مطالعه میزان باقی‌مانده انروفلوکساسین در عضلات و کبد ماهیان قزل آلای رنگین کمان در استان چهار محال و بختیاری به روش الایزا

بهداشت مواد غذایی

مقاله 6، دوره 2، 1 (5) بهار، خرداد 1391، صفحه 53-62   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

فیروز فدایی فرد^*

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، دانشکده دامپزشکی، استادیار گروه بهداشت و بیماری‌های آبزیان، شهرکرد، ایران

چکیده

   انروفلوکساسین از آنتی­بیوتیک­های پرمصرف دامپزشکی است که در سال­های اخیر استفاده آن در کنترل بیماری­های عفونی ماهیان پرورشی رشد چشمگیری داشته است. هدف از انجام مطالعه حاضر اندازه­گیری میزان باقی­مانده انروفلوکساسین در عضلات و کبد ماهی قزل­آلای رنگین­ کمان پرورشی استان چهار محال و بختیاری به روش الایزا بود. برای این منظور در فصول بهار و تابستان 1390 به مزارع پرورشی مناطق اردل و کوهرنگ مراجعه و از هر منطقه سه مزرعه انتخاب گردید و 15 نمونه­­ در سه گروه وزنی کمتر از 50 گرم، 50 تا 150 گرم و بیشتر از 150 گرم (5 نمونه از هر گروه وزنی) صورت گرفت. طبق نتایج مطالعه، بیشترین و کمترین درصد باقی­مانده انروفلوکساسین به ترتیب در گروه­های وزنی زیر 50 گرم و بالای 150 گرم و به میزان 33/58 و 33/23 درصد ردیابی شد. در مقایسه بین مناطق مختلف نیز کوهرنگ با میزان50/11 ± 84/13 و 06/18 ± 95/19 و اردل با میزان 62/11 ± 83/12 و 09/11 ± 22/11 میکروگرم در کیلوگرم آنتی­بیوتیک در عضله و کبد به ترتیب دارای بیشترین و کمترین میزان باقی­مانده بودند. همچنین میزان باقی­مانده در عضله و کبد در فصل بهار 00/13 ± 27/14 و 69/21 ± 06/22 و در فصل تابستان 29/10 ± 40/12 و 31/7 ± 86/8 میکروگرم در کیلوگرم بوده است. در ضمن در تمامی گروه­های وزنی میزان باقیمانده انروفلوکساسین در نمونه­های کبد بالاتر از عضلات تشخیص داده شد. اما در کل میزان باقی­مانده انروفلوکساسین در نمونه­های آزمایش شده پایین­تر از حد مجاز اتحادیه اروپا بود.

کلیدواژه‌ها

انروفلوکساسین؛ الایزا؛ قزل‌آلای رنگین کمان؛ چهار محال و بختیاری

اصل مقاله

مطالعه میزان باقی­مانده انروفلوکساسین در عضلات و کبد ماهیان قزل آلای رنگین کمان در استان چهار محال و بختیاری به روش الایزا

 

فیروز فدایی فرد

 

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، دانشکده دامپزشکی، استادیار گروه بهداشت و بیماری­های آبزیان، شهرکرد، ایران.

نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 3/3/91  پذیرش نهایی: 28/8/91)

 

 

چکیده

   انروفلوکساسین از آنتی­بیوتیک­های پرمصرف دامپزشکی است که در سال­های اخیر استفاده آن در کنترل بیماری­های عفونی ماهیان پرورشی رشد چشمگیری داشته است. هدف از انجام مطالعه حاضر اندازه­گیری میزان باقی­مانده انروفلوکساسین در عضلات و کبد ماهی قزل­آلای رنگین­ کمان پرورشی استان چهار محال و بختیاری به روش الایزا بود. برای این منظور در فصول بهار و تابستان 1390 به مزارع پرورشی مناطق اردل و کوهرنگ مراجعه و از هر منطقه سه مزرعه انتخاب گردید و 15 نمونه­­ در سه گروه وزنی کمتر از 50 گرم، 50 تا 150 گرم و بیشتر از 150 گرم (5 نمونه از هر گروه وزنی) صورت گرفت. طبق نتایج مطالعه، بیشترین و کمترین درصد باقی­مانده انروفلوکساسین به ترتیب در گروه­های وزنی زیر 50 گرم و بالای 150 گرم و به میزان 33/58 و 33/23 درصد ردیابی شد. در مقایسه بین مناطق مختلف نیز کوهرنگ با میزان50/11 ± 84/13 و 06/18 ± 95/19 و اردل با میزان 62/11 ± 83/12 و 09/11 ± 22/11 میکروگرم در کیلوگرم آنتی­بیوتیک در عضله و کبد به ترتیب دارای بیشترین و کمترین میزان باقی­مانده بودند. همچنین میزان باقی­مانده در عضله و کبد در فصل بهار 00/13 ± 27/14 و 69/21 ± 06/22 و در فصل تابستان 29/10 ± 40/12 و 31/7 ± 86/8 میکروگرم در کیلوگرم بوده است. در ضمن در تمامی گروه­های وزنی میزان باقیمانده انروفلوکساسین در نمونه­های کبد بالاتر از عضلات تشخیص داده شد. اما در کل میزان باقی­مانده انروفلوکساسین در نمونه­های آزمایش شده پایین­تر از حد مجاز اتحادیه اروپا بود.

