جداسازی، شناسایی و تعیین بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری‌زا از شیرهای پاستوریزه

بهداشت مواد غذایی

مقاله 3، دوره 1، 4 زمستان، اسفند 1390، صفحه 23-35   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

شهرام حنیفیان^*

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه علوم و صنایع غذایی، تبریز، ایران

چکیده

   به منظور بررسی وجود سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا در شیر پاستوریزه، طی سال­ 1390 تعداد 242 نمونه شیر پاستوریزه عرضه شده در تبریز جمع­آوری گردید. نمونه­ها در محیط PSBB غنی­سازی شد و از ژن­های ail و  virFبه عنوان توالی­های هدف برای ردیابی سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه­های غنی­ شده استفاده گردید. از نمونه­های مثبت در آزمایش PCR در محیط CIN آگار وMacConkey آگار کشت داده شد و پرگنه­های مشکوک با duplex-PCRتأیید گردید. جهت تعیین بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکا،جدایه­ باکتری به وسیله آزمون­های بیوشیمیایی مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین شمارش تعداد
باکتری­های شاخص بهداشتی و آزمون کیفی فسفاتاز قلیایی (ALP) بر روی نمونه­های شیر پاستوریزه انجام یافت. یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در 61/6% (16 نمونه) از نمونه­های شیر پاستوریزه با روش ail-PCR ردیابی گردید. در حالی که 13/4% (10 نمونه) از نمونه­ها با روش virF-PCRمثبت تشخیص داده شد. از بین نمونه­های مثبت در آزمایش PCR، فقط 41/0% (1 نمونه) به وسیله کشت جداسازی و با duplex-PCR تأیید گردید. بر اساس آزمایش­های بیوشیمیایی، جدایه یرسینیا انتروکولیتیکا ازنوع بیوتیپ 4 تعیین گردید. طبق نتایج مطالعه، 57/11% (28 نمونه) از نمونه­های شیر پاستوریزه ALP مثبت بودند و تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی در این نمونه­ها در قیاس با نمونه­های ALP منفی تفاوت معنی­دار (01/0>p) نشان داد. با توجه به حساسیت زیاد یرسینیا انتروکولیتیکا نسبت به حرارت پاستوریزاسیون، لذا آلودگی ثانویه می­تواند دلیل اصلی حضور یرسینیا انتروکولیتیکای زنده در شیر پاستوریزه باشد.  

کلیدواژه‌ها

شیر پاستوریزه؛ یرسینیا انتروکولیتیکا؛ PCR؛ Ail؛ VirF

اصل مقاله

جداسازی، شناسایی و تعیین بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا از شیرهای پاستوریزه

 

شهرام حنیفیان^*

 

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه علوم و صنایع غذایی، تبریز، ایران.

^*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 21/3/91  پذیرش نهایی: 6/4/91)

 

 

 

چکیده

   به منظور بررسی وجود سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا در شیر پاستوریزه، طی سال­ 1390 تعداد 242 نمونه شیر پاستوریزه عرضه شده در تبریز جمع­آوری گردید. نمونه­ها در محیط PSBB غنی­سازی شد و از ژن­های ail و  virFبه عنوان توالی­های هدف برای ردیابی سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه­های غنی­ شده استفاده گردید. از نمونه­های مثبت در آزمایش PCR در محیط CIN آگار وMacConkey آگار کشت داده شد و پرگنه­های مشکوک با duplex-PCRتأیید گردید. جهت تعیین بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکا،جدایه­ باکتری به وسیله آزمون­های بیوشیمیایی مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین شمارش تعداد
باکتری­های شاخص بهداشتی و آزمون کیفی فسفاتاز قلیایی (ALP) بر روی نمونه­های شیر پاستوریزه انجام یافت. یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در 61/6% (16 نمونه) از نمونه­های شیر پاستوریزه با روش ail-PCR ردیابی گردید. در حالی که 13/4% (10 نمونه) از نمونه­ها با روش virF-PCRمثبت تشخیص داده شد. از بین نمونه­های مثبت در آزمایش PCR، فقط 41/0% (1 نمونه) به وسیله کشت جداسازی و با duplex-PCR تأیید گردید. بر اساس آزمایش­های بیوشیمیایی، جدایه یرسینیا انتروکولیتیکا ازنوع بیوتیپ 4 تعیین گردید. طبق نتایج مطالعه، 57/11% (28 نمونه) از نمونه­های شیر پاستوریزه ALP مثبت بودند و تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی در این نمونه­ها در قیاس با نمونه­های ALP منفی تفاوت معنی­دار (01/0>p) نشان داد. با توجه به حساسیت زیاد یرسینیا انتروکولیتیکا نسبت به حرارت پاستوریزاسیون، لذا آلودگی ثانویه می­تواند دلیل اصلی حضور یرسینیا انتروکولیتیکای زنده در شیر پاستوریزه باشد. 

 

واژه­های کلیدی: شیر پاستوریزه، یرسینیا انتروکولیتیکا، PCR، Ail، VirF

 

 

 

  

مقدمه

   یرسینیا انتروکولیتیکا به عنوان عضوی از خانواده آنتروباکتربایسه، یک باکتری گرم منفی، میله­ای کوتاه،
بی­هوازی اختیاری و فاقد اسپور است. از لحاظ ابعاد سلولی کوچک­تر از سایر اعضای خانواده آنتروباکتریاسه است و از این لحاظ بیشتر به اعضای خانواده پاستورلاسه شباهت دارد. در صورتی که یرسینیا انتروکولیتیکا در حرارت ۳۷ درجه سلسیوس رشد نماید، به صورت اشکال متنوع و متشکل از سلول­های کروی و میله­ای شکل دیده شود (Weagant and Feng, 2001).

