بررسی میزان باقی‌مانده نئومایسین در شیرهای پاستوریزه تولیدی در تعدادی از کارخانجات استان آذربایجان‌شرقی، ایران

بهداشت مواد غذایی

مقاله 5، دوره 4، 3 (15) پاییز، آذر 1393، صفحه 43-49   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

محمد حسین موثق^{* 1}؛ ، امیر رضا کرمی بناری²

¹استادیار گروه بهداشت مواد غذایی، واحد شبستر، دانشگاه آزاد اسلامی، شبستر، ایران

²استادیار گروه فارماکولوژی و سم شناسی، واحد شبستر، دانشگاه آزاد اسلامی، شبستر، ایران

چکیده

   با توجه به مخاطراتی که وجود باقی‌مانده‌های آنتی‌بیوتیک در شیر برای مصرف‌کننده دارد، ممکن است موجب عکس‌العمل‌های آلرژیک گردد. همچنین با ایجاد جمعیت‌های میکروبی مقاوم در داخل روده باعث کاهش تأثیر درمان‌های آنتی‌بیوتیکی می‌گردد. هدف از این مطالعه تعیین میزان آنتی‌بیوتیک نئومایسین در شیر پاستوریزه در استان آذربایجان‌شرقی بود. برای این منظور 200 نمونه شیر پاستوریزه تولیدی توسط پنج کارخانه در استان آذربایجان‌شرقی در طی دو فصل بهار و پاییز سال 1389 (100 نمونه در فصل بهار و 100 نمونه در فصل پاییز) به‌صورت تصادفی خوشه‌ای اخذ و ابتدا تست غربالگری از نظر وجود باقی‌مانده داروهای آنتی‌بیوتیکی توسط کیت کوپن انجام شد و سپس بر روی نمونه‌ها مثبت، تست الیزا برای ارزیابی میزان باقی‌مانده نئومایسین انجام شد. بر اساس نتایج این بررسی، باقی‌مانده نئومایسین در فصل بهار و پاییز به‌ترتیب در 9 و 13 نمونه مشاهده شد که دارای میانگین باقی‌مانده 10/8 ± 20/43 و 08/2 ± 63/26میکروگرم در لیتر بود. با در نظر گرفتن حد مجاز 1500 میکروگرم در لیتر باقی‌مانده نئومایسیندر شیر در ایران و به رغم مشاهده باقی‌مانده داروی فوق در تعدادی از شیرهای پاستوریزه، در هیچ‌یک از نمونه‌ها میزان باقی‌مانده بیش از حد مجاز در ایران برآورد نشد. با توجه به نتایج حاصله، به لزوم کنترل مستمر نمونه‌های شیر از نظر باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک توصیه می‌گردد.

کلیدواژه‌ها

شیر پاستوریزه؛ نئومایسین؛ الایزا؛ ایران

اصل مقاله

مقدمه

   حضور آنتی بیوتیک‌ها در شیر ماحصل درمان دام‌ها  با آنتی بیوتیک‌ها می‌باشد که کیفیت شیر را از نظر بهداشتی کاهش می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها قادر به ایجاد واکنش‌های آلرژیک در مصرف‌کنندگان هستند همچنین مصرف شیر حاوی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک می‌تواند باعث ایجاد مقاومت آنتی‌بیوتیکی در برخی از باکتری‌ها گردد که منجر به شکست درمان عفونت‌های باکتریایی می‌گردد (Rinken  and Riik, 2006). امروزه در سطح دنیا بیش از 4000 دارو به شکل تجاری در هر سال برای درمان انواع بیماری‌ها در انسان و حیوانات تولید می‌شود. بعنوان مثال 200000 تن آنتی‌بیوتیک در سال تولید می‌شود که این داروها بعد از تجویز در بدن انسان و حیوان متابولیزه می‌گردند و مواد متابولیزه وارد محیط‌های آبی می‌گردند و وارد چرخه غذایی انسان و حیوانات می‌گردند (and Webb, 1997 Adesiyun). به علاوه، وجود باقی‌مانده‌های آنتی‌بیوتیکی در شیر نه‌تنها مشکلات فراوانی را برای بهداشت انسان ایجاد می‌کند بلکه تهدید مهمی برای کیفیت فراورده‌های تخمیری شیر  نیز به شمار می‌رود ( کریم، 1380؛Kang'ethe et al., 2005 ).

