندارد اسید گالیک استفاده شد.

Y= 0.0054X+0.0628R2=0.9998

Y مقدار جذب و X میزان ترکیبات فنلی

اندازه‌گیری مقدار کل ترکیبات فلاونوئیدی

   برای تعیین مقدار کل ترکیبات فلاونوئیدی از روش رنگ سنجی استفاده شد (Chang et al., 2002).جذب مخلوط آماده شده در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری خوانده شد. برای تعیین محتوای فلاونوئید کل بر حسب میلی‌گرم در گرم نمونه از منحنی استاندارد کوئرسیتین استفاده شد.

Y= 0.0063X                R2= 0.997

Y مقدار جذب و X میزان ترکیبات فلاونوئیدی

قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH

   فعالیت ضداکسایشی ترکیبات فرار گیاهی باروش افزودن هیدروژن یا توانایی جمع آوری رادیکال، با استفاده از رادیکال پایدار DPPH انجام شد (Hatano et al., 1998).DPPH یک رادیکال آزاد پایدار است که در حضور آنتی‌اکسیدان‌ها در نمونه‌های بیولوژیک به صورت زیر خنثی می‌شود :

DPPH + RH                 (DPPH – R)- H + R^.

   رادیکال آزاد DPPH در محیط الکل اتانول باعث حداکثر جذب در 517 نانومتر و ایجاد یک رنگ ارغوانی می‌گردد. در صورت خنثی شدن این رادیکال، از شدت رنگ ارغوانی کاسته شده و به زرد کم رنگ تغییر می‌یابد، بنابراین کاهش جذب نوری متناسب با توانایی خنثی سازی رادیکال DPPH و به عبارت دیگر قدرت آنتی‌اکسیدانی نمونه مورد نظر خواهد بود. نتایج به صورت درصد مهار یا خنثی سازی رادیکال DPPH توسط نمونه مورد نظر بیان می‌شود.

   40 میکرولیتر از عصاره به لوله آزمایش منتقل شده و 1 میلی‌لیتر از محلول 2/0 میلی مولار DPPH به آن اضافه شد. کاهش جذب در 520 نانومتر بعد از 30 دقیقه برای نمونه‌ها خوانده شد. جذب رادیکال DPPH بدون عصاره بعنوان کنترل در نظر گرفته شد. درصد جمع‌آوری رادیکال مطابق فرمول ذیل محاسبه شد:

DPPH = درصد مهار ((A0-A1)/A0)*100

   A0 جذب کنترل بدون حضور عصاره است که بلانک نامیده می‌شود. و  A1 جذب عصاره ضد اکساینده در حضور عصاره است.

فعالیت ضد اکسایشی کل

   به منظور ارزیابی فعالیت ضد اکسایشی کل عصاره‌ها از روش FRAP استفاده شد (Benzie and Strain, 1996). 10 میکرولیتر از عصاره با 3 میلی‌لیتر از معرف FRAP مخلوط و جذب مخلوط حاصل در 595 نانومتر ارزیابی شد. غلظت‌های مشخصی (10 – 6/0 میکرومولار) از سولفات آهن(FeSO₄)جهت منحنی کالیبراسیون مورد استفاده قرار گرفت.

طرح آماری و تجزیه و تحلیل داده‌ها

   در این تحقیق از طرح کامپوزیت مرکزی با 4 متغیر مستقل، 5 سطح و 6 تکرار در نقطه مرکزی طرح (به منظور بررسی تکرار پذیری طرح) استفاده گردید، تعداد کل تیمارها 30 تیمار شد (جدول 1). دما، زمان، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر متغیرهای مستقل و میزان ترکیبات پلی‌فنلی و فلاونوئیدها و قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH و فعالیت ضد اکسایشی کل (FRAP) متغیرهای وابسته بودند.