 

واژه­های کلیدی: انروفلوکساسین، الایزا،قزل­آلای رنگین کمان، چهار محال و بختیاری

 

 

 

 

 

مقدمه

   افزایش تولیدات منابع دریایی و توسعه آبزی پروری در دنیا باعث افزایش تولید غذاهای فرموله، آنتی بیوتیک­ها، ضد قارچ­ها و مواد شیمیایی گیاهی گشته است (FAO, 2008).تحقیقات مختلف نشان داده که صنایع آبزی پروری رایج می­تواند منجر به افزایش سطوح باقی­مانده­های آنتی­بیوتیکی، باکتری­های مقاوم به آنتی­بیوتیک، آلوده کننده­های آلی پایدار، فلزات، انگل­ها و ویروس­ها در ماهیان و سخت­پوستان خوراکی پرورشی گردد. گروه­های ویژه در معرض خطر با این آلوده­کننده­ها شامل کارگران مزارع پرورشی، موجودات زنده اطراف این مزارع و مصرف­کنندگان این تولیدات آبزی پروری هستند (Sapkota et al., 2008). در صنعت آبزی پروری استفاده وسیع از آنتی­بیوتیک­ها در درمان بیماری­های باکتریایی منجر به افزایش مقاومت آنتی­بیوتیکی در باکتری­هایی مثل آئروموناس­ ­هایدروفیلا ((Aeromonas hydrophila، آئروموناس­ سالمونیسیدا(Aeromonas salmonicida)، پاستورلا پیسیدا (Pasteurella piscicida)، ادواردزیلا تارد (Edwardsiella tarda)، ادواردزیلاایکتالوری  (Edwardsiella ictaluri)، ویبریو انگوئیلاروم (Vibrio anguillarum)، ویبریوسالمونیسیدا (Vibrio Salmonicida)، یرسینیا راکری (Yersinia ruckeri)، استرپتوکوکوس اینیایی (Streptococcus iniae) و  لاکتوکوکوس گارویه (Lactococcus garvieae) شده است.

   و لزوم انجام مطالعات کنترل شده برای تعیین اثر درمان با عوامل ضد میکروبی بر بوم­شناسی مزارع پرورش ماهی بالاخص در سطح میکروارگانیسم­ها
می­باشد (Hernández Serrano, 2005). برخی از محققین بر روی آنالیز باقی­مانده آنتی­بیوتیک­ها و عوامل آنتی­باکتریال مواد غذایی حیوانی با تکنیک اسپکترومتری توده­ای کروماتوگرافی مایع یاLiquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) و آنالیز این ترکیبات در باقی­مانده­های دامپزشکی با تکنیک  LC–MS–MS تأکید دارند (Balizs and Hewitt, 2003; Di Corcia and Nazzari, 2002; Horie and Takegami, 2006; Niessen, 1998).  

   استفاده با دوز پایین آنتی­بیوتیک­ها در مواد غذایی طی دوره­های طولانی مدت ممکن است باعث افزایش
سویه­های مقاوم باکتریایی گردد. به منظور حفظ بهداشت و سلامت انسانی، اتحادیه اروپا حداکثر
باقی­مانده مجاز این داروها و سایر ترکیبات دامپزشکی را مشخص نموده و استفاده از داروهای دامپزشکی بر اساس مقررات اتحادیه اروپا (ثبت 2377/90/EC) معرفی شده است (EC, 2008)، که در این مجموعه مقررات میزان حداکثر باقی­مانده ایمن آنتی­بیوتیک­ها برای ماهی نیز تعریف شده است. همچنین کمیسیون غذایی کدکس که توسط سازمان خواربار جهانی(F.A.O) و سازمان بهداشت جهانی (W.H.O) راه­اندازی شده، سازمان غذا و داروی آمریکا (F.D.A)، سازمان بازرسی مواد غذایی کانادا (The Canadian Food Inspection Agency)، دفتر دامپزشکی و
آفت­کش­های استرالیا (The Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority) و وزارت بهداشت شیلی (The Health Department from Chile) نیز از سایر مراکزی هستند که محدوده قابل تحمل انواع داروها را با یک سری تفاوت­هایی میان آنها اعلام کرده اند. البته در میزان استفاده این داروها و حتی اجازه مصرف کردن یا نکردن آنها بین این سازمان­ها اختلافاتی نیز وجود دارد به عنوان مثال فقط مقررات اتحادیه اروپا اجازه استفاده از فلوروکینولون­ها را در ماهیان پرورشی داده است (EC, 2003). بر اساس پیشنهاد اتحادیه اروپا حداکثر میزان انروفلوکساسین و سیپروفلوکساسین در بافت­های ماهی و سایر حیوانات که برای انسان مضر نباشد و به عنوان بیشینه میزان باقی­مانده (MRL) توصیف می­گردد 100 میکروگرم در هر کیلوگرم گوشت ماهی است (Balizs and Hewitt, 2003).

   کینولون­ها گروهی از آنتی­بیوتیک­های ساختگی هستند که در درمان بیماری­های عفونی در صنعت آبزی پروری مورد استفاده قرار می­گیرند که به عنوان آخرین نسل عوامل آنتی­بیوتیکی معرفی گردیده است.

