شناسایی تیلریااویس در کنه‌های ناقل بااستفاده ازروش واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) در استان لرستان

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 1، دوره 7، 2 (26) تابستان، شهریور 1392، صفحه 1828-1834   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

ناصر حقوقی راد¹؛ سعید هاشمی^{* 2}؛ محمد عبدی گودرزی³

¹دانشگاه آزاداسلامی،،واحدعلوم وتحقیقات،استاددانشکده علوم تخصصی دامپزشکی،گروه پاتوبیولوژی، تهران،ایران.

²دانشگاه آزاداسلامی، واحدعلوموتحقیقات، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی،گروه پاتوبیولوژی،تهران،ایران.

³موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، استادیارگروه انگلشناسی وبیماری‌های انگلی،کرج، ایران.

چکیده

بیماری تیلریوز ناشی از تک‌یاخته داخل سلولی به نام تیلریا است که باعث خسارت اقتصادی به صنعت دامپروری در نقاط مختلف ایران می­گردد. مطالعه حاضر با هدف شناسایی تیلریا اویس در کنه­های سخت در استان لرستان انجام گردید. 265 نمونه کنه از گوش و سطح بدن و 100 لام گسترش خونی از ورید گوش گوسفندانی با تاریخچه تب و کم­خونی از 5 منطقه مختلف استان لرستان طی فروردین تامرداد سال 1391 جمع‌آوری شد. استخراج DNA از غدد بزاقی کنه­ها صورت گرفت و آزمایش PCR با استفاده ازیک جفت پرایمراختصاصی به منظور تکثیر قطعه ژنی به اندازه 520جفت باز متعلق به ژن SSurRNAتیلریا اویس انجام شد.بررسی میکروسکوپیگسترش‌های خونی، اشکال پیروپلاسمی گونه­های تیلریا را در 12 مورد(12%) نشان داد.نتایج PCR نشان داد که 37نمونه(34/24%) ازکنه­های ریپی­سفالوس سانگوئینوس، شامل 21 کنه ماده(81/13%) و 16کنه نر(52/10%)واجدژنوم تیلریااویس بودند،درحالی­که درسایر کنه­ها ژنوم این انگل یافت نشد. از کل 265کنه، جنس ریپی­سفالوس سانگوئینوس، بیشترین (35/57%) و همافیزالیس پونکتاتا،کمترین (01/3%) میزان فراوانی را نشان داد. با توجه به گسترش وسیع ریپی­سفالوس سانگوئینوس نسبت به سایر کنه­ها به­نظر می­رسد که این کنه احتمالاًاصلی­ترین عامل انتقال تیلریا اویس در استان لرستان ایران باشد.

کلیدواژه‌ها

ایران؛ لرستان؛ تیلریا اویس؛ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

اصل مقاله

مقدمه

تیلریوز یکی از بیماری­های رایج و منتقله توسط کنه در نشخوارکنندگان کوچک مناطق گرمسیری  ونیمه گرمسیری جهان ازجمله ایران است. تیلریا لستوکاردی (Theilerialestocuardi) (هیرسی)عامل شکل حاد بیماری و گونه‌های اویس، سپراتا و رکوندیتا عوامل تیلریوز تحت حاد در گوسفندان و بزهای اهلی و وحشی می­باشند (Alani and Herbert, 1988).

کنه­های سخت خانواده ایکسودیده ناقل گونه­های تیلریا بوده و اسپروزوئیت انگل را بهمیزبان­های پستاندار خود انتقال می­دهند.مطالعات اخیر نشان می‌دهد که در ایران تیلریا اویس و لستوکاردی توسط کنه‌های جنس ریپی­سفالوس و هیالوما به گوسفند و بز منتقل می­گردد(Telmadarraiyet al.,2012;Tavassoliet al.,2011;Rahbariet al., 2007;Sparaganoet al.,2004)