معادله بدست آمده از طرح مرکب مرکزی با استفاده از معادله چند جمله‌ای درجه دو چنین بود:

12y=خ²0+i=1nخ²ixi+i=1nخ²iixi2+i=1nj>inخ²ijxixj">

   در این معادله 12y">  پاسخ پیش‌بینی شده، β₀ثابت مدل، β_jضریب خطی، X_i  و X_jمتغیرهای فاکتور در شکل کد شده، ijβ ضریب برهم کنش و _jjβ ضریب درجه دوم می‌باشد.

   مناسب بودن مدل از روی داده‌های عدم برازش مدل، ضریب تبیین (R²)،  R²- adjustedو predictionR²for و F-value حاصل از جدول آنالیز واریانس بررسی شد. معنی‌داری مدل و متغیرهای آن در سطح احتمال 01/0p<تعیین شد.

 

 

جدول 1- طرح CCD به کار رفته برای بهینه سازی شرایط استخراج ترکیبات فنلی و خاصیت آنتی‌اکسیدانی

آزمون	Wp (گرم)	غلظت حلال (%)	دما (درجه سلسیوس)	زمان (دقیقه)
1	30	43	61	28
2	30	37	61	28
3	30	43	61	28
4	20	40	58	30
5	30	43	61	28
6	40	40	58	30
7	30	43	55	28
8	40	40	64	26
9	40	46	64	26
10	40	46	58	30
11	40	46	58	26
12	40	40	64	30
13	20	46	64	26
14	30	49	61	28
15	30	43	61	32
16	40	40	58	26
17	30	43	61	28
18	30	43	61	28
19	20	40	64	26
20	20	46	58	26
21	30	43	61	28
		ادامه جدول 1
آزمون	Wp (گرم)	غلظت حلال (%)	دما (درجه سلسیوس)	زمان (دقیقه)
22	40	46	64	30
23	20	40	58	26
24	20	46	58	30
25	20	46	64	30
26	30	43	67	28
27	20	40	64	30
28	50	43	61	28
29	30	43	61	24
30	10	43	61	28

 

یافته‌ها

   بر اساس نتایج حاصل، مدل چند جمله‌ای درجه دو برای تمامی پاسخ‌ها (میزان ترکیبات پلی فنلی، میزان ترکیبات فلاونوئیدی، میزان مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH و فعالیت ضد اکسایشی کل (FRAP) برازش یافت. فرض اولیه و پیشنهادی حاکی از موثر بودن همه پارامترها با توان اول و دوم و اثر متقابل متغیرها بود. به منظور مشخص نمودن پارامترهای موثر از غیرموثر از تحلیل آماری با آزمون فرض و  پارامتر P-value استفاده شد. مدل‌های محاسباتی و ضرایب رگرسیونی تمام این مدل‌ها ارائه شده است. مدل‌های چند جمله‌ای درجه دو تمامی پاسخ‌ها ضرایب رگرسیونی قابل قبولی را نشان دادند. اگر ضریب رگرسیون بالای 80/0 باشد نشان‌دهنده مناسب بودن یک مدل و انطباق داده‌ها و خط محاسباتی حاصل از رگرسیون است.

مقدار کل ترکیبات فنلی

   نتایج آنالیز واریانس نشان داد که دما، زمان و غلظت حلال هم به صورت خطی و هم به صورت درجه دوم تاثیر معنی‌داری بر میزان استخراج ترکیبات فنلی دارد. میزان پودر آب پنیر در شکل خطی اثر معنی‌دار نداشت ولی در شکل درجه دوم اثر آن معنی‌دار بود. اثر متقابل دما و غلظت حلال معنی‌دار است (01/0p<). با افزایش دما و غلظت حلال میزان ترکیبات فنلی افزایش یافته است (شکل 1). بالاترین میزان استخراج ترکیبات فنلی (23/90 میلی‌گرم اسید گالیک در 100 گرم نمونه) در دمای 64 درجه سلسیوس و مدت زمان 30 دقیقه و با غلظت حلال 46% بدست آمد.