   مکانیسم فعالیت فلورکینولون­ها بصورت باکتری کشی است و نقش آنها در ممانعت از آنزیم DNA gyrase دیواره سلولی باکتری­ها که در تکثیر  DNAنقش دارند می­باشد (Dulopnt, 1989). از انروفلوکساسین و سیپروفلوکساسین به دلیل حداقل غلظت­های ممانعتی نسبتاً پایین برای حساس­ترین پاتوژن­های ماهی و انتشار مؤثر آنها در بدن، به صورت خوراکی و به شکل گسترده­ای در درمان عفونت­های باکتریایی عمومی ماهیان استفاده می­شود (O'Grady et al., 1988). استفاده کینولون­ها در ماهیان و به دنبال آن مصرف آنها در انسان باعث بروز مسمومیت­های مستقیم یا عامل افزایش مقاومت عوامل بیماری­زای انسانی و به مخاطره افتادن سلامت انسان می­گردد. این داروها اثرات سمی بر غضروف­های مفصلی و بروز بیماری آرترالژیا (Arthropathy) یا آرتروپاتی (Arthralgia) جوانی داشته و باعث ایجاد واکنش­های افزایش حساسیت آلرژیک می­گردد (Juan-Garca et al., 2006). انروفلوکساسین و سیپروفلوکساسین دو دارو از دسته کینولون­ها هستند که از طریق روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و ردیابی از طریق فلورسنس قابل شناسایی هستند (Olutosin and James, 2004). با توجه به مطالعات محدود در زمینه بررسی باقی­مانده این آنتی­بیوتیک­ها در مواد غذایی هدف از انجام مطالعه حاضر ردیابی و اندازه­گیری میزان باقی­ماندگی انروفلوکساسین در عضلات و کبد ماهیان قزل آلای رنگین کمان پرورشی استان چهار محال و بختیاری به روش الایزا بوده است.

  

مواد و روش­ها

نمونه­گیری

   این تحقیق طی مدت شش ماه (بهار وتابستان1390) در برخی مزارع پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان استان چهارمحال و بختیاری به منظور بررسی وضعیت باقی­ماندگی آنتی­بیوتیک انروفلوکساسین صورت پذیرفت. حوزه تحقیق شامل شهرستان­های کوهرنگ و اردل که از بیشترین تمرکز مزارع پرورش ماهی قزل آلا برخوردار هستند می­باشد. در هر شهرستان حداقل سه مزرعه (بر اساس میزان تولید) انتخاب و از هر مزرعه در سه گروه وزنی زیر50 گرم،50 تا 150 گرم و بالای 150 گرم نمونه­برداری صورت پذیرفت. در هر رده وزنی نیز 5 عدد ماهی برداشت می­گردید البته در
اندازه­های زیر 50 گرم تعداد بیشتری ماهی انتخاب
می­شد تا بتوان میزان نمونه عضله و کبد لازم برای تست را از آنها جدا نمود. مجموعاً در هر فصل 180 نمونه و در کل 360 نمونه بافتی جهت سنجش میزان آنتی­بیوتیک جمع­آوری گردید. در هر مزرعه نیز برخی اطلاعات و تاریخچه وقوع بیماری­های عفونی، مصرف احتمالی دارو و طول دوره درمان اخذ و ثبت می­شد. در هر گروه وزنی، ماهیان به طور تصادفی انتخاب و درون کیسه مخصوصی که دارای مشخصات مزرعه­ای بود قرار داده شده و در کنار یخ به آزمایشگاه مرکزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل
می­گردید. این نمونه­ها تا زمان انجام آزمایش در شرایط انجماد (18- درجه سلسیوس) نگه­داری شدند.

آماده­سازی نمونه­ها و انجام تست الایزا

   ابتدا ماهیان را از فریزر خارج نموده و پس از چند دقیقه نگه­داری در شرایط آزمایشگاه اقدام به برش عضله و خارج نمودن کبدهای آنها می­شد. سپس 10 گرم از نمونه اندامی را جدا نموده و پس از همگن کردن آن، 5/0 گرم از نمونه همگن به داخل لوله آزمایش انتقال داده می­شد و 5/1 میلی لیتر از متانول 80 درصد (مخلوط 8 میلی لیتر متانول 100 درصد و 2 میلی لیتر بافر رقیق­کننده (SDB) به آن افزوده و به خوبی تکان داده می­شد. محتویات داخل لوله را به مدت 20 دقیقه در سانتریفوژ 2000 دور در دقیقه قرار داده و سپس 100 میکرولیتر از مایع رو را به داخل یک لوله تمیز وارد و 900 میکرولیتر از SDB را به آن اضافه کرده و در نهایت مقدار50 میکرولیتر از آن جهت تست سنجش ایمنی آنزیمی استفاده می­گردید. به منظور انجام تست الایزا از کیت الایزای انروفلوکساسین شرکت  Europroxima(Netherlands) استفاده شد حساسیت این کیت برابر با 5/0 قسمت در بیلیون (ppb5/0)، میزان متوسط بازیافت آن بین 75 تا 130 درصد، میزان واکنش متقاطع برای انروفلوکساسین (100 درصد) و سیپروفلوکساسین (003/0 درصد) و محدوده ردیابی آن 10 نانوگرم در هر گرم بافتی است. به منظور اندازه­گیری میزان باقی­مانده آنتی­بیوتیکی ابتدا با آماده­سازی
معرف­های مربوط به پروتکل و با استفاده از یک میکروپلیت 96 خانه اقدام به انجام آزمایش گردید بطوریکه بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده 100 میکرولیتر از استاندارد صفر را (در دو تکرار) در چاهک­های A₁ و A₂ و50 میکرولیتر(در دو تکرار) در چاهک­های B₁وB₂  ریخته، سپس 50 میکرولیتر از استاندارد انروفلوکساسین را (در دو تکرار) درون چاهک­های C₁ وC₂  تا H₁  و H₂ قرار داده شد. در مرحله بعد 50 میکرولیتر از هر محلول نمونه (در دو تکرار) آماده کرده و به چاهک­های باقی­مانده (80 چاهک دیگر) افزوده شد. در ادامه 25 میکرولیتر از کنژوگه (ERFX-HRPO) درون چاهک­ها به غیر از A₁ وA₂ ریخته شد و میکروپلیت برای چند ثانیه داخل یک شیکر مخصوص قرار داده و تکان داده شد متعاقباً پلیت به مدت یک ساعت در انکوباتور 30 درجه سلسیوس منتقل شده و سپس با دور ریختن محتوای چاهک­ها اقدام به سه بار شستشوی آنها  با بافر شستشو گردید. در ادامه 100 میکرولیتر از محلول سوبسترا را وارد چاهک­ها نموده و مجدداً به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد در نهایت 100 میکرولیتر از محلول متوقف­کننده را به هر چاهک اضافه کرده و بلافاصله با استفاده از دستگاه الایزا خوان میزان جذب نوری آنها در طوج موج 450  نانومتر تعیین گردید و مقادیر به دست آمده با نمودار کالیبراسیون مقایسه شده و میزان
باقی­مانده دارو در واحد میکروگرم در کیلوگرم به دست آمد.

