مطالعه اثرات محافظتی رزوراترول بر انفارکتوس تجربی میوکارد ایجاد شده توسط ایزوپروترنول در موش صحرایی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 2، دوره 8، 3 (31) پاییز، آذر 1393، صفحه 537-548   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

داریوش مهاجری^{* 1}؛ علیرضا منادی²؛ غفور موسوی³؛ امیرپرویز رضایی صابر³

¹استاد گروه آموزشی پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

²دانشیار گروه آموزشی پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

³استادیار گروه آموزشی علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

چکیده

   انفارکتوس میوکارد که خصوصیات مکانیکی، الکتریکی، ساختاری و بیوشیمیایی سیستم قلب را تحت تاثیر قرار می­دهد، یکی از دلایل مرگ و میر در کشورهای توسعه یافته به­شمار می­رود. هدف این مطالعه ارزیابی اثرات محافظتی رزوراترول در برابر انفارکتوس حاد میوکارد ایجاد شده توسط ایزوپروترنول در موش صحرایی می­باشد. بدین منظور، تعداد 40 سر موش صحرایی نر ویستار به­طور تصادفی به چهار گروه برابر شامل: 1-گروه شاهد، 2- تیمار با رزوراترول، 3- تیمار با ایزوپروترنول و 4- تیمار با ایزوپروترنول به‌علاوه رزوراترول تقسیم شدند. ایزوپروترنول (mg/kg85) در دو روز متوالی به فاصله 24 ساعت به طور زیرجلدی و رزوراترول (mg/kg 20) به طور داخل صفاقی به ‌مدت 30 روز متوالی تزریق شد. در پایان، نمونه خون جهت اندازه­گیری بیومارکرهای قلب شامل کراتین کیناز-MBو لاکتات دهیدروژناز اخذ شد. سپس همه موش­ها جهت آسیب­شناسی بافتی و تعیین وضعیت آنتی­اکسیدانی عضله قلب، با سنجش میزان مالون­دی­آلدئید و فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز آسان­کُشی شدند. در مشاهدات ریزبینی، عضله قلب گروه تیمار با ایزوپروترنول دچار تغییرات شدید دژنراتیو و نکروز شده بود، در حالی­که رزوراترول آسیب نکروتیک قلب را کاهش داد. مقادیر سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز قلب در گروه تیمار با ایزوپروترنول به­طور معنی­داری (01/0>p) کاهش یافت ولی در گروه تیمار با رزوراترول به­علاوه ایزوپروترنول به­طور معنی­داری (05/0>p) افزایش یافت. رزوراترول مقدار مالون­دی­آلدئید را که در اثر تیمار با ایزوپروترنول افزایش یافته بود، به­طور معنی­داری (05/0>p) کاهش داد. نتایج نشان داد رزوراترول با خواص آنتی­اکسیدانی خود قلب موش­های صحرایی را از آسیب ایسکمیک ناشی از ایزوپروترنول محافظت می­کند.

کلیدواژه‌ها

ایزوپروترنول؛ انفارکتوس قلب؛ رزوراترول؛ موش صحرایی

اصل مقاله

مقدمه

   سکته­های قلبی و عواقب ناشی از آن یکی از دلایل مرگ و میر در کشورهای توسعه یافته به شمار می­رود (Levy and Feinleib, 1984). انفارکتوس میوکارد پدیده پیچیده­ای است که خصوصیات مکانیکی، الکتریکی، ساختاری و بیوشیمیایی سیستم قلب را تحت تاثیر قرار می­دهد (Petrich et al., 1996). انفارکتوس میوکارد موقعی رخ می­دهد که نکروز عضله قلب به دلیل عدم تعادل طولانی مدت بین اکسیژن­رسانی و میزان تقاضای عضله قلب برای اکسیژن رخ دهد (Lopez and Murray, 1998).  در میان مکانیسم­های مختلف، تجمع رادیکال­های آزاد در پاتوفیزیولوژی انفارکتوس حاد میوکارد موثر قلمداد شده ­است (Zhou et al., 2008). ایزوپروترنول (Isoproterenol) یک آگونیست بتا-آدرنوسپتور است که با ایجاد عدم تعادل بین اکسیدان­ها و آنتی­اکسیدان­ها در میوکارد باعث سکته قلبی می­شود (Rajadurai and Prince, 2006; Rathore et al., 1998). درمان­های رایج برای انفارکتوس میوکارد شامل استفاده از مهار کننده­های آنژیوتانسین کانورتینگ آنزیم (Angiotensin Converting Enzyme, ACE)، آنتاگونیست­های گیرنده بتا-آدرنرژیک و عوامل ضد پلاکتی می­باشد. به هر حال، با توجه به میزان مرگ و میر بالا در پی انفارکتوس قلب، عوامل موجود و در دسترس برای دارودرمانی این عارضه و کنترل تلفات ناشی از آن کافی به نظر نمی­رسد. از سوی دیگر، مواد بیولوژیک شاخه‌ای از فارماکوتراپی مدرن بیماری‌ها را تشکیل می‌دهند. اگر چه عوامل دارویی متنوعی برای درمان انواع بیماری‌ها وجود دارد، لکن اغلب بیماران قادر به تحمل اثرات جانبی داروهای شیمیایی نیستند و از سوی دیگر اکثر مواد بیولوژیک با منشا طبیعی اثرات جانبی بسیار اندکی روی بیماران به جای می‌گذارند. بنابراین استفاده از درمان­های جدید و تکمیلی برای درمان سکته­های قلبی و کنترل عوارض از آن به خصوص در کشورهای پیشرفته مورد بحث می­باشد (Nandave et al., 2007). آنتی­اکسیدان­های متعددی برای ارزیابی اثرات محافظتی احتمالی آنها در برابر انفارکتوس حاد میوکارد مورد آزمایش قرار گرفته­اند (Buttros et al., 2009; Suchalatha and Shyamala, 2004). آنتی­اکسیدان­ها تشکیل گونه­های فعال اکسیژن را کاهش داده و بدینوسیله باعث محافظت از میوسیت­ها می­شوند (Peer et al., 2008).