روش‌های سنتی تشخیص تیلریا در میزبان‌های مهره‌دار براساس شکل انگل، خصوصیات میزبان و روش انتقال انگل ودر میزبان بی‌مهره براساس رنگ‌آمیزی غددبزاقی کنه با روش‌های رنگ‌آمیزی نظیر فولگن یا متیل گیرین پیرونین است. این روش‌ها غیراختصاصی هستند و در مواردی که تشابه انگلی وجود دارد مانند شباهت مرفولوژیکی آنولاتا و لستوکاردی، با این روش‌ها نمی‌توان گونه‌های انگل را از هم تفکیک کرد(Kirvaret al.,1998).در مقابل این، در سال‌های اخیر روش‌های مولکولی نظیرPCR برای تشخیص تک یاخته‌ها در کنه‌های ناقل بکار گرفته شده است زیرا از حساسیت و ویژگی بالایی نسبت به روش‌های سنتی برخوردارند (Aktaset al.,2006).مطالعات اندکی در زمینه تیلریوز گوسفند در لرستان صورت گرفته است. ملکیدر سال 2002 در خرم آباد با بررسی کشتارگاهی کبد 300 رأس گوسفند با روش رنگ‌آمیزی گیمسا، میزان شیوع تیلریوز را 10% گزارش کرده است(Maleki,2002). در استان‌های شمالی وشرق ایران، بررسی‌های مشابهی در زمینه تیلریوز گوسفند انجام شده است (Telmadarraiyet al., 2012; Tavassoliet al., 2011)،ولی مطالعه قابل توجهی در مورد کنه‌های ناقل صورت نگرفته است.بنابراین، هدف از این مطالعه شناسایی کنه‌های ناقل تیلریوز تحت حاد در استان لرستان می‌باشد.

 

مواد و روش‌ها

جمع آوری کنه و گسترش خونی

درمطالعه حاضر از فروردین تا تیر ماه 1391 مجموعا 265 نمونه کنه جمع‌آوری و 100لام گسترش خونی نازک گوش از 136 رأس گوسفند از 5 منطقه دام‌خیز و مختلف لرستان شامل خرم آباد(زاغه)، بروجرد(عربان)، دورود (میدانک و عزیز آباد)، الیگودرز(آبشارسفید) وپلدختر(چم چید) تهیه شد.لام‌های خونی به مدت 5دقیقه با متانول فیکس شده و با گیمسای 5% به مدت 40 دقیقه رنگ‌آمیزی گردیده و با میکروسکوپ نوری برای جستجوی اشکال پیروپلاسمی بررسی شدند. نمونه‌های کنه در آزمایشگاه با کلید تشخیص استاندارد(Estrada et al.,2004;Hoogstraaletal.,1985)تعیین جنس و گونه شده بعد توسط قیچی و میکرو اسکالپل از ناحیه اسکوتوم برش داده شده و غده بزاقی کنه‌ها جدا گردید و در میکروتیوب‌های اپندورف 5/1 میلی‌لیتری در دمای 20- درجه سلسیوس برای مراحل بعد نگه‌داری گردید.

استخراج DNA از غدد بزاقی کنه‌ها

در تحقیق حاضر، غدد بزاقی کنه‌های جمع‌آوری شده برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. عملیات استخراج با استفاده از کیت استخراج iNtRON Biotechnology, S.Korea وبراساس پروتکل شرکت سازنده صورت گرفت، بعد نمونه‌های DNA تا مراحل بعدی آزمایش دردمای انجماد 20- درجه سلسیوس نگه‌داری ‌شد.

آزمایش PCR

درتحقیق حاضر، یک جفت پرایمر با توالیTSsr170F;5'TCGAGACCTTCGGGT3',TSsr670R;5'TCCGGACATTGTAAAACAAA-3'

برای تکثیر یک قطعه ژنی با اندازه 520 جفت باز متعلق به ژن ssurRNA ریبوزومی تیلریا اویس، براساس روش کار Durrani و همکاران (Durraniet al., 2011)کارگرفته شد.ابتداعملیاتPCRرویکنترلمثبتانجامگردید،که باپرایمرپاسخمناسبیبهنمونه‌هایمثبتداد. به همیندلیلعملیات PCRبر نمونه‌هایDNAکنهبااستفادهازپرایمرانجامگرفت.واکنش PCRبرایحجم25میکرولیترطراحیشدهبود که شامل1میکرولیترMgCl2،5/0 میکرولیترdNTP، 2میکرولیتربافر، 2میکرولیتر DNA نمونه،Taqآنزیمpolymerase DNA 5/0میکرولیتر،2 میکرولیترپرایمرRو 2 میکرولیتر پرایمرFبود و حجم نمونه با آب مقطر به 25 میکرولیتر رسانده می‌شد و سپس محلول حاصل تحت برنامه‌ای که در جدول 1 آورده شده است دردستگاهترمال سیکلر قرار گرفته و PCR انجام می‌گردید.