آنالیز آماری

   جهت بررسی باقی­ماندگی  مقادیر آنتی­بیوتیک در بین گروه­های وزنی مختلف از آنجائیکه یک متغیر در بین 3 گروه وزنی مورد ارزیابی قرار گرفته است  لذا از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و مقایسه بین میانگین­ داده­ها از روش دانکن استفاده شد.

   برای بررسی وجود تفاوت آماری بین مناطق و فصول مختلف نیز از آزمون T-test مستقل استفاده گردید به طوریکه هدف به دست آوردن تفاوت آماری متغیر در گروه­های دوتایی بوده است در ضمن برای کلیه
آزمون­ها از نرم افزار SPSSورژن 17 استفاده گردید.

 

 

یافته­ها

   نتایج اندازه­گیری میزان باقی­مانده انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان قزل آلای رنگین کمان پرورشی استان چهارمحال و بختیاری در فصول و مناطق در جدول­های 1 تا 3 آمده است.

 

 

جدول 1: میانگین مقادیر باقی­ماندگی انروفلوکساسین در کبد و عضله ماهیان در اوزان مختلف

اندام و درصد آلودگی گروه وزنی	تعداد نمونه­ها	نمونه­های آلوده (%)	عضله (µg/kg)	کبد (µg/kg)
زیر 50 گرم بین 50 تا 150 گرم بالای 150 گرم	120 120 120	33/58 50/37 33/23	a 71/10 ±94/12 a 11/9 ±81/14 a 9 ±07/12	a11±50/12 a 81/17 ±83/17 a 83/14 ±60/17

 :aتفاوت بین گروه­ها با استفاده از آزمون آنالیز واریانس معنی­دار نیست

 

 

   در جدول 1 مقایسه میانگین باقی­ماندگی انروفلوکساسین در کبد و عضله ماهیان در سه گروه وزنی زیر 50 گرم، بین 50 تا 150 گرم و بالای 150 گرم صورت گرفته است. نتایج نشان دهنده این است که تفاوت معنی­داری بین میزان آنتی­بیوتیک در
گروه­های مختلف و به تفکیک در کبد و عضله ماهیان وجود ندارد.

 

 

جدول 2: میزان میانگین باقی­مانده انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان در مناطق مختلف

اندام و درصد آلودگی منطقه	تعداد نمونه­ها	نمونه­های آلوده (%)	عضله (µg/kg)	P value	کبد (µg/kg)	P value
اردل کوهرنگ	180 180	77/52 22/72	62/11 ±83/12 50/11 ±84/13	*69/0	09/11 ±22/11 06/18 ±95/19	*171/0

^* تفاوت مقادیر باقی­ماندگی بین دو منطقه معنی­دار نیست.

 

 

 

    در جدول 2 نتایج مقایسه میانگین باقی­ماندگی انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان در دو منطقه اردل و کوهرنگ آمده است. با توجه به داده­ها تفاوت آماری معنی­داری بین میزان آنتی­بیوتیک در دو منطقه مورد بررسی مشاهده نمی­شود (05/0p>).

 

 

 

جدول 3: میزان میانگین باقی­مانده انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان در فصول مختلف

اندام و درصد آلودگی فصل	تعداد نمونه­ها	نمونه­های آلوده (%)	عضله (µg/kg)	P value	کبد (µg/kg)	P value
بهار تابستان	180 180	88/63 55/45	00/13 ±27/14 29/10 ±40/12	*478/0	69/21 ±06/22 31/7 ±86/8	**015/0

* تفاوت مقادیر باقی­ماندگی بین دو فصل با استفاده از آزمون t مستقل معنی­دار نیست.

** تفاوت مقادیر باقی­ماندگی بین دو فصل معنی­دار است )05/0 (p<.

 

 

  

 

در جدول 3 نتایج مقایسه میانگین باقی­ماندگی انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان در دو فصل بهار و تابستان آمده است با توجه به داده­های به دست آمده تفاوت آماری معنی­داری بین میزان آنتی­بیوتیک در عضله ماهیان در دو فصل بهار و تابستان مشاهده
نمی­شود. ولی در کبد ماهیان بین مقادیر آنتی­بیوتیک در فصول مورد بررسی اختلاف آماری معنی­داری مشاهده می­گردد.