  یکی از آنتی‎بیوتیک‌هایی که در درمان عفونت‌های دامی کاربرد دارد داروی نئومایسین می‌باشد. نئومایسین یک آنتی‌بیوتیک آمینوگلیکوزیدی می‌باشد که توسط باکتری استرپتومایسس فرادی (Streptomyces fradiae) تولید می‌شود. این دارو جزو آنتی بیوتیک‌های وسیع الطیف بوده و برای ممانعت از رشد باکتری‌های گرم مثبت نظیر استافیلوکوکوس آرئوس (Staphylococcusareus) و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (Mycobacterium tuberculosis) و باکتری‌های گرم منفی نظیر اشریشیا کلی (Escherichia coli)، آنتروباکتر آئروجنز (Enterobacter aerogenes)، کلبسیلا نومونیا (Klebsiella pneumoniae) و پروتئوس وولگاریس (Proteus vulgaris) مورد استفاده قرار می‌گیرد. نئومایسین با ایجاد اختلال در سنتزپروتئین در باکتری با اتصال به تحت واحد s30  اسید ریبونوکلئیک ریبوزومی از رشد باکتری ممانعت می‌نماید (Bilandzic et al., 2011).

   علیرغم کاربرد فراوان این دارو در درمان عفونت‌های باکتریایی، نئومایسین در انسان و حیوانات اتوتوکسیک و نفروتوکسیک می‌باشد و کنترل مواد غذایی از نظر حضور باقی‌مانده این دارو برای پیشگیری از عوارض فوق ضروری می‌باشد. به همین منظور اتحادیه اروپا حد بیشینه مجاز باقی‌مانده نئومایسین در بافت‌های خوراکی، چربی حیوانی، شیر و تخم‌مرغ تعیین نموده است. بطوریکه در گوشت، چربی، کبد و تخم‌مرغ 500 میکروگرم در هر کیلوگرم، در شیر 1500 میکروگرم در هر کیلوگرم و 5000 میکروگرم در هر کیلوگرم از کلیه می‌باشد (Bilandzic et al., 2011). البته در سال 1387 موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران بیشینه مجاز نئومایسین در شیر را 1500 میکروگرم در لیتر تعیین نموده است (موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران، 1387).

   متاسفانه در ایران دامداران زمان پرهیز از مصرف یا زمان بازداشتن از مصرف را در درمان دام‌ها با نئومایسین و سایر داروهای دامی رعایت نمی‌نمایند. زمان پرهیز از مصرف عبارت است از، دوره زمانی بین زمان آخرین مصرف یک دارو و زمان استحصال بافت یا فرآورده خوراکی از دام درمان شده که اطمینان دهد، میزان باقی‌مانده دارو در مواد خوراکی از بیشینه مجاز باقی‌مانده داروی دامی، بیشتر نباشد (موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران، 1387؛ Movassagh and Karamibonari, 2013).

   هدف از مطالعه کنونی تعیین میزان باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیرهای پاستوریزه تولیدی در استان آذربایجان شرقی بود که با توجه به جستجوی گروه تحقیق مطالعه مشابهی تاکنون در ایران انجام نگرفته است و این مطالعه اولین گزارش از میزان باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیرهای مصرفی در ایران می‌باشد.