 

 

شکل1– میزان ترکیبات پلی فنلی تفاله انگور تخمیر شده با  آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از غلظت حلال و دمای استخراج

  معادله 1 رابطه بین میزان ترکیبات فنلی را با میزان پودر آب پنیر، غلظت حلال، زمان و دما را نشان می‌دهد.R²مدل، R²-adjusted و R²- pridicted به ترتیب برابر با 4/99، 1/99 و 8/98 درصد و عدم تطابق آن غیر معنی‌دار می‌باشد.

 

TP=59.44833-0.85125 * A + 14.74306 * B + 16.99396 * C + 2.161042 * D + 9.650625 * B * C + 1. 036875 * B * D + 0.888125 * C * D -2.77667*A²-3.82417*B²-5.37823*C²-3.00323 * D²

 

A = میزان پودر آب پنیر، B = غلظت حلال، C = دما، D = زمان

مقدار کل ترکیبات فلاونوئیدی

   محصولات جانبی به دست آمده از فراوری انگور مانند دانه‌ها یا تفاله، یک منبع ارزان و غنی از فلاونوئیدها با خاصیت آنتی‌اکسیدانی محسوب می‌شوند که می‌توانند به عنوان مکمل غذایی مورد استفاده قرار گیرند (Gonzalez, 2004). نتایج آنالیز واریانس نشان داد که همه متغیرها (دما، زمان، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر) هم به صورت خطی و هم به صورت درجه دوم تاثیر معنی‌داری بر میزان استخراج ترکیبات فلاونوئیدی داشتند. اثر متقابل دما و غلظت حلال معنی‌دار است (01/0p<). با افزایش دما و غلظت حلال میزان فلاونوئیدها افزایش یافته است (شکل 2). با افزایش میزان پودر آب پنیر تا 30 گرم میزان استخراج فلاونوئیدها افزایش یافته ولی در مقادیر بالاتر از 30 گرم پودر آب پنیر، میزان استخراج فلاونوئیدها سیر نزولی نشان داد (شکل 3). با افزایش زمان تا 28 دقیقه میزان استخراج فلاونوئیدها افزایش یافته ولی در مقادیر بالاتر از 28 دقیقه، میزان استخراج فلاونوئیدها سیر نزولی تدریجی نشان داد (شکل 3).

 

 

شکل2 - میزان ترکیبات فلاونوئیدی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از غلظت حلال و دمای استخراج

 

 

 

شکل 3–  تاثیر  میزان پودر آب پنیر بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه

 

 

 

شکل4 -  تاثیر  زمان بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه

 

معادله 2 رابطه بین میزان ترکیبات فلاونوئیدی را با میزان پودر آب پنیر، غلظت حلال، زمان و دما را نشان می‌دهد. R²مدل، R²-adjusted و R²- pridicted به ترتیب برابر با 5/99، 3/99 و 9/98 درصد و عدم تطابق آن غیر معنی‌دار می‌باشد.

 

Flavonoid = 50.1-0.62 * A + 11.33833 * B + 16.99396 * C + 1.691944 * D + 8.055 * B * C -2.60556*A²-4.10056*B²-4.86264*C²-3.04014 * D²

 

A = میزان پودر آب پنیر، B = غلظت حلال،C = دما، D = زمان

 

 

قدرت مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH

   بر اساس نتایج آماری به دست آمده مشاهده شد متغیرهای زمان و دما هم به صورت خطی و هم به صورت درجه دوم تاثیر معنی‌داری بر میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH داشتند، اما متغیرهای غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر تنها به صورت خطی اثر آنها معنی‌دار بود و در شکل درجه دوم اثر معنی‌دار نداشتند. اثر متقابل بین غلظت حلال و دما (شکل 5) معنی‌دار بود (01/0p<). با افزایش میزان پودر آب پنیر قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH سیر نزولی نشان داد (شکل 6). با افزایش زمان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH سیر صعودی نشان داد (شکل 7).