 

بحث و نتیجه­گیری

   از آنجائیکه استان چهار محال و بختیاری از مناطق پر تولید ماهی قزل آلای رنگین کمان کشور بوده و در
سال­های اخیر مصرف آنتی­بیوتیک­ها رشد چشمگیری داشته است، لذا مطالعه حاضر با هدف ردیابی و
اندازه­گیری باقی­مانده­های انروفلوکساسین در کبد این ماهیان در سه گروه وزنی زیر 50 گرم، 50 تا 150 گرم و بالای 150 گرم در دو منطقه اردل و کوهرنگ و در دو فصل بهار و تابستان 1390 انجام گرفت. همانطور که در جدول 1 مشاهده می­شود، میزان باقی­ماندگی انروفلوکساسین در کبد و عضله ماهیان مورد مطالعه در سه گروه وزنی زیر 50 گرم، 50 تا 150 گرم و بالای 150 گرم اختلاف آماری معنی­داری نداشته و در مقایسه بین اندام­های مختلف در تمام گروه­های وزنی میزان انروفلوکساسین در کبد بیشتر از عضله بوده است که دلیل آن نیز به خاطر تجمع و تمرکز بیشتر آنتی­بیوتیک­ها در کبد (به منظور متابولیسم) است؛ همچنین در مقایسه بین میزان دارو در کبد گروه­های مختلف وزنی به ترتیب زیر 50 گرم و بالای 150 گرم از کمترین و بیشترین میزان تجمع برخوردار بوده­اند که می­توان دلیل آن را مصرف بیشتر آنتی­بیوتیک در اوزان بالاتر ماهیان دانست. در مقایسه بین گروه­های وزنی در معرض
آنتی­بیوتیک نیز بالاترین میزان مصرف در گروه زیر 50 گرم با 33/58 درصد و کمترین میزان در گروه بالای 150 گرم با 33/23 درصد دیده می­شود این آمار نشان از بالا بودن مصرف دارو در ماهیان زیر 50 گرم دارد که علت آن را می­توان استفاده جهت کنترل تلفات مشکوک به بیماری­های عفونی در این رده وزنی دانست.

   با توجه به نتایج بدست آمده در جدول 2 تفاوت آماری معنی­داری بین میزان باقی­ماندگی انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان در دو منطقه اردل و کوهرنگ مشاهده نمی­شود اما در مقایسه بین میانگین داده­ها میزان
باقی­ماندگی آنتی­بیوتیک در عضله و کبد ماهیان منطقه کوهرنگ بیش از منطقه اردل بوده است که به احتمال به مصرف بالاتر آنتی­بیوتیک در منطقه کوهرنگ مرتبط می­باشد. بطوریکه مزارع منطقه کوهرنگ با میزان50/11 ±84/13 و 06/18 ± 95/19 و اردل با میزان 62/11 ± 83/12 و 09/11 ± 22/11 میکروگرم در کیلوگرم آنتی­بیوتیک در عضله و کبد به ترتیب دارای بیشترین و کمترین میزان باقی­مانده بوده­اند. اطلاعات پرسش­نامه­ای اخذ شده از مزارع نیز گواه بر این ادعا است؛ بطوریکه مزارع واقع در منطقه کوهرنگ از میزان مصرف بالاتری از
آنتی­بیوتیک برخوردار بوده­اند.

   همانگونه که در جدول 3 مشاهده می­شود مقایسه بین میزان باقی­ماندگی انروفلوکساسین در عضله و کبد ماهیان در فصول مختلف نشان از تفاوت معنی­دار میانگین داده­ها در کبد ماهیان و عدم تفاوت معنی­دار بین داده­ها در عضله ماهیان در دو فصل بهار و تابستان دارد. اما وضعیت قابل مشهود در این مقایسه بالا بودن میزان باقی­ماندگی به ترتیب در عضله و کبد ماهیان در فصل بهار با میزان    00/13 ± 27/14 و 69/21 ± 06/22 و در فصل تابستان 29/10 ±40/12 و 31/7 ± 86/8 میکروگرم در کیلوگرم  بوده است که بهترین توجیه برای این اتفاق افزایش مصرف آنتی­بیوتیک در بچه ماهیان (که عموماً در فصل بهار رخ می­دهد) و بالا رفتن دما در فصل تابستان و تسریع در متابولیزه شدن دارو و دفع از بدن دانست. براساس اخذ اطلاعات واصله از مزارع مورد بررسی در مطالعه حاضر برخی از این مزارع در طول دوره پرورشی خود تجربه مصرف انروفلوکساسین را داشته ولی بسته به وزن ماهی، فصل مورد بررسی و همچنین در منطقه مورد مطالعه تفاوت­هایی را می­توان مشاهده نمود که به بحث هرکدام از آنها پرداخته شد ولی مسأله مهم حضور این آنتی­بیوتیک در اندام­های ماهی قزل آلا به عنوان پرمصرف­ترین ماهی پرورشی کشورمان است که بایستی از نقطه نظر بهداشتی مورد توجه قرار گیرد. البته مقدار باقی­مانده آنتی­بیوتیکی در تمام گروه­های وزنی مورد مطالعه و در مناطق و فصول مختلف پائین­تر از حد مجاز اعلام شده توسط اتحادیه اروپا (بیش از 100 میکروگرم در کیلوگرم) بوده است. در مقایسه با سایر دام­ها مطالعات گسترده­ای در زمینه ردیابی باقی­مانده­های آنتی­بیوتیکی در ماهی با استفاده از روش­های مختلف صورت نگرفته است ولی از جمله تحقیقات به عمل آمده در این خصوص می­توان به در ردیابی باقی­مانده­های آنتی­بیوتیکی ماهیان (Samanidou et al., 2007)، آنالیز باقی­مانده­های دارویی دامپزشکی در ماهی با استفاده از تکنیکTandem Mass Spectrometry Detection (LC/MS/MS) (Tittlemier et al., 2007)، تعیین باقی­مانده­های کینولون­ها در ماهی با شیوه Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry توسط (Yolanda Pico, 2006)، تعیین همزمان آنتی­بادی­های فلوروکینولون درفرآورده­های دریایی از طریق الایزا (Huet et al., 2006)، تعیین
باقی­ماندگی اریترومایسین در ماهی قزل آلا با روش TMS (Lucchetti et al., 2005)، تعیین باقی­مانده کلرامفنیکل در ماهی و میگو از طریق کروماتوگرافی گازی با دتکتور Microcell Electron Capture (Ding et al., 2005) و تعیین چند دارو در ماهی و میگوهای خوراکی با استفاده از تکنیک HPLC ((Ueno et al., 1999  اشاره نمود.