   رزوراترول (3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene) یک فیتوآلکسین طبیعی است (Jeandet et al., 1991; Oktem et al.2010) که حداقل در 27 گونه گیاهی یافت می­شود (Jeandet et al., 1991). تحقیقات نشان داده است که رزوراترول دارای اثرات ضد التهابی، آنتی‌اکسیدانی و ضد دیابتی می­باشد (Su et al., 2006; Collodel et al., 2011). نشان داده شده است که اثرات کاهش در پراکسیداسیون لیپیدی رزوراترول بسیار قوی­تر از سایر فنول­ها نظیر اپی‌کاتچین (epicatechin)، کاتچین (catechin) و کوئرستین (quercetin) می­باشد (Shingai et al., 2011). همچنین نشان داده شده است که رزوراترول آسیب DNA را توسط پاکسازی رادیکال­های هیدروکسیل کاهش می­دهد. در مطالعه­ دیگری مشخص شده است که رزوراترول آپوپتوز سلو­های زایای بیضه را به­طور معنی­داری کاهش می­دهد (Uguralp etal., 2005).

   با توجه به اثرات آنتی­اکسیدانی رزوراترول، گمان می‌رود این ماده بتواند بافت عضله قلب در انفارکتوس ایجاد شده در اثر رزوراترول محافظت کند. در هر صورت با توجه به بررسی منابع، مطالعه‌ای در رابطه با اثرات محافظتی رزوراترول در برابر انفارکتوس میوکارد ایجاد شده در اثر رزوراترول در موش صحرایی وجود ندارد. بنابراین، تحقیق حاضر برای اولین بار جهت ارزیابی اثرات محافظتی رزوراترول در برابر انفارکتوس حاد میوکارد ایجاد شده در اثر رزوراترول در موش صحرایی طراحی گردید.

 

مواد و روش­ها

   مطالعه حاضر از نوع تجربی آزمایشگاهی بوده و در سال 1393 در مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز انجام شد. در این مطالعه کلیه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار روی حیوانات آزمایشگاهی مورد تائید کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی بود.

   برای انجام این مطالعه،  از تعداد 40 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 25±200 گرم و در محدوده سنی 7-6 هفته استفاده شد. شرایط تغذیه و نگه­داری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 2±21 درجه سلسیوس بود. جیره غذایی یکسان و آب نیز به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفته و پس از یک هفته عادت به شرایط جدید، آزمایش شروع شد. همه تیمارها بین ساعات 1 تا 6 بعد از ظهر اجرا شد.

موش‌ها به‌طور تصادفی به 4 گروه مساوی تقسیم شدند.

   گروه اول (Control) به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و نرمال سالین را به میزان ml/kg 10 به شکل داخل صفاقی به مدت 30 روز دریافت کرد.  گروه دوم (RES) رزوراترول  (Sigma Chemicals, St Louis, US) را به میزان mg/kg 20 در ml/kg 10 نرمال سالین به شکل تزریق داخل صفاقی و به ‌مدت 30 روز دریافت کرد (Yulug et al., 2013). گروه سوم (ISO) ایزوپروترنول (Sigma Chemicals, St Louis, US) را در دو روز اول (روزهای 1 و 2 مطالعه) به فاصله 24 ساعت با تزریق زیرجلدی با دز mg/kg 85 و نرمال سالین (ml/kg 10) را از راه داخل صفاقی به مدت 30 روز دریافت کرد (Li et al., 2006). گروه چهارم (RES+ISO) ایزوپروترنول (mg/kg 85) را به فاصله 24 ساعت در روزهای 1 و 2 از راه تزریق زیرجلدی و رزوراترول (mg/kg 20) را به ‌مدت 30 روز از راه داخل صفاقی دریافت کرد.