   بالاترین میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH (9/87%) در دمای 58 درجه سلسیوس و مدت زمان 30 دقیقه و با غلظت حلال 46%  و میزان پودر آب پنیر 20 گرم بدست آمد.

 

 

 

شکل 5- میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از غلظت حلال و دمای استخراج

 

شکل6- تاثیر  میزان پودر آب پنیر بر میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه

 

شکل7 - تاثیر  زمان بر میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه

 

   معادله 3 رابطه بین میزان قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH را با میزان پودر آب پنیر، غلظت حلال، زمان و دما را نشان می‌دهد. R²مدل، R²-adjusted و R²- pridicted به ترتیب برابر با 8/97، 1/97 و 8/94 درصد و عدم تطابق آن غیرمعنی‌دار می‌باشد.

 

 

DPPH=52.44938-2.18292*A+19.78458*B-6.02542*C+2.020417*D-2.40438*B*C-2.49398*C²+1.562266*D²

 

A = میزان پودر آب پنیر، B= غلظت حلال، C = دما، D = زمان

 

فعالیت ضد اکسایشی کل FRAP

   آنالیزهای آماری نشان داد که تمامی متغیرها (دما، زمان، غلظت حلال و میزان پودر آب پنیر) به صورت خطی بر میزان FRAP تاثیر معنی‌دار داشتند و در این بین میزان پودر آب پنیر و زمان به صورت درجه دوم نیز اثر معنی‌دار داشتند، ولی غلظت حلال و دما به صورت درجه دوم نیز اثر معنی‌دار نداشتند. اثر متقابل بین پودر آب پنیر و دما و هم چنین بین میزان پودر آب پنیر و غلظت حلال اثر معنی‌دار نشان داد. اثر متقابل بین سایر متغیرها اثر معنی‌دار نداشت. میزانFRAP در یک غلظت ثابت از پودر آب پنیر با افزایش دما کاهش و با افزایش غلظت حلال، افزایش می‌یابد (شکل 8 و 9). با افزایش زمان میزان FRAP سیر تدریجی صعودی نشان داد (شکل 10). فعالیت ضد اکسایشی کل FRAP بیشترین مقدار را برابر µmol/g 203 در زمان استخراج 30 دقیقه، دمای 58 درجه سلسیوس، غلظت حلال 46 و میزان پودر آب پنیر 20 گرم دارد و کمترین مقدار را برابر µmol/g 85 در زمان استخراج 28 دقیقه، دمای 61درجه سلسیوس، غلظت حلال 37 و میزان پودر آب پنیر 30 گرم دارد.

   معادله 4 رابطه بین فعالیت ضد اکسایشی کل  FRAP را با میزان پودر آب پنیر، غلظت حلال، زمان و دما را نشان می‌دهد. R²مدل، R²-adjusted و R²- pridicted به ترتیب برابر با 5/99، 3/99 و 9/98 درصد و عدم تطابق آن غیر معنی‌دار می‌باشد.

FRAP=161.5278-3.83333*A+35.65278*B-12.1667*C+3*D+2.375*A*B-2.125*A*C-1.91667*A²-6.79167*C²

A = میزان پودر آب پنیر، B = غلظت حلال، C = دما، D = زمان

 

شکل8-  میزان فعالیت ضد اکسایشی کل FRAP تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از میزان پودر آب پنیر و دمای استخراج

شکل9 - میزان فعالیت ضد اکسایشی کل FRAP تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه به عنوان تابعی از میزان پودر آب پنیر و غلظت حلال

 

شکل10- تاثیر  زمان بر میزان فعالیت ضداکسایشی کل FRAP تفاله انگور تخمیر شده با آسپرژیلوس اریزه

 