   طی اندازه­گیری سه آنتی­بیوتیک اکسی­تتراسیکلین، انروفلوکساسین و اریترومایسین در بافت عضله ماهی قزل آلای رنگین استان چهارمحال و بختیاری به روشHPLC  میزان باقی­ماندگی انروفلوکساسین 05/0 تا 73/0 میکروگرم در هر گرم به دست آمد که نتایج آن مشابه نتایج تحقیق حاضر است (Soltani, 2010). در ارتباط با فرآیند کاهش میزان آنتی­بیوتیک در دام­ها و دوره پرهیز از مصرف آنها تحقیقات زیادی صورت گرفته و زمان لازم جهت دفع دارو و متابولیت­های آن اعلام شده است ولی از آنجائیکه آبزیان موجوداتی خونسرد بوده و واکنش­های فیزیولوژیک بدن آنها متأثر از محیط است این امر تا حدود زیادی وابسته به دمای محیط است بطوریکه حداقل دوره پرهیز از مصرف دارو که توسط آیین­نامه شماره  2001/82 اتحادیه اروپا برای برخی انواع فرآورده­های دریایی پیشنهاد شده است 500 درجه روز است ولی در مطالعه دیگری زمان طولانی­تر یعنی 816 درجه روز را برای جمع میزان انروفلوکساسین و سیپروفلوکساسین در بافت­های عضلات و پوست ماهی قزل آلای رنگین کمان پیشنهاد نموده­اند. بطوریکه با خوراندن مقدار10 میلی گرم در کیلو گرم انروفلوکساسین به قزل آلای رنگین کمان در هرروز روند نزولی هر دو دارو را در نمونه­های بافتی عضلات، پوست و استخوان مورد بررسی قرار داده و با استفاده ازتکنیک HPLC (با ردیابی فلورسنس) در زمان­های مختلف بعد از انتهای دوره درمان میزان کاهش دارو را اندازه­گیری نمودند (Lucchetti et al., 2004). تولیدکنندگان ماهی ملزم به رعایت سطوح میزان مصرفی آنتی­بیوتیک­ها و مقررات مربوط به زمان­های پرهیز از مصرف برای آنتی­بیوتیک­های رایج در آبزی پروری هستند. از آنجائیکه واکنش­های فیزیولوژیک ماهیان تابع تغییرات دمای محیط است لذا میزان جذب و دفع داروهای تجویز شده نیز به موازات افزایش دمای آب تسریع می­یابد از این رو می­توان انتظار داشت در مناطق گرمتر متابولیسم داروها با سرعت بیشتری انجام شود (Bjorklund and Bylund, 1990). به عنوان مثال ماهی تیلاپیای نیل که یکی از ماهیان مناطق گرمسیری است و دمای مناسب برای زیست آن بین 24 تا 32 درجه است. با توجه به استفاده از آبهای جریان­دار در پرورش آن، میزان حذف دارو در این گونه ماهی خیلی سریع­تر از شرایط آزمایشگاهی است (Julie et al., 2002).

   استفاده از آنتی­بیوتیک­ها در امر کنترل و درمان بیماری­های باکتریایی به عنوان بخشی از برنامه تولیدی مدیران مزارع پرورش ماهی محسوب می­شود و شاید بتوان گفت که اولین سیاست برخوردی آبزی پروران با تلفات مشکوک به بیماری­های باکتریایی استفاده از این گونه ترکیبات است ولی نوع دارو، طرز استفاده، میزان و دوره مصرف و رعایت زمان پرهیز از مصرف از جمله مقرراتی است که بایستی هر مزرعه­دار نسبت به رعایت آن اهتمام لازم را به عمل آورد. ماهیان موجوداتی خونسرد بوده و تمام فعالیت­های فیزیولوژیک بدن آنها متأثر از دمای محیط است لذا در مصرف دارو نیز بایستی به این موضوع توجه خاص داشت. با توجه به نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر میزان باقی­ماندگی انروفلوکساسین به عنوان یکی از آنتی­بیوتیک­های پرمصرف در آبزی پروری در کبد و عضله ماهی قزل آلای رنگین کمان در گروه­های مختلف وزنی و در فصول و مناطق مختلف استان چهارمحال و بختیاری پائین­تر از حد مجاز پیشنهادی اتحادیه اروپا بوده و این ماهیان برای مصرف بایستی حداقل 500 الی 816  درجه روز دوره پرهیز از مصرف را بگذرانند تا سلامتی مصرف­کنندگان بعدی در معرض خطر نیفتد بطوریکه اگر دمای متوسط آبهای این مزارع 10 درجه سلسیوس باشد دوره اجتناب از مصرف دارو بین 50 الی 81 روز است. یکی دیگر از شواهد بدست آمده مطالعه حاضر مصرف آنتی­بیوتیک در اکثر گروه­های وزنی است که این موضوع بایستی از نظر مقررات دامپزشکی مورد بررسی قرار گرفته و نظارت هر بیشتر دستگاه­های مسؤل را می­طلبد.