 

 

مواد و روش‌ها

   در این مطالعه 200 نمونه شیر پاستوریزه تولیدی و توزیعی توسط پنج کارخانه در استان آذربایجان شرقی در طی دو فصل بهارو پائیز سال 1389 (100 نمونه در فصل بهار و 100 نمونه در فصل پاییز) بصورت تصادفی خوشه‌ای اخذ و ابتدا تست غربالگری از نظر وجود باقی‌مانده داروهای آنتی بیوتیکی توسط کیت کوپن انجام شد و سپس بر روی نمونه‌ها جهت تعیین وجود و میزان باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیر پاستوریزه تست الیزا انجام شد. نمونه‌ها بعد از اخذ، جهت بررسی وجود باقی‌مانده‌ آنتی‌بیوتیک به آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شبستر ارجاع شد. سپس بر روی نمونه‌ها آزمون جستجوی آنتی‌بیوتیک در شیر توسط تست شیر کوپنP&S, Denmark)  Copan Milk Test, Chr. hansen) انجام شد.

   کیت کوپن یک کیت آزمایشگاهی جهت پایش حضور آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر بصورت کیفی می‌باشد که از شرکت هانسن دانمارک تهیه گردید. لازم به ذکر است که کیت کوپن در برخی از کارخانجات تولید فرآورده‌های لبنی در ایران بصورت روزمره جهت حصول اطمینان از عدم وجود باقی‌مانده آنتی بیوتیک مورد استفاده قرار می‌گیرد. ابتدا 100 میکرولیتر از نمونه شیر را برداشته و داخل لوله‌ کیت ریخته و لوله را در  بن ماری 1±64 درجه سلسیوس به مدت 3 ساعت قرار داده و نتایج ثبت می‌گردید. در نمونه‌های حاوی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک تغییر رنگ محیط کشت مشاهده نمی‌شد و در نمونه‌های منفی رنگ زرد قابل رویت بود. حساسیت کیت کوپن به نوع و میزان آنتی‌بیوتیک‌های موجود در شیر در جدول 1 نشان داده شده است.

 

جدول 1- حساسیت کیت کوپن به نوع و میزان برخی
از آنتی‌بیوتیک‌های مهم موجود در شیر (دستورالعمل کیت کوپن)

آنتی بیوتیک	محدوده تشخیصی کیت کوپن*	بیشینه مقدار مجاز باقی‌مانده آنتی بیوتیک**
پنی سیلین	2-1	4
آمپی سیلین	2>	4
آموکسی سیلین	4-2	4
کلرتتراسایکلین	500-250	100
اکسی تتراسایکلین	500-250	100
تتراسایکلین	500-250	100
نئومایسین	2000-500	500
تایلوزین	100-50	50
تایلومیکوزین	100-75	50
داپسون	4-2	صفر
تری متو پریم	150-100	50
تیامفنیکول	100<	50
کلرامفنیکل	500<	-

^* کیت کوپن محدوده تشخیصی کیت (بر اساس ppb)

^** بیشینه مقدار مجاز باقی‌مانده آنتی بیوتیک‌های دامی در شیر گاو در اتحادیه اروپا (بر اساس ppb)

   جهت سنجش میزان باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیر از کیت الیزای اندازه‌گیری نئومایسینشرکتTecna  کشور ایتالیا استفاده شد. جهت انجام واکنش تشخیصی، ابتدا نمونه‌ها با ورتکس بطور کامل یکنواخت گردیده سپس به ترتیب مقدار 20 میکرولیتر از محلول‌های استاندارد آنتی‌بیوتیک مورد نظر (نئومایسین)، نمونه‌های مورد آزمایش و محلول رقیق کننده به چاهک‌های مربوطه اضافه گردید. سپس 100 میکرولیتر از محلول کونژوگه آنزیمی به هر چاهک افزوده شده و با تکان دادن میکروپلیت با حرکات چرخشی به مدت چند ثانیه کاملا مخلوط می‌گردید. میکروپلیت به مدت 20 دقیقه در درجه حرارت اتاق و به دور از نور در انکوباتور قرار داده شد. سپس ابتدا محتویات چاهک‌های میکرو پلیت تخلیه گردیده و بوسیله دستگاه شستشو دهنده اتوماتیک 3 بار چاهک‌ها شستشو داده شده، سپس قطرات باقی‌مانده در سطح داخلی چاهک‌ها بطور کامل با ضربه زدن میکروپلیت روی چند لایه دستمال کاغذی خشک، خارج گردید. در مرحله بعد مقدار 120 میکرولیتر از محلول توسعه (سوبسترا و کروموژن) به هریک از چاهک‌ها اضافه گردید. بعد از تکان دادن چرخشی، میکروپلیت به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سلسیوس و به دور از نور در انکوباتور قرار داده شده و در پایان این مرحله واکنش رنگی صورت گرفت که با افزودن محلول متوقف‌کننده به مقدار 50 میکرولیتر به هر یک از چاهک‌ها رنگ آبی به زرد تغییر یافت. پلیت‌ها با دستگاه قرائت الیزا در طول موج 450 نانومتر قرائت گردید.