24 ساعت پس از آخرین تیمار موش­ها وزن­کشی شده و نمونه خون جهت ارزیابی بیومارکرهای قلب شامل کراتین کیناز-MB (CK-MB) و لاکتات دهیدروژناز از سینوس پشت کره چشم (Retro-orbital plexus) اخذ گردید. نمونه‌های خون با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و اندازه­گیری مارکرها به روش اسپکتروفتومتری با استفاده از کیت­های تجارتی (Randox Laboratories Ltd, UK) انجام شد.

   سپس همه موش‌‌ها هم‌زمان با ایجاد دررفتگی در مهره‌های گردن (‍Cervical dislocation) به راحتی کشته شدند. قلب موش­ها جدا و وزن آنها اندازه­گرفته شد. برای تعیین وضعیت آنتی­اکسیدانی، قسمتی از عضله قلب سریعاً جدا و در سالین بسیار سرد شستشو و هموژنات 10%  در 15/1% (w/v) کلرور پتاسیم تهیه شد. هموژنات با سرعت 7000 دور در دقیقه و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شده و محلول رویی جهت سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی  از طریق اندازه­گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید (MDA malondialdehyde;) و همچنین برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سوپراکسید دیسموتازSOD)  superoxide dismutase;)، کاتالاز (‍‍CAT catalase;) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX glutathione peroxidase;) مورد استفاده قرار گرفت.

   فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مورد مطالعه و میزان MDA با استفاده از کیت­های تجاری موجود  (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) و طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده کیت انجام شد. مقدار MDA بافتی به صورت نانومول مالون­دی­آلدئید (nmol) در میلی­گرم پروتئین و فعالیت آنتی­اکسیدانی به صورت واحدهای قراردادی در میلی­گرم پروتئین عنوان گردید.

   پراکسیداسیون چربی در عضله قلب با روش رنگ سنجی (colorimetrically) به وسیله اندازه­گیری TBARS (thiobarbituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران (1988) انجام شد (Fraga et al., 1988).

به‌طور خلاصه: 1/0 میلی لیتر هموژنات بافتی با 2 میلی‌لیتر معرف(Thiobarbituric acid)TBA-( trichloroacetic acid)TCA-Hcl   (37% TBA، 25/0 مول HCL و 15% TCA، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از 15 دقیقه  قرارگیری در بن ماری جوش، خنک گردید و در g 3500 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب محلول رویی شفاف در nm 535 در مقابل بلانک اندازه­گیری گردید. مقادیر به صورت نانومول بر100 گرم بافت بیان شدند.

فعالیت سوپراکسید دیسموتاز توسط روش نیشیکیمی  و همکاران تعیین گردید (Nishikimi et al., 1972). در حدود 5 میکروگرم از پروتئین­های تام هر یک از هموژنات­های قلب با بافر پیروفسفات سدیم، فنازین متوسولفات (PMT phenazine methosulfate;) و نیترو-بلو تترازولیوم (Nitro-blue Tertazolium; NBT) مخلوط گردید. واکنش با افزودن نیکوتین‌آمید‌آدنین دی­نوکلئوتید (Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADH) آغاز شد. مخلوط واکنش در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 90 ثانیه انکوبه و با افزودن 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال متوقف گردید. شدت جذب مخلوط رنگزای تشکیل شده در nm560 اندازه­گیری شد. هر واحد از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا 50 درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین گردید.

فعالیت کاتالاز توسط روش کلایبورن و بر اساس تجزیه پراکسید هیدروژن در nm240، مورد سنجش قرار گرفت (Claiborne 1985). به طور خلاصه، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلی لیتر بافر فسفات (7M, pH=  05/0)، 1 میلی لیتر پرکسید هیدروژن (M 019/0) و 05/0 میلی لیتر PMS (10%) در حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. تغییرات در جذب، در nm240 اندازه‌گیری شد. در نهایت نتیجه به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه گردید.

   فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز با استفاده از روش روتروک و همکاران  (Rotruck et al., 1973) و بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت.