بحث و نتیجه‌گیری

   واریته‌های مختلف انگور منبع غنی از ترکیبات فنلی محسوب می‌شوند و حدود 75% این ترکیبات در پوست و دانه موجود می‌باشند (Sanchez-Alonso et al., 2008). ترکیبات فنلی به دلیل فعالیت‌های بیولوژیکی و ایفاء نقش آنتی‌اکسیدانی، حائز اهمیت می‌باشند. استخراج این ترکیبات عموما با استفاده از روش استخراج با حلال انجام می‌گیرد و غلظت حلال، زمان و دما مهم‌ترین پارامترها برای دستیابی به بالاترین میزان استخراج محسوب می‌شوند (Spingo et al., 2007). بهره‌گیری از تکنیک اولتراسوند تا میزان 30% باعث افزایش استخراج ترکیبات عملگرا در مقایسه با تکنیک سنتی استخراج با حلال می‌گردد (Cho et al., 2006) تخمیر توسط آسپرژیلوس اریزه به طور قابل توجهی باعث افزایش خواص آنتی‌اکسیدانی می‌گردد (Esaki et al., 2004) لوبیای سویای تخمیر شده توسط آسپرژیلوس اریزه در مقایسه با نوع غیرتخمیری دارای توان آنتی‌اکسیدانی بالاتری است (Wardhani et al., 2009).

   افزایش دما سبب افزایش ضریب نفوذ حلال و افزایش زمان نیز مدت زمان انتقال جرم را افزایش می‌دهد. هررا و همکاران (2005) بیان داشتند که افزایش زمان استخراج به طور معنی‌داری بر روی میزان استخراج ترکیبات فنولیک از توت آسیاب شده و تفاله انگور موثر بود، که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد. در مطالعات رویلا و همکاران (1998) تفاوت معنی‌داری (001/0p<) با افزایش زمان استخراج در میزان ترکیبات فنلی از پوست انگور به دست آمد. طبق گزارشات جونتاچوت و همکاران (2006) افزایش دما باعث افزایش نفوذ حلال به ماتریکس جامد و افزایش حلالیت ترکیبات فنلی در حلال می گردد. لوسیولا و همکاران (2012) بیشترین میزان ترکیبات فنلی از مربای انگور قرمز را در دمای 60 درجه سلسیوس، مدت زمان 25 دقیقه و با اتانول 50% استخراج کردند.

   نتایج نشان داد که بر هم کنش معنی‌داری بین دما و غلظت حلال وجود دارد. حسین و همکاران (2011) وجود چنین برهم کنش معنی‌داری را در رزماری، مرزنجوش و پونه کوهی گزارش کردند. کاشیف غفور و یونگ هی چوی (2009) در اندازه‌گیری میزان ترکیبات فنلی از انگور به این نتیجه رسیدند که افزایش غلظت اتانول باعث افزایش میزان استخراج ترکیبات فنلی می‌گردد، که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد. استفاده از آب به عنوان حلال استخراج، یک محیط کاملاً قطبی ایجاد می‌کند که در آن برخی از ترکیبات فنلی با درجه قطبیت پائین به میزان کمتری استخراج می‌شوند. افزودن آب به حلال‌های آلی با تشکیل یک محیط نسبتاً قطبی همراه بوده و بنابراین از استخراج مقادیر و انواع بیشتری از ترکیبات فنلی در این شرایط اطمینان حاصل می‌گردد.