   برای تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها از نرم افزار SPSS نسخه 14 استفاده گردید. بر روی داده‌ها آزمون مربع کای و آزمون T مستقل انجام گرفت.

یافته‌ها

از کل نمونه‌های اخذ گردیده باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک در  5/14% شیرهای پاستوریزه مشاهده گردید. البته نتایج آزمون با کیت کوپن به تفکیک فصل سال مشخص گردید. در فصل بهار 12 درصد و در فصل پاییز 17 درصد نمونه‌های شیر پاستوریزه حاوی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک بودند.

   با توجه به انجام آزمون مربع کای بر روی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک بر روی نمونه‌های شیر پاستوریزه در دو فصل بهار و پاییز، اختلاف معنی‌داری بین تعداد نمونه‌های حاوی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک در دو فصل بهار و پاییز مشاهده نگردید.

   از کل نمونه‌های شیر پاستوریزه اخذ شده در فصل بهار و پاییز به ترتیب در 9 و 13 نمونه باقی‌مانده نئومایسین مشاهده شد که میانگین باقی‌مانده نئومایسین به ترتیب 10/8±20/43 و 08/2±63/26 میکروگرم در لیتر  بود.

علیرغم اینکه باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیر پاستوریزه جمع‌آوری شده از استان آذربایجان شرقی مشاهده گردید ولی با توجه به انجام آزمون T مستقل، تفاوت معنی‌داری در میانگین باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیر پاستوریزه در دو فصل بهار و پاییز در نمونه‌ها مشاهده نگردید.

 

بحث و نتیجه‌گیری

   در مطالعه انجام گرفته باقی‌مانده آنتی‌بیوتک نئومایسین در شیر پاستوریزه جمع‌آوری شده مورد مطالعه مشاهده گردید. با توجه به حد مجاز باقی‌مانده نئومایسین (1500میکروگرم در لیتر) در شیر در ایران، علیرغم مشاهده باقی‌مانده داروهای فوق در شیر پاستوریزه در هیچکدام از نمونه‌ها میزان باقی‌مانده بیش از حد مجاز قابل قبول در ایران نبود. متاسفانه تاکنون مطالعه مشابهی در ایران بر روی باقی‌مانده نئومایسین در شیر انجام نگرفته است و مطالعه کنونی اولین گزارش در این مورد می‌باشد. در یک مطالعه توسط فلاح راد و همکاران در شهر مشهد  که بر روی میزان باقی‌مانده داروی جنتامایسین در شیر خام گاو و شیر پاستوریزه در ایران انجام گرفته است ، 68 نمونه شیر شامل 40 نمونه از شیر خام مخزن دامداری‌های اطراف شهر مشهد و 28 نمونه شیر پاستوریزه از شهر مشهد بوسیله کیت‌های جنتامایسین مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج نشان داد که 6 نمونه شیر خام و 2 نمونه شیر پاستوریزه  (76/11% از کل نمونه‌های شیر خام و پاستوریزه) آلوده به جنتامایسین بوده و 60 نمونه (24/88%) دارای باقی‌مانده جنتامایسین نبودند. در شیرهای آلوده، بالاترین غلظت آنتی‌بیوتیک 25/1 نانوگرم در میلی‌لیتر شیر بوده است (فلاح راد و همکاران، 1385). البته در مطالعه کنونی تفاوت معنی‌داری در باقی‌مانده داروی نئومایسین در شیرهای پاستوریزه در دو فصل بهار و پاییز سال 1389 مشاهده نگردید.