H2O2 + 2GSH (گلوتاتیون احیاء) → 2H2O + GSSG(گلوتاتیون اکسید)

گلوتاتیون پراکسیداز، در هموژنات بافتی، گلوتاتیون را اکسیده کرده که به طور هم زمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء می­گردد. این واکنش پس از 10 دقیقه توسط تری‌کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقیمانده توسط محلول دی‌تیوبیس نیتروبنزوئیک اسید (Dithiobis nitrobenzoic acid; DTNB) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی می­گردد که با اسپکتروفتومتر در nm420 اندازه­گیری می­شود. مخلوط واکنش­گر متشکل از 2/0 میلی‌لیتر اتیلن دی‌آمین تترا-استیک اسید (ethylenediamine tetra-acetic acid; EDTA) mM8/0، 1/0 میلی­لیتر آزید سدیم (sodium azide) mM10، 1/0 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن mM5/2 و 2/0 میلی­لیتر هموژنات بود که در 37 درجه ‌سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. واکنش با افزودن 5/0 میلی لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لوله­ها با 2000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. 3 میلی لیتر دی سدیم هیدروژن mM 8/0 و 1/0 میلی‌لیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شد و بلافاصله رنگ حاصله در nm420 اندازه­گیری شد. فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میلی گرم پروتئین/دقیقه/میکرومول گلوتاتیون اکسید بیان گردید.

   آسیب­شناسی بافتی قلب موش­های مورد آزمایش با رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین انجام شد. قسمتی از بافت قلب موش‌ها در فرمالین بافری 10 درصد پایدار شد و از نمونه‌های پایدار شده در فرمالین با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقاطع هیستولوژی، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و رنگ آمیزی معمول هماتوکسیلین- ائوزین تهیه شد. مشاهدات میکروسکوپی با بزرگنمایی 100×  و در 5 میدان میکروسکوپی از هر برش، به‌طور تصادفی با میکروسکوپ نوری مدل Nikon (ECLIPSE E200، ساخت کشور ژاپن) انجام شد.

تحلیل آماری داده­ها

   برای تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار SPSS-17 استفاده شد. داده‌های به‌دست آمده کمّی، به صورت میانگین±انحراف معیار (mean±SD) ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون آماری آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی (tukey) مورد بررسی قرار گرفت. در مورد داده‌های هیستوپاتولوژی برای مقایسه نتایج‌ درجه‌‌بندی شده آسیب بافت قلب اختلاف معنی‌داری توسط آزمون ناپارامتری کروسکال والیس (kruskal-wallis) و سپس آزمون یو من-ویتنی (mann-whitney u test) برای ارزیابی مقایسه‌ای دو به دو، مورد استفاده قرار گرفت. اختلافات در سطح 05/0p< معنی‌دار تلقی شدند.

 

 یافته­ها

   تاثیر ایزوپروترنول و رزوراترول بر وزن بدن و وزن قلب موش­های صحرایی مورد مطالعه در جدول 1 نشان داده شده است. اختلاف معنی­داری از لحاظ وزن بدن بین گروه­های مورد مطالعه وجود نداشت، هرچند که کاهش اندک و غیرمعنی­دار در وزن  بدن موش­های گروه تیمار با ایزوپروترنول مشاهده شد.

   تیمار با ایزوپروترنول به­طور معنی­داری وزن قلب موش­ها را در مقایسه با گرو­ه­های شاهد و تیمار با رزوراترول افزایش داد (01/0p<). در گروه تیمار با ایزوپروترنول به­علاوه رزوراترول، رزوراترول وزن قلب موش­ها را در مقایسه با گروه تیمار با ایزوپروترنول به‌طور معنی­داری کاهش داد (05/0p<).

 

 

 

 

جدول 1- تاثیر رزوراترول بر وزن بدن و وزن قلب در موش­های صحرایی مورد مطالعه

گروه­ها	وزن بدن (gr)	وزن قلب (gr)
گروه شاهد	95/8±92/208	024/0±283/0
گروه تیمار با رزوراترول	86/10±48/212	027/0±287/0
گروه تیمار با ایزوپروترنول	42/6±73/201	a038/0±418/0
گروه تیمار با ایزوپروترنول به­علاوه رزوراترول	32/8±54/206	b028/0±311/0

                             مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف معیار برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

a                                     : دارای اختلاف معنی­دار در مقایسه با گروه شاهد (01/0p<).

b                                     : دارای اختلاف معنی­دار در مقایسه با گروه تیمار با ایزوپروترنول (05/0p<).

 

 

   تاثیر ایزوپروترنول و رزوراترول بر آنزیم­های مارکر سرمی قلب موش­های صحرایی مورد مطالعه در جدول 2 نشان داده شده است. در گروه تیمار با ایزوپروترنول افزایش معنی­داری در مقادیر سرمی کراتین کیناز-MB (creatine kinase-MB) و لاکتات دهیدروژناز (LDH) در مقایسه با گروه شاهد ایجاد شد (01/0p<)، در حالی که تیمار با رزوراترول مقادیر افزایش یافته مارکرهای سرمی مذکور را به­طور معنی­داری کاهش داد (01/0p<).