 

 

جدول 1- برنامه PCRتیلریا اویس

مشخصه	دناتوره شدن اولیه	بسط نهایی
			D	A	E
دما(سلسیوس)	96	94	60	72	72
زمان(دقیقه)	3	5/0	5/0	2	10

Denaturation :D

Annealing :AوExtention :E

 

 

درپایانمحصولPCRرویژلآگاروز1درصدالکتروفورزشده،سپسژلبااتیدیومبروماید رنگ‌آمیزی و بادستگاهUV لومیناتوربااشعهUVبررسیوعکسبرداری می‌گردید.

 

یافته‌ها

میزان فراوانی کنه

از مجموع265کنه جمع‌آوری شده از 5 منطقه لرستان پس از شناسایی با کلید تشخیص،جنس ریپی سفالوس سانگوئینوس (Rhipicephalussanguineus) با 152 مورد (35/57%)  بیشترین و همافیزالیس پونکتاتا(Haemaphysalispunctata) با8 مورد (01/3%)کمترین میزان فراوانی را در گوسفندان لرستاننشان داد و در مورد سایر کنه‌ها،هیالوما آناتولیکوم آناتولیکومبا53 مورد (20%)، هیالوما آناتولیکومآسیاتیکومبا 23 مورد(67/8%)،هیالومامارژیناتوم با16 مورد(03/6%) و ریپی سفالوسبورسابا 13 مورد(90/4%) فراوانی همراه بود.

 

 

بررسی میکروسکوپی گسترش‌های خونی   

در بررسی 100 لام گسترش نازک خون با میکروسکوپ نوری، اشکال پیروپلاسمی گونه‌های تیلریای موجود در گلبول‌های قرمز، در 12 موردلام‌ها (12%) دیده شد.

یافته‌های PCR

در آزمایش PCR با پرایمر اختصاصی به‌کار رفته، ازمجموع 152 کنه ریپی سفالوس سانگوئینوس37 نمونه (34/22%) شامل 21 کنه ماده(81/13%) و 16کنه نر(52/10%)، واجدژنوم انگل تیلریااویسبه اندازه 520 جفت باز بودند ولی در سایر کنه‌ها ژنوم این انگل یافت نشد.درشکل1 در روی ژل اندازه باند مذکور نشان داده شده است(شکل1).

میزان آلودگی به تیلریا اویسدر کنه ریپی سفالوس برحسب منطقه در جدول2 نشان داده شده است. در بین کنه‌های آلوده، بیشترین میزان آلودگی در الیگودرز 16 مورد (65/32%) و کمترین میزان آلودگی در بروجرد 3 مورد(75/18%) مشاهده گردید.

 

 

 

 

 

شکل 1-تعیین تیلریا اویس در کنه‌های ریپی سفالوس: لاین M مارکر100 bp DNA، لاین 1 کنترل مثبت تیلریا اویس با اندازه 520 جفت باز، لاین‌های 2، 4، 5و6 کنه ریپی سفالوس سانگوئینوس ماده و لاین‌های 10و11 ریپی سفالوس سانگوئینوسنرولاین N کنترل منفی است.

 

 

جدول 2- میزانآلودگی کنه‌های جنس ریپی سفالوسبهتیلریااویسباروشPCRدرگوسفندانلرستان

 

مناطق نمونه‌گیری شده	R. sanguineus
	تعداد کنه	تعداد کنه‌های آلوده ( % )	کنه ماده آلوده( % )	کنه نرآلوده ( %)	تعداد کنه	کنه ماده آلوده(%)	کنه نر آلوده( % )
الیگودرز (آبشار سفید)	49	16(65/32)	40/20	24/12	10	0	0
دو رود (میدانک و عزیز آباد)	32	7 (87/21)	37/9	50/12	3	0	0
بروجرد (عربان)	16	3 (75/18)	50/12	25/6	0	0	0
خرم آباد (زاغه)	36	7 (44/19)	11/11	33/8	0	0	0
پلدختر (چم چید)	19	4 (04/21)	52/10	52/10	0	0	0
جمع	152	37 (34/24)	07/23	22/26	13	0	0