   در مطالعه‌ای که در سال 1388 در منطقه ایلخچی (جنوب غرب شهر تبریز) بر روی میزان باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک‌ها در شیر خام با استفاده از آزمون کوپن انجام گرفته است از 50 نمونه شیر خام گاو اخذ شده، باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک در 10% نمونه‌ها مشاهده گردید که در مطالعه کنونی مقادیر مشاهده شده بیش از یافته‌های قبلی می‎باشد (موثق، 1391).

   در مطالعه‌ای که در طی سه سال از سال 2008 الی 2010 در کشور کرواسی بر روی باقی‌مانده داروی نئومایسین در 1259 نمونه شیر خام گاو انجام گرفته است میانگین میزان باقی‌مانده نئومایسین به ترتیب در سال 2008، 6/328 نانوگرم در هر میلی‌لیتر و در سال 2009، 6/119 نانوگرم در هر میلی‌لیتر بود و در سال 2010 در هیچکدام از نمونه‌ها باقی‌مانده داروی نئومایسین مشاهده نگردید (Jin et al., 2006). با توجه به نتایج مطالعه کنونی میانگین مقادیر باقی‌مانده داروی نئومایسین در نمونه‌های اخذ شده در استان آذربایجان شرقی بسیار کمتر از مقادیر مشاهده شده در کشور کرواسی در سال های 2008 و 2009 بود. البته لازم به ذکر است که در نمونه‌های شیر پاستوریزه به علت مخلوط شدن شیر حاوی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک با شیرهای فاقد باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک، میزان باقی‌مانده دارویی کمتر از نمونه‌های شیر خامی خواهد بود که به صورت انفرادی مورد بررسی قرار گرفته است.

   بطور کلی به نظر می‌رسد که عدم اعمال قانون پرهیز از مصرف در فرآورده‌های دامی متعاقب مصرف داروهای دامی منجر به مشاهده بقایای داروهای دامی در شیرهای استحصالی از استان آذربایجان شرقی باشد.

   با توجه به نتایج این تحقیق به نظر می‌رسد که شیرهای پاستوریزه در کارخانجات صنایع لبنی از نظر میزان باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک به خوبی کنترل نمی‌شوند. روش‌های متفاوت بکار گرفته شده توسط پژوهشگران مختلف جهت اندازه‌گیری میزان بقایای مواد آنتی‌بیوتیکی در غذاها می‌تواند روی نتایج بدست آمده اثر داشته باشد. بین روش‌های ذکر شده روش الیزا  به دلیل سرعت اندازه‌گیری، حساسیت بالا، راحتی اندازه‌گیری و مقرون به صرفه بودن آن کاربرد زیادتری دارد (فلاح راد و همکاران، 1385). البته استفاده از تست‌های غربالگری جهت کنترل وجود باقی‌مانده داروهای آنتی‌بیوتیکی در شیر رواج دارد ولی همواره موارد مثبت کاذب در نتایج چنین تست‌هایی وجود دارد که استفاده از روش الیزا دقت تشخیص وجود باقی‌مانده دارویی را افزایش خواهد داد (Jones and Seymour, 1988; Seymour et al., 1988).