 

 

جدول 2- تاثیر رزوراترول بر آنزیم­های مارکر سرمی قلب در موش­های صحرایی مورد مطالعه

گروه­ها	لاکتات دهیدروژناز (IU/L)	کراتین کیناز-MB (IU/L)
گروه شاهد	76/33±53/258	64/5±92/85
گروه تیمار با رزوراترول	45/36±62/271	15/6±46/87
گروه تیمار با ایزوپروترنول	a72/67±42/613	a14/22±35/242
گروه تیمار با ایزوپروترنول به­علاوه رزوراترول	b63/58±75/491	b79/15±22/154

                                  مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف معیار برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.

a                                            : دارای اختلاف معنی­دار در مقایسه با گروه شاهد (01/0p<).

b                                            : دارای اختلاف معنی­دار در مقایسه با گروه تیمار با ایزوپروترنول (05/0p<).

 

  

 

فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی SOD، CAT و GPx  و MDA در جدول 3 نشان داده شده است. فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی SOD، CAT و GPx در بافت قلب موش­های صحرایی گروه تیمار با ایزوپروترنول کاهش معنی­داری در مقایسه با گروه شاهد داشت (01/0p<). علاوه بر این، افزایش معنی­داری در سطح MDA، به­عنوان شاخص استرس اکسیداتیو، در بافت قلب موش­های صحرایی گروه تیمار با ایزوپروترنول مشاهده شد (01/0p<). موش­های صحرایی گروه تیمار با رزوراترول که تنها رزوراترول را دریافت کرده بودند، تغییر قابل توجهی در فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی قلب نشان ندادند. در گروه تیمار با ایزوپروترنول به‌علاوه رزوراترول، درمان با رزوراترول افزایش معنی‌داری را در فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی SOD، CAT و GPx در مقایسه با گروه تیمار با ایزوپروترنول ایجاد کرد (05/0p<). همچنین در این گروه، درمان با رزوراترول باعث افزایش معنی­دار میزان MDA در بافت قلب موش­های صحرایی در مقایسه با گروه تیمار با ایزوپروترنول شد (05/0p<).

 

 

جدول 3- تاثیر رزوراترول بر آنتی­اکسیدان­های قلب در موش­های صحرایی مورد مطالعه

گروه­ها	مالون­دی­آلدئید  (nmol/mg protein)	سوپراکسید دیسموتاز  (U/mg protein)	کاتالاز (μmol of H2O2 consumed/mg protein)	گلوتاتیون پراکسیداز (μmol of glutathione oxidized/mg protein)
گروه شاهد	31/1±97/6	82/0±72/8	74/0±37/16	12/0±30/2
گروه تیمار با رزوراترول	27/1±88/6	79/0±64/8	82/0±74/15	15/0±41/2
گروه تیمار با ایزوپروترنول	a10/2±16/11	a53/0±21/5	a52/0±13/10	a11/0±85/1
گروه تیمار با ایزوپروترنول به‌علاوه رزوراترول	b85/1±12/8	b67/0±14/7	b69/0±68/13	b19/0±14/2

مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف معیار برای 10 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.  

a: دارای اختلاف معنی­دار در مقایسه با گروه شاهد (01/0p<).

b: دارای اختلاف معنی­دار در مقایسه با گروه تیمار با ایزوپروترنول (05/0p<).

 

 

   در آسیب‌شناسی بافتی همان­طوری­که در شکل 1 نشان داده شده است، ساختار بافتی قلب در موش­های صحرایی گروه شاهد طبیعی و سالم بود. تغییر پاتولوژی خاصی نیز در بافت قلب موش­های صحرایی گروه تیمار با رزوراترول، مشاهده نشد به­طوری­که، ساختار بافتی قلب در این گروه، شبیه گروه شاهد کاملاً طبیعی به نظر می­رسید (شکل 2). در بافت قلب موش­های صحرایی گروه تیمار با ایزوپروترنول، تغییرات دژنراتیو و نکروز تارهای عضلانی قلب، ارتشاح سلول­های آماسی، نشت گلبول­های قرمز خون و ادم بینابینی مشاهده شد (شکل 3). در گروه تیمار با ایزوپروترنول به‌علاوه رزوراترول، درمان با رزوراترول، به­طور قابل توجهی باعث کاهش تغییرات پاتولوزیک از جمله نکروز و ارتشاح لکوسیت­ها در بافت عضله قلب موش­های صحرایی شد و تنها آسیب قابل مشاهده، حضور ادم بینابینی ملایم و واکوئولاسیون میوسیت­ها به­خصوص در نواحی آندوکارد بود (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- نمای ریزبینی از بافت قلب یک موش صحرایی از گروه‌ شاهد: بافت قلب سالم و بدون تغییر پاتولوژیک است (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-‌ائوزین، درشتنمایی 40×).