بحث و نتیجه‌گیری

تیلریوز تحت بالینی یک بیماری انگلی منتقله توسط کنه‌های سخت در نشخوارکنندگان کوچک ایران و لرستان در فصول گرماست.شناسایی کنه‌های ناقل تیلریا و میزان شیوع و پراکندگی آنها در تعیین اپیدمیولوژی تیلریوز بسیار حیاتی است(Alani and Herbert,1988).در لرستان به خاطر تفاوت آب و هوایی زیاد در نقاط مختلف آن، میزان شیوع و پراکندگی کنه‌های سخت بسیار متفاوت است و مطالعات قابل توجهی در رابطه با ناقل بودن این کنه‌ها در این استان صورت نگرفتهاست. لذا مطالعه حاضر اولین گزارش در رابطه با نقش کنه‌های ایکسودیده در انتقال گونه‌های تیلریوز نشخوارکنندگان کوچک درنقاط مختلف این استان می‌باشددر این بررسی با پرایمرهای اختصاصی، قطعه ژن با اندازه 520جفت باز تکثیر داده شد و مشخص شد ریپی سفالوس سانگوئینوس بیشترین آلودگی را به تیلریا اویس در لرستان دارد. مطالعات مشابهی در ایران و جهان صورت گرفته. در مازندران Telmadarraiy وهمکارانریپی سفالوس سانگوئینوس را مهمترین ناقل تیلریا اویس در گوسفندان شمال بیان کرده‌اند ولی میزان آلودگی آنها 55% بوده که حاکی از تفاوت آب و هوای آنجا با لرستان است. رزمی و همکاران با روش PCR بر نمونه‌های خون گوسفند، میزان آلودگی به گونه‌های تیلریا در گوسفندان جنوب خراسان را 9/11% نشان داده و بیش از 50درصد کنه‌ها ریپی سفالوس سانگوئینوس بوده است(Razmiet al.,2006). گرچه در مطالعه حاضر میزان آلودگی کنه مذکوربه این انگل درلرستان کمتر از خراسان است ولی این ممکن است به خاطر تفاوت آب و هوایی این دو منطقه از کشور باشد. همین‌طور حیدرپور بمیوهمکاران با روش PCR میزان شیوع تیلریا اویس درگوسفندان را 2/40% گزارش داده است(HeidarpourBamiet al.,2010).رزمیو همکاران با روش رنگ‌آمیزی غدد بزاقی کنه ریپی سفالوس سانگوئینوس با فولگن میزان آلودگی این کنه به تیلریا اویس را 4% نشان داده است.بنابراین روش مولکولی بیشترین حساسیت در تشخیص وتفکیک گونه‌های انگل را دارد(Razmiet al.,2003). عبدی گودرزیبا روشی مشابه تحقیق حاضر ولی با پرایمرهای اختصاصی دیگر، نشان داده که کنه هیالوما آناتولیکوم آناتولیکوم جمع‌آوری شده از فارس، و کنه هیالوما دتریتوم(H.detritum) از آب باریکه الیگودرز، ناقل تیلریا لستوکاردی است (Abdigoudarzi,2013).به هر حال در ایران چنین مطالعاتی اندک و بیشتر بر روی نمونه‌های خون دام انجام شده و کمتر به کنه‌های ناقل توجه شده است. در ترکیه آکتاس و همکاران با پرایمرهای مشابه تحقیق ما ریپی سفالوس بورسا را مهمترین ناقل تیلریوز تحت کلینیکی در ترکیه معرفی کرده است (Aktaset al.,2005).در پاکستان دورانی و همکاران با پرایمرهای مشابه تحقیق حاضر ریپی سفالوس سانگوئینوس را مهمترین ناقل تیلریوز تحت کلینیکی گزارش داده است. گرچه درصد آلودگی کنه‌های مذکور در پاکستان نسبت به نتایج ما بیشتر است ولی روش کارمشابهی با ما داشت (Durraniet al.,2011). به هر حال در اکثر این مطالعات کنه ریپی سفالوس سانگوئینوس به عنوان ناقل اصلی تیلریوز تحت حاددر نقاط مختلف ایران و خاور میانه معرفی شده که با نتایج ما هم‌خوانی دارد.