   با توجه به نتایج حاصله، بطور کلی به نظر می‌رسد که میزان باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک در شیرهای مصرفی در استان آذربایجان شرقی بایستی بصورت مستمر کنترل گردد. البته وجود بقایای آنتی‌بیوتیکی در شیر باعث ایجاد اختلال در تولید فرآورده‌های تخمیری شیر نیز خواهد شد. با توجه به مشاهده اختلاف فصلی مقادیر باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک‌ها به نظر می‌رسد که کنترل‌های فصلی در پیشگیری از مصرف شیرهای حاوی باقی‌مانده دارویی موثر خواهد بود و باید در مصرف داروهایی نظیر نئومایسین از زیاده‌روی پرهیز گردد و مدت زمان پرهیز از مصرف در شیر دام‌های درمان شده با داروهای فوق به دقت رعایت گردد. همچنین به نظر می‌رسد که در تمام کارخانجات شیر پاستوریزه کنترل دقیق بر روی باقی‌مانده داروهای آنتی‌بیوتیک انجام نمی‌گیرد. لذا فعال نمودن تمام ظرفیت‌های تحقیقاتی دانشگاهی داخل کشور جهت طراحی و ساخت کیت‌های مناسب غربالگری باقی‌مانده انواع داروهای دامی در شیر و سایر فرآورده‌های آن می‌تواند باعث کاهش هزینه تشخیص وجود باقی‌مانده داروهای دامی در شیر گردد و از طرف دیگر به افزایش سطح سلامت مصرف‌کنندگان چنین فرآورده‌هایی کمک نماید.

مراجع

• ·   فلاح راد، امیر هوشنگ؛ محسن‌زاده، محمد و اسدپور، حمیدرضا (1385). تعیین میزان باقی‌مانده جنتامایسین در شیر خام تحویلی به کارخانه شیر پاستوریزه مشهد و شیر پاستوریزه حاصل از همان شیر خام، مجله علوم و صنایع کشاورزی، (7)20، 189-183.
• ·   کریم، گیتی (1380)، شیر و کیفیت آن، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ اول، صفحات: 186-165.
• ·   موثق، محمد حسین (1391). شناسایی باقی‌مانده آنتی‌بیوتیک در شیر خام گاو در منطقه ایلخچی (جنوب غرب تبریز) در بهار سال 1388، مجله علوم غذایی و تغذیه، (9) 3: 94-89.
• ·   موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران (1387). بیشینه مقدار مجاز باقی‌مانده داروهای دامی در مواد غذایی، چاپ اول، شماره 11101.

 

• Adesiyun, A.A. and Webb, L.A. (1997). Prevalence of antimicrobial residues in preprocessed and processed cow's milk in Trinidad, Journal of Food Safety, 16: 301-310.
• Bilandzic, N., Kolanovic, B.S., Varenina, I., Scortichini, G., Annunziata, L., Brstilo, M., et al. (2011). Veterinary drug residues determination in raw milk in Croatia, Food Control, 22: 1941-1948.
• Jin, Y., Jang, J.W., Lee, M.H. and Han, C.H. (2006). Development of ELISA and immunochromatographic assay for the detection of neomycin, Clinica. Chimica. Acta, 364: 260-266.
• Jones, G.M. and Seymour, E.H. (1988). Cowside antibiotic residue testing, Journal of Dairy Science, 71: 1691-1699.
• Kang'ethe, E.K., Aboge, G.O., Arimi, S.M., Kanja, L.W., Omore, A.O. and McDermott, J.J. (2005). Investigation of the risk of consuming marketed milk with antimicrobial residues in Kenya, Food Control, 16: 349-355.
• Movassagh, M.H. and Karamibonari, A.R. (2013). Tetracycline residues in raw cow's milk, pasteurized and UHT milk in Tabriz (northwest region of Iran), Online Journal of Veterinary Research, 17(10): 535-539.
• Rinken, T. and Riik, H. (2006). Determination of antibiotic residues and their interaction in milk with lactate biosensor, Journal of Biochemistry and Biophysics Methods, 66: 13-21.
• Seymour, E.H., Jones, G.M. and McGillard, M.L. (1988). Comparison of non-farm screening tests for detection of antibiotic residues, Journal of Dairy Science, 71: 2292-2296.