 

 

 

 شکل 2- نمای ریزبینی از بافت قلب یک موش صحرایی از گروه‌ تیمار با رزوراترول: تغییر پاتولوژی خاصی در بافت قلب مشاهده نمی‌شود (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 40×).

 

 

 

شکل 3- نمای ریزبینی از بافت قلب یک موش صحرایی از گروه تیمار با ایزوپروترنول: تغییرات دژنراتیو و نکروز تارهای عضلانی قلب، ارتشاح سلول‌های آماسی، نشت گلبول­های قرمز خون و ادم بینابینی مشاهده می­شود (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 100×).

 

شکل 4- نمای ریزبینی از بافت قلب یک موش صحرایی از گروه تیمار با ایزوپروترنول به­علاوه رزوراترول: ادم بینابینی و واکوئولاسیون میوسیت­ها قابل مشاهده است (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشتنمایی 40×).

 

بحث و نتیجه­گیری

   ایسکمی ناشی از ایزوپروترنول در حیوانات آزمایشگاهی نیز همانند انسان می­تواند به اختلالات متابولیک و مورفولوژیک متعددی منجر شود (Karthick et al., 2006). در مطالعه حاضر، متعاقب تیمار با ایزوپروترنول، وزن قلب به ­طور معنی­داری افزایش پیدا کرد در حالی که تغییری در وزن بدن حاصل نشد. افزایش مشاهده شده در وزن بدن ممکن است مربوط به تغییرات ادماتوز و آماسی در فضاهای میان­بافتی عضله قلب باشد (Upaganlawar et al., 2009). مشخص شده است که یک درصد افزایش در محتوای مایعات میان­بافتی قلب می­تواند منجر به کاهش ده درصدی عملکرد عضله قلب شود (Laine and Allen, 1991). درمان با رزوراترول مانع از افزایش وزن قلب ناشی از ایزوپروترنول شد که این می­تواند به­دلیل کاهش تغییرات آماسی و ادم در بافت قلب باشد و حاکی از آن است که رزوراترول عضله قلب را در برابر ایسکمی محافظت می­کند.

   تارهای عضلانی قلب دارای آنزیم­های شاخصی همچون لاکتات دهیدروژناز و کراتین کیناز-MB هستند. در مطالعه حاضر ایزوپروترنول باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم­های مذکور شد. در هر صورت، درمان با رزوراترول به­طور معنی­داری مانع از افزایش این آنزیم­ها در اثر ایزوپروترنول شد که نشان می­دهد رزوراترول آسیب عضله قلب ناشی از ایزوپروترنول را کاهش می­دهد.

   مطالعات قبلی نشان داده است که، ایزوپروترنول باعث استرس اکسیداتیو شدید در عضله قلب موش­های صحرایی می­شود (Rathore et al., 1998). در این راستا، افزایش گونه­های فعال اکسیژن یا تخلیه آنتی­اکسیدان­ها ممکن است باعث القاء استرس اکسیداتیو و به موجب آن افارکتوس میوکارد گردد (Sawyer et al., 2002). آنزیم­های پاک­کننده رادیکال­های آزاد نظیر سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز با پاکسازی رادیکال­های اکسیژن مانند یون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و ممانعت از تشکیل رادیکال­های هیدروکسیل، سیستم تدافعی اصلی علیه استرس اکسیداتیو هستند (Sawyer et al., 2002). در مطالعات پیشین، اثرات آنتی­اکسیدانی رزوراترول نشان داده شده است (Su et al., 2006; Collodel et al., 2011). در این رابطه، در بررسی حاضر، مشخص شد که کاهش فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز در موش­های تیمار شده با ایزوپروترنول به­طور معنی­داری توسط رزوراترول افزایش یافت. در مطالعات انجام شده توسط Mokni و همکاران در سال 2013 نیز اثرات محافظتی رزوراترول بر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی قلب از طریق تعدیل  فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان به اثبات رسیده است (Mokni et al., 2013). این نتایج نشان می­دهد که رزوراترول می­تواند سیستم تدافعی آنتی­اکسیدانی میوکارد را علیه استرس اکسیداتیو تقویت کند. همچنین، نشان داده شده است که پراکسیداسیون لیپیدی با شدت آسیب غشا­های سلولی تارهای عضلانی قلب و غیرفعال شدن آنزیم­ها در ارتباط می­باشد (Karthikeyan et al., 2007). مالون­دی­آلدئید محصول نهایی پراکسیداسیون چربی بوده و افزایش آن ممکن است در اثر تولید رادیکال­های آزاد و کاهش فعالیت آنتی­اکسیدان­ها باشد (Zhou et al., 2006). در مطالعات پیشین، ادعا شده است که انفارکتوس قلبی در اثر ایزوپروترنول در اثر پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از رادیکال­ها، اتفاق می­فتد (Zhou et al., 2006).