مراجع

• Abdigoudarzi, M. (2013). Detection of Naturally Infected Vector Ticks (Acari: Ixodidae) by Different Species of Babesia and TheileriaAgents from ThreeDifferent Enzootic Parts of Iran. Journal of Arthropod-Borne Disease[In Press].
• Alani, A.J. and Herbert, I.V. (1988). pathogenesis of infection with theileriarecondita isolated from Haemaphysalispunctatefrom NorthWales. Veterinary Parasitology,4:293-301.
• Aktas, M., Altay, K. and Dumanli, N. (2005). Survey of Theileria parasites of sheep in eastern Turkey using polymerase chain reaction. Small Ruminant Research, 60: 289–293.
• Aktas, M., Altay, K. and Dumanli, N. (2006). PCR-based detection of Theileriaovis in Rhipicephalusbursa adult  ticks. Veterinary Parasitology, 140: 259-263.
• Durrani, A.Z., Younus, M., Kamal, N., Mehmood, N. and Shakoori, A.R.(2011). Prevalence of ovine Theileria species in District Lahore, Pakistan. Pakistan Journal of Zoology, 43(1): 57-60.
• Estrada-Pena, A., Bouattour, A., Cam-icas, J.L. and Walker, A.R. (2004). Ticks of Domestic Animals in the Mediterranean Region. 1^sted. University of Zaragoza, Spain, pp.131.
• Hashemi-Fesharaki, R. (1997). Tick-borne  disease  of sheep and goats and their related vectors in Iran. Parassitologia, 39: 115-117.
• Hoogstraal, H. and Wassef, Y.H. (1985). Hyalmomaanaolicuman Indian Pakistani cattle tick parasitizing bovine in Oman.Veterinary Parasitology, 71(1): 129-130.
• Heidar pour Bami, M., Khazraiinia,P., Haddadzadeh, H. and Kazemi, B.(2010).Identification of Theileria species in sheep in the eastern half of Iran using nested PCR-RFLP and microscopic techniques. Iranian Journal of Veterinary Research, 11(3): 262-266.
• Kirvar, E., Iihan, T., Katzer, F., Wilkie, G., Hooshmand-Rad, P. and Brown, C.G.D. (1998). Detection of Theilerialestoquardi (hirci) in ticks, sheep, goats using polymerase chain reaction. Annals of the New York Academy of Sciences, 894: 52-62.
• Maleki, S.H. (2002). Case study of Theileriacontamination in liver of disease sheep perished and slaughtered in the slaughter house ofkhorramabad.Journal of Veterinary Research, 57(1): 97-99.
• Rahbari, S., Nabian, S. and Shayan, P. (2007). Primary report on distribution of tick fauna in Iran. Parasitology Research, 101(2): 175-177.
• Razmi, G.R., Eshrati, H. and Rashtibaf, M. (2006). Prevalence of Theileriaspp infection in sheep in South Khorasan province, Iran. Veterinary Parasitology,140(3-4): 239-243.
• Razmi, G.R., Hosseini, M. and Aslani, M.R. (2003). Identification of tick vectors of ovine theileriosisin an endemic region of Iran. VeterinaryParasitol, 116: 1-6.
• Telmadarraiy, Z., Oshaghi, M.A., Hosseini Vasoukolaei, N., Yaghoobi Ershadi, M.R., Babamahmoudi, F. and Mohtarami, F. (2012). First molecular detection of Theileriaovis in Rhipicephalussanguineus tick in Iran. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 4: 29-32.
• Tavassoli, M., Tabatabaei, M., Esmaeil Nejad, B., Tabatabaei, M.H., Najabadi, A. and Pourseyed, S.H. (2011). Detection of  Theileriaannulata by the PCR-RFLP in ticks (Acari,Ixodidae) collected from cattle in West and North-West Iran. Acta parasitologica, 56(1): 8-13.
• Sparagano, O., Spitalska, E., Namavari, M.M., Hosseini, M.H., Shad-de,F., Seghatolesla, F. and Amabadi, O.R. (2004). Screening tick-borne diseasesin sheep. Epidémiologieet Sante Animale, 45: 73-75.