 

سپاسگزاری

   نویسندگان مقاله وظیفه خود می­دانند از کلیه افرادی که در انجام تحقیق حاضر همکاری نموده­اند بالاخص حوزه معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد تشکر نمایند.

 

 

 

 

منابع

 

• Balizs, G. and Hewitt, A. (2003). Determination of veterinary drug residues by liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 492: 105-131.
• Bjorklund, H.V. and Bylund, G. (1990). Temperature-related absorption and excretion of oxytetracycline in rainbow trout (Salmo gairdneri R). Aquaculture, 84(3-4): 363-372.
• Commission of the European Communities (2003). Commission Decision 2003/181/EC of 13 March 2003 Amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin.
• Di Corcia, A. and Nazzari, M. (2002). Liquid chromatographic-mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacterial agents in animal food products. Journal of Chromatography A, 974(1-2): 53-89.
• Ding, S., Shen, J., Zhang, S., Jiang, H. and Sun, Z. (2005). Determination of chloramphenicol residue in fish and shrimp tissues by gas chromatography with a microcell electron capture detector. The Journal of AOAC International, 88(1): 57-60.
• Dulopnt, H.L. (1989). Quinolone antibacterial agents in the management of bacterial enteric infections. In: Wolfson, J.S., Hooper, D.C. (Editors), Quinolone Antibacterial Agents. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 5-34.
• European Commission (2008). Council Regulation 2377/90/EC, Off. J.Eur.Union, L224-www.emea.eu.int
• FAO (2008). State of World Fisheries and Aquaculture (SOFIA), Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome.
• Hernández Serrano, P. (2005). Responsible use of antibiotics in aquaculture. FAO, Rome.
• Horie, M. and Takegami, H. (2006). Legal restriction on veterinary drug residues and analysis of residual veterinary drug in food by LC/MS (Japanese, English Abstract). Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan, 54:91-96.
• Huet, A., Charlier, C., Tittlemier, S.A., Singh, G., Benrejeb, S. and Delahaut, P. (2006). Simultaneous determination of (Xuoro) quinolone antibiotics in kidney, marine products, eggs, and muscle by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Journal of Agriculture and Food Chemistry, 54: 2822-2827.
• Juan-Garca, A., Font, G. and Pic, Y. (2006). Electrophoresis, 27: 2240-2249.
• Julie, B.W., Graham, B., Mary, C.C., Bebak-Williams, J., Bullock, G. and Carson, M.C. (2002). Oxytetracycline residues in a freshwater recirculating system. Aquaculture, 205(3-4): 221-230.
• Lucchetti, D., Fabrizi, L., Guandalini, E., Podestà, E., Marvasi, L., Zaghini, A. and Coni, E. (2004). Long Depletion Time of Enrofloxacin in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(10): 3912-3917.
• Lucchetti, D., Fabrizi, L., Esposito, A., Guandalini, E., Pasquale, M. and Coni, E. (2005). Simple confirmatory method for the determination of erythromycin residues in trout: a fast liquid-liquid extraction followed by liquid chromatography-tandem mass. Spectrometry. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 53: 9689-9694.
• Niessen, W.M.A. (1998). Analysis of antibiotics by liquid chromatography-mass spectrometry (Review). Journal of Chromatography A, 812: 53-76.
• O'Grady, P., Moloney, M. and Smith, P.R. (1988). Bath administration of the quinolone antibiotic flumequine to brown trout (Salmo trutta) and Atlantic salmon (Salmon salar). Disease of Aquatic Organisms, 4: 27-33.
• Olutosin, R.I. and James, O.P. (2004). Simple rapid determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in bovine milk and plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Pharmaceutical and  Biomedical  Analalysis, 35: 43-153.
• Samanidou, V., Evaggelia, F. and Evaggelopoulou, N. (2007). Analytical strategies to determine antibiotic residues in fish. Journal of Separation Science, 30: 2549-2569.
• Sapkota, A., Sapkota, A.R., Kucharski, M., Burke, J., McKenzie,S., Walker,P. and Lawrence, R. (2008). Aquaculture practices and potential human health risks: Current knowledge and future priorities. Environment International, 34(8): 1215-1226.
• Soltani, M. (2010). Study of the residuals of some antibiotics in farmed rainbow trout in Chaharmahal va Bakhtiary province, project, No: 2439. Fishery organization of Chaharmahal va Bakhtiary province.
• Tittlemier, S.A., Van De Riet, I.J., Burns, G., Potter, R., Murphy, C., Rourke, W., Pearce, H.M. and Dufresne, G. (2007). Analysis of veterinary drug residues in fish and shrimp composites collected during the Canadian Total Diet Study, 1993-2004. Food Additives and Contaminants, 24(1): 14-20.
• Ueno, R., Sangrungruang, K. and Miyakawa, M. (1999). A simplified method for the determination of several fish drugs in edible fish and shrimp by high-performance liquid chromatography. Food Research International, 32(9): 629-633.
• Yolanda Pico, A.G.F. (2006). Determination of quinolone residues in chicken and fish by capillary electrophoresis mass spectrometry. Electrophoresis, 27: 2240-2249.