   در این مطالعه، رزوراترول مقادیر افزایش یافته مالون­دی­آلدئید ناشی از ایزوپروترنول را کاهش داد.  کاهش مقادیر مالون­دی­آلدئید در قلب بعد از درمان با رزوراترول ممکن است در اثر افزایش فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز باشد. امکان دارد که رادیکال­های آزاد القاء شده توسط ایزوپروترنول، به­طور موثر توسط این آنزیم­ها پاکسازی شده باشد که این خود اثرات محافظتی رزوراترول را در آسیب ایسکمیک میوکارد ناشی از ایزوپروترنول را می­رساند.

   در بررسی حاضر، بافت عضله قلب موش­های تیمار شده با ایزوپروترنول تغییرات پاتولوژیک گسترده­ای از جمله نکروز کادیومیوسیت­ها، ادم بینابینی، خونریزی و ارتشاح لکوسیت­ها را نشان داد که حاکی از آسیب شدید میوکارد می‌باشد. در هر صورت، رزوراترول به­طور قابل توجهی از آسیب عضله قلب ناشی از ایزوپروترنول جلوگیری کرد. این یافته­ها اثرات محافظت از قلبی رزوراترول را بیشتر مورد تایید قرار می­دهد.

   با توجه به مجموعه فوق­الذّکر، رزوراترول با استفاده از خواص آنتی­اکسیدانی خود، عضله قلب موش صحرایی را در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از اثرات ایسکمیک ایزوپروترنول محافظت می­کند. بنابراین، پس از انجام کارآزمایی‌های شاهدار اتفاقی و حصول نتایج مثبت، رزوراترول می‌تواند در پیشگیری از آسیب­های اکسیداتیو میوکارد ناشی از ایسکمی در بیماران دچار انفارکتوس قلبی توصیه و به عنوان یک منبع قابل دسترس با خاصیت آنتی‌اکسیدانی به‌طور هم­زمان با سایر داروها مورد استفاده قرار گیرد.

   این­که آیا رزوراترول باعث کاهش اثرات درمانی سایر داروهای مصرفی در موارد انفارکتوس قلبی می­شود یا خیر، در این مطالعه نامشخص مانده و امکان مقایسه تاثیر این ماده با سایر ترکیبات در مواردی که دچار سکته قلبی هستند، فراهم نشده است. هم­چنین چگونگی تاثیر دزهای مختلف رزوراترول ، مکان و مکانیسم یا مکانیسم‌های مولکولی و سلولی مؤثر در عملکرد فارماکولوژیکی آن ناشناخته مانده و نیاز به مطالعات آتی و گسترده­تری دارد.

مراجع

 