   بسیاری از آنتی‌اکسیدان‌ها با غیرفعال کردن رادیکال‌های آزاد از اکسایش لیپیدها جلوگیری می‌کنند. با استفاده از یک سری روش‌های آزمایشگاهی می‌توان میزان غیر فعال شدن رادیکال‌های آزاد در حضور ترکیبات آنتی‌اکسیدانی اندازه‌گیری می‌شود (Wanasundara and Shahidi, 2005). در آزمون‌های DPPH و FRAP اگرچه مقدار ترکیبات فنولیک عصاره‌های حاصل در برخی از نمونه‌ها کمتر بود اما فعالیت آنتی‌اکسیدانی این عصاره‌ها بیشتر بود. این نتیجه نشان می‌دهد که نوع ترکیب فنولیک بیشتر از مقدار آن در فعالیت آنتی‌اکسیدانی نقش دارد. این نتایج با نتایج کارهای محققین دیگری از جمله رباباه و همکاران (2004) مطابقت دارد، این محققین گزارش کرده‌اند که فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های گیاهی می‌تواند تحت تاثیرساختارهای متفاوت اسیدهای فنولیک و فلاونوئیدها و همچنین مشتقات این ترکیبات باشد. به عنوان مثال، فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسیدهای فنولیک و مشتقات آن همانند استرها، وابسته به تعداد گروه‌های هیدروکسیل در مولکول است.

   محصولات مختلف تجاری آب پنیر از قبیل پودر آب پنیر، کنسانتره پروتئین‌های آب پنیر و ایزوله پروتئین‌های آب پنیر در دسترس هستند. این محصولات به طور عمده به عنوان اجزا تغذیه‌ای در غذای کودک و پروتئین مکمل برای ورزشکاران مورد استفاده قرار می‌گیرند (Bayram et al., 2008). خواص بیولوژیکی پروتئین‌های آب پنیر عبارتند از خواص آنتی‌اکسیدانی، ضد میکروبی و ... که ناشی از پپتیدها و اسیدهای آمینه خاصی است که به طور عمده از بتا لاکتوگلوبولین مشتق شده‌اند (Hernandez – Ledesma et al., 2008). بالاترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل در دمای حدود 58 درجه سلسیوس و میزان پودر آب پنیر حدود 25 گرم مشاهده شد. در یک غلظت ثابت از پودر آب پنیر با افزایش دما از میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل کاسته شد که احتمالا ناشی از اثرات تخریبی حرارت بر عوامل آنتی‌اکسیدانی پودر آب پنیر می‌باشد. بهره‌گیری از تخمیر تفاله انگور توسط آسپرژیلوس اریزه و استفاده از تکنیک اولتراسوند می‌تواند به عنوان روشی مناسب جهت استخراج مواد بیولوژیک از تفاله انگور با مزایایی از جمله میزان استخراج بالا، کاهش میزان حلال و دمای مورد نیاز و صرفه‌جویی مورد استفاده واقع گردد.

مراجع

 