مراجع

• Balizs, G. and Hewitt, A. (2003). Determination of veterinary drug residues by liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 492: 105-131.
• Bjorklund, H.V. and Bylund, G. (1990). Temperature-related absorption and excretion of oxytetracycline in rainbow trout (Salmo gairdneri R). Aquaculture, 84(3-4): 363-372.
• Commission of the European Communities (2003). Commission Decision 2003/181/EC of 13 March 2003 Amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin.
• Di Corcia, A. and Nazzari, M. (2002). Liquid chromatographic-mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacterial agents in animal food products. Journal of Chromatography A, 974(1-2): 53-89.
• Ding, S., Shen, J., Zhang, S., Jiang, H. and Sun, Z. (2005). Determination of chloramphenicol residue in fish and shrimp tissues by gas chromatography with a microcell electron capture detector. The Journal of AOAC International, 88(1): 57-60.
• Dulopnt, H.L. (1989). Quinolone antibacterial agents in the management of bacterial enteric infections. In: Wolfson, J.S., Hooper, D.C. (Editors), Quinolone Antibacterial Agents. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 5-34.
• European Commission (2008). Council Regulation 2377/90/EC, Off. J.Eur.Union, L224-www.emea.eu.int
• FAO (2008). State of World Fisheries and Aquaculture (SOFIA), Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome.
• Hernández Serrano, P. (2005). Responsible use of antibiotics in aquaculture. FAO, Rome.
• Horie, M. and Takegami, H. (2006). Legal restriction on veterinary drug residues and analysis of residual veterinary drug in food by LC/MS (Japanese, English Abstract). Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan, 54:91-96.
• Huet, A., Charlier, C., Tittlemier, S.A., Singh, G., Benrejeb, S. and Delahaut, P. (2006). Simultaneous determination of (Xuoro) quinolone antibiotics in kidney, marine products, eggs, and muscle by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Journal of Agriculture and Food Chemistry, 54: 2822-2827.
• Juan-Garca, A., Font, G. and Pic, Y. (2006). Electrophoresis, 27: 2240-2249.
• Julie, B.W., Graham, B., Mary, C.C., Bebak-Williams, J., Bullock, G. and Carson, M.C. (2002). Oxytetracycline residues in a freshwater recirculating system. Aquaculture, 205(3-4): 221-230.
• Lucchetti, D., Fabrizi, L., Guandalini, E., Podestà, E., Marvasi, L., Zaghini, A. and Coni, E. (2004). Long Depletion Time of Enrofloxacin in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(10): 3912-3917.
• Lucchetti, D., Fabrizi, L., Esposito, A., Guandalini, E., Pasquale, M. and Coni, E. (2005). Simple confirmatory method for the determination of erythromycin residues in trout: a fast liquid-liquid extraction followed by liquid chromatography-tandem mass. Spectrometry. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 53: 9689-9694.
• Niessen, W.M.A. (1998). Analysis of antibiotics by liquid chromatography-mass spectrometry (Review). Journal of Chromatography A, 812: 53-76.
• O'Grady, P., Moloney, M. and Smith, P.R. (1988). Bath administration of the quinolone antibiotic flumequine to brown trout (Salmo trutta) and Atlantic salmon (Salmon salar). Disease of Aquatic Organisms, 4: 27-33.
• Olutosin, R.I. and James, O.P. (2004). Simple rapid determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in bovine milk and plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Pharmaceutical and  Biomedical  Analalysis, 35: 43-153.
• Samanidou, V., Evaggelia, F. and Evaggelopoulou, N. (2007). Analytical strategies to determine antibiotic residues in fish. Journal of Separation Science, 30: 2549-2569.
• Sapkota, A., Sapkota, A.R., Kucharski, M., Burke, J., McKenzie,S., Walker,P. and Lawrence, R. (2008). Aquaculture practices and potential human health risks: Current knowledge and future priorities. Environment International, 34(8): 1215-1226.
• Soltani, M. (2010). Study of the residuals of some antibiotics in farmed rainbow trout in Chaharmahal va Bakhtiary province, project, No: 2439. Fishery organization of Chaharmahal va Bakhtiary province.
• Tittlemier, S.A., Van De Riet, I.J., Burns, G., Potter, R., Murphy, C., Rourke, W., Pearce, H.M. and Dufresne, G. (2007). Analysis of veterinary drug residues in fish and shrimp composites collected during the Canadian Total Diet Study, 1993-2004. Food Additives and Contaminants, 24(1): 14-20.
• Ueno, R., Sangrungruang, K. and Miyakawa, M. (1999). A simplified method for the determination of several fish drugs in edible fish and shrimp by high-performance liquid chromatography. Food Research International, 32(9): 629-633.
• Yolanda Pico, A.G.F. (2006). Determination of quinolone residues in chicken and fish by capillary electrophoresis mass spectrometry. Electrophoresis, 27: 2240-2249.