• · Buttros, J.B., Bergamaschi, C.T., Ribeiro, D.A., Fracalossi, A.C. and Campos, R.R. (2009). Cardioprotective actions of ascorbic acid during isoproterenol-induced acute myocardial infarction in rats. Pharmacology, 84: 29-37.
• · Claiborne, A. (1985). Catalase activity In: Boca Raton FL, editor. CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, Boca Raton, pp: 283-284.
• · Collodel, G., Federicoa M.G., Gerniniania M., Martini S. and Bonechi E. (2011). Effect of trans-resveratrol on induced oxidative stress in human sperm and in rat germinal cells. Reproductive Toxicology, 31: 239-246.
• · Fraga, C.G., Leibovitz, B.E. and Tappel, A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as thiobarbituric acid-reactive substances in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes. Free Radic Biology and Medicine, 4(3): 155-161.
• · Jeandet, P., Bessis R. and Gautheron B. (1991). The production of resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene) by grape berries in different developmental stages. American Journal of Enology and Viticulture, 42: 41-46.
• · Karthick, M. and Stanely Mainzen Prince, P. (2006). Preventive effect of rutin, a bioflavonoid, on lipid peroxides and antioxidants in isoproterenol-induced myocardial infarction in rats. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 58:701-707.
• · Karthikeyan, K., Bai B.R. and Devaraj, S.N. (2007). Cardioprotective effect of grape seed proanthocyanidins on isoproterenol-induced myocardial injury in rats. International Journal of Cardiology, 115: 326-333.
• · Laine, G.A. and Allen, S.J. (1991). Left ventricular myocardial edema. Lymph flow, interstitial fibrosis, and cardiac function. Circulation Research, 68: 1713-1721.
• · Levy, R.I. and Feinleib, M. (1984). Heart disease. In: Brawnwald E, editor. Text book of Cardiovascular Medicine. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co., pp: 1205-1234.
• · Li, L., Zhang, L.K., Pang, Y.Z., Pan, C.S., Qi, Y.F., Chen, L., et al. (2006). Cardioprotective effects of ghrelin and des-octanoyl ghrelin on myocardial illJury induced by isoproterenol in rats. Acta Pharmacologica Sinica, 27(5): 527-535.
• · Lopez, A.D. and Murray, C.C. (1998). The global burden of disease, 1990–2020. Natural Medicine, 4: 1241-1243.
• · Mokni, M., Hamlaoui, S., Karkouch, I., Amri, M., Marzouki, L., Limam, F., et al. (2013).  Resveratrol Provides Cardioprotection after Ischemia/reperfusion Injury via Modulation of Antioxidant Enzyme Activities. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 12 (4): 867-875.
• · Nandave, M., Ojha, S.K., Joshi, S., Kurnari, S. and Arya D.S. (2007). Cardioprotective Effect of Bacopa monneira Against Isoproterenol-Induced Myocardial Necrosis in Rats. International Journal of Pharmacology, 3(5): 385-392.
• · Nishikimi, M., Appaji, N. and Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochemical and Biophysical Research Communications, 46(2): 849-854.
• · Oktem, G., Uysal, A., Oral, O., Sezer, E.D. and Olukman M. (2010). Resveratrol attenuates doxorubicin-induced cellular damage by modulating nitric oxide and apoptosis. Experimental and Toxicologic Pathology, 64: 471-479.
• · Peer, P.A., Trivedi, P.C., Nigade, P.B., Ghaisas, M.M. and Deshpande, A.D. (2008). Cardioprotective effect of Azadirachtaindica A. Juss on isoprenaline induced myocardial infarction in rats. International Journal of Cardiology, 126: 123-126.
• · Petrich, E.R., Schanne, O.F. and Zumino, A.P. (1996). Electrophsiological responses to ischemia and reperfusion. In: Karmazyn M Basel, editor. Myocardial ischemia: mechanism, reperfusion, protection. Birkhauser Verlag, pp: 115-133.
• · Rajadurai, M. and Prince, P.S.M. (2006). Preventive effect of naringin on lipid peroxides and antioxidants in isoproterenol-induced cardiotoxicity in Wistar rats: Biochemical and histopathological evidences. Toxicology, 228: 259-268.
• · Rathore, N., John, S., Kale, M. and Bhatnagar, D. (1998). Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in isoproterenol induced oxidative stress in rat tissues. Pharmacological Research, 38: 297-303.
• · Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. and Hoekstra, W.G. (1973). Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179(73): 588-590.
• · Sawyer, D.B., Siwik, D.A., Xiao, L., Pimentel, D.R., Singh, K. and Colucci, W.S. (2002). Role of oxidative stress in myocardial hypertrophy and failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 34: 379-388.  
• · Shingai, Y., Fujimoto, A., Nakamura, M. and Masuda, T. (2011). Structure and function of the oxidation products of polyphenols and identification of potent lipoxygenase inhibitors from fe-catalyzed oxidation of resveratrol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59: 8180-8186.
• · Su, H.C., Hung L.M. and Chen, J.K. (2006). Resveratrol, a red wine antioxidant, possesses an insulin-like effect in streptozotocin-induced diabetic rats. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism, 290: E1339-E1346.
• · Suchalatha, S. and Shyamala, D.C.S. (2004). Protective effect of Terminaliachebula against experimental myocardial injury induced by isoproterenol. Indian Journal of Experimental Biology, 42: 174-178.
• · Uguralp, S., Usta U. and Mizrak, B. (2005). Resveratrol may reduce apoptosis of rat testicular germ cells after experimental testicular torsion. European Journal of Pediatric Surgery, 15: 333-336.
• · Upaganlawar, A., Gandhi, C. and Balaraman, R. (2009). Effect of green tea and vitamin E combination in isoproterenol induced myocardial infarction in rats. Plant Foods for Human Nutrition, 64: 75-80.
• · Yulug, E., Tured, S., Alver, A., Kutlu, O., Karaguzel, E. and Kahraman C. (2013). Effects of Resveratrol on Testis Damage in Streptozotocin Induced Diabetic Rats. Journal of Animal and Veterinary Advances, 12(6): 747-753.
• · Zhou, B., Wu, L.J., Li, L.H., Tashiro, S., Onodera, S., Uchiumi F., et al. (2006). Silibinin protects against isoproterenol-induced rat cardiac myocyte injury through mitochondrial pathway after up-regulation of SIRT1. Journal of Pharmacological Sciences, 102: 387-395.
• · Zhou, R., Xu, Q., Zheng, P., Yan, L., Zheng, J. and Dai, G. (2008). Cardioprotective effect of fluvastatin on isoproterenol-induced myocardial infarction in rat. European Joaurnal of Pharmacology, 586: 244-250.