• Bayram, T., Pekmez, M., Arda, N. and Yalcin, A.S. (2008). Antioxidant activity of whey protein fractions isolated by gel exclusion chromatography and protease treatment. Talanto, 75: 705-709.
• Benzie, F. and Strains, J.J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of Antioxidant Power: the FRAP assay. Analytical Biochemistry, 239: 70-76.
• Cho, Y.J., Hong, J.Y., Chun, H.S., Lee, S.K. and Min, H.Y. (2006). Ultrasonication-assisted extraction of resveratrol from grapes. Journal of Food Engineering, 77: 725-30.
• Esaki, H., Onozaki, H., Kawakishi, S. and Osawa, T. (1997). Antioxidant activity and isolation from soybeans fermented with Aspergillus spp. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 2020-2024.
• Esterbauer, H., Wag, G. and Puhl, H. (1993). Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin, 49: 566-567.
• FAOSTAT. (2005). FAO statistical database. <http://www.fao.org>.
• Gonzalez-Paramas, A.M., Esteban-Ruano, S., Santos-Buelga, C., Pascual-Teresa, S. and Rivas -Gonzalo, J. (2004). Flavanol content and antioxidant activity in winery byproducts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 234-238.
• Hernandez-Ledesma, B., Recio, I. and Amigo, L. (2008). β-Lactoglobulin as source of bioactive peptides. Amino Acids, 35: 257-265.
• Herrera, M.C. and Luqued de Castro, M.D. (2007). Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from strawberries prior to liquid chromatographic separation and photodiode array ultraviolet detection. Journal of chromatography A, 1100(1):1-7.
• Hossain, M.B., Barry-Ryan, C., Martin-Diana, A.B. and Brunton, N.P. (2011). Optimization of accelerated solvent extraction of antioxidant compounds from rosemary (RosmarinusofficinalisL.), marjoram (OriganummajoranaL.) and oregano (OriganumvulgareL.) using response surface methodology. Food Chemistry, 126: 339-346.
• Juntachote, T., Berghofer, E., Bauer, F. and Siebenhandl, S. (2006). The application of response surface methodology to the production of phenolic extracts of lemon grass, galangal, holy basil and rosemary. International journal of Food Science and Technology, 41: 121-133.
• Ghafoor, K. and Choi, Y.H. (2009). Optimization of ultrasound assisted extraction of phenolic compounds and antioxidants from grape peel through response surface methodology. Journal of koreansociety for Applied Biological Chemistry, 52: 295-300.
• Lee, J.C. and Lim, K.T. (2000). Effects of cactus and ginger extracts as dietary antioxidants on reactive oxidant and plasma lipid level. Food Science and Biotechnology, 9(2): 83–88.
• Morelli, L.L. and Prado, M.A. (2012). Extraction optimization for antioxidant phenolic compounds in red grape jam using ultrasound with a response surface methodology. Ultrasonics Sonochemistry, 19(6): 1144-1149.
• Madhavi, D.L., Deshpande, S.S. and Salunkhe, D.K. (1996). Food antioxidants, New York: Marcel Dekker, Inc, USA, pp. 738.
• Markesbery, W.R. and Lovell, M.A. (1998). Four-hydrononenal, a product of lipid peroxidation is increased in the brain in Alzheimer^,s disease. Neurobiology Aging of Disease, 19: 33-36.
• McDonald, S., Prenzler, P.D., Autolovich, M. and Robards, K. (2001). Phenolic content and antioxidant activity of olive extracts. Food Chemistry, 73: 73-84.
• Moktan, B., Saha, J. and Sarkar, P.K. (2008). Antioxidant activities of soybean as affected by Bacillus-fermentation to kinema. Food Research International, 41: 586–593.
• Mour, A., Sruz, G.M., Franco, D. and Dominguez, J. (2001). Natural antioxidant from residual sources. Food chemistry, 72: 145-171.
• Northup, R.R., Dahlgren, R.A. and McColl, J.G. (1998). Polyphenols as regulators of plant-litter-soil interactions in northern California’s pygmy forest: apositive feedback? Biogeochemistry, 42: 189–220.
• Rababah, T.M., Hettiarachchy, N.S. and Horax, R. (2004). Total phenolics and antioxidant activities of fenugreek, green tea,grape seed, ginger,rosmary, gotukola,and ginkgo extracts, vitamin E, and tert-butylhydroquinone. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 583-5186.
• Sanchez-Alonso, I., Jimenez-Escrig, A., Saura-Calixto, F. and Borderias, A.J. (2008). Antioxidant protection of white grape pomace on restructured fish products during frozen storage. LWT-Food Science and Technology, 41: 42-50.
• Spingo, G., Tramelli, L. and De-Faveri, DM. (2007). Effects of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marcephenolics. Journal of Food Engineering, 81: 200-208.
• Van Soest, P.J. (1994). Nutritional Ecology of the Ruminant (2^nd Edition). Cornell University Press, Ithaca, NY, USA.
• Wanasundara, PK. and Shahidi, F. (2005). Antioxidants: science, technology, and applications. In Bailey^,s industrial oil and fat products. Shahidi, F. (Eds). John Wiley and Sons, Inc. New Jersey.
• Wardhani, D.H., Vazquez, J.A. and Pandiella, S.S. (2009). Mathematical modeling of the development of antioxidant activity in soybeans fermented with Aspergillusoryzae and Aspergillusawamori in the solid state. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57: 540-544.
• X Hou, D. (2003). Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins. Current Molecular Medicine, 3: 149-159.