   یرسینیا انتروکولیتیکا پراکندگی زیادی در طبیعت دارد و به طور معمول از آب­های سطحی (آب رودخانه­ها و دریاچه­ها)، خاک و فضولات دامی جداسازی شده است. لوله گوارشی حیوانات اهلی و وحشی نظیر خوک، گاو، سگ، جوندگان و پرندگان به عنوان مخزن باکتری محسوب می­گردند (Robins-Browne and Hartland, 2003; Hanifian and Khani, 2012a). مطالعات متعدد نشان می­دهند، مهم­ترین مخزن یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا لوله گوارشی خوک است (Hudson et al., 2008). یرسینیا انتروکولیتیکا از مواد غذایی مختلف جداسازی شده است و ارتباط بین بیماری انسان و مصرف غذا و آب آلوده کاملاً به اثبات رسیده است (Weagant and Feng, 2001). گوشت گاو، گوشت ماکیان، شیر خام و فرآورده­های غیرپاستوریزه آن (Hanifian and Karim, 2006)، توفو (لخته شیر سویا) و آب غیرکلرینه می­توانند به عنوان منبع بالقوه­ای برای آلودگی انسان باشند (Weagant and Feng, 2001; Thisted Lambertz and Danielsson-Tham, 2005). 

   یرسینیا انتروکولیتیکا عامل یرسینیوزیس در انسان است و علایم آن از اسهال ملایم و محدود شونده تا لنفادنیت مزانتریک که ممکن است به آپاندیسیت منتهی شود، متغیر است (Grant et al., 1998). شدت علایم بالینی این عفونت تا حدود زیادی به سن، وضعیت جسمانی فرد مبتلا، وجود یا عدم وجود بیماری­های زمینه­ای (underlying diseases) و همچنین سروتیپ باکتری بستگی دارد. گاستروآنتریت معمول­ترین علامت بالینی یرسینیوزیس است که اغلب در اطفال و کودکان زیر 5 سال مشاهده می­گردد (Robins-Browne and Hartland, 2003). در کودکان بالای 5 سال و در افراد بالغ یرسینیوزیس حاد به شکل سندرم شبه­آپاندیسیت بروز می­یابد و اغلب به اشتباه آپاندیسیت تشخیص داده می­شود. عفونت با یرسینیا انتروکولیتیکا گاهی اوقات عوارض مزمن خارج روده­ای نظیر آرتریت، اریتمانودوزوم (erythema nodosum)، التهاب عنبیه، گلومرونفریت و میوکاردیت ایجاد می­کند (Weagant et al., 1998).

   یرسینیا انتروکولیتیکا بدلیل قابلیت رشد و تکثیر در دماهای پایین­تر از ۴ درجه سلسیوس (Hanifian, 2009) از سایر باکتری­های بیماری­زای روده­ای متمایز می­گردد. زمان تقسیم سلولی آن در دمای مطلوب (29-26 درجه سلسیوس) حدود ۳۴ دقیقه است و این مقدار در ۷ درجه سلسیوس به ۵ ساعت افزایش پیدا می­کند. این باکتری می­تواند در گوشت پخته گاو و خوک در دمای ۲۵ درجه سلسیوس در طی ۲۴ ساعت و یا  در ۷  درجه سلسیوس و مدت ۱۰ روز به بیش از یک میلیون برابر تعداد اولیه خود برسد (Robins-Browne and Hartland, 2003). یرسینیا انتروکولیتیکا نسبت به انجماد مقاوم است و می­تواند متعاقب انجماد و رفع انجماد مکرر مواد غذایی، بقای خود را برای مدت زمان طولانی حفظ نماید (Robins-Browne and Hartland, 2003). در مطالعاتی که جهت ارزیابی بقای یرسینیا انتروکولیتیکا در مواد غذایی تلقیح شده انجام گرفته است، نتایج حاکی از بقای بهتر و طولانی­تر این باکتری در دمای یخچال و دمای اتاق در مقایسه با دمای بینابینی می­باشد (Hanifian and Khani, 2012b). همچنین یرسینیا انتروکولیتیکا در غذاهای حرارت دیده­ای که در شرایط سرد نگه­داری می­شوند به مدت طولانی­تری باقی می­ماند. به نظر می­رسد، دلیل این حالت دسترسی بیشتر باکتری به مواد مغذی در غذاهای پخته و نیز از بین رفتن میکروارگانیسم­های سرماگرای رقیب و سویه­های غیربیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا باشد (Robins-Browne and Hartland, 2003).   

   در ایران مطالعاتی در ارتباط با وجود یرسینیا انتروکولیتیکا در شیر پاستوریزه انجام یافته است (Soltan-Dallal et al., 2004; Sharifzadeh et al., 2005). هر چند یافته­های این­ مطالعات حاکی از عدم وجود یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه­های شیر پاستوریزه می­باشد؛ اما با توجه به میانگین شیوع 62/7 درصدی یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در شیر­های خام منطقه آذربایجان­شرقی (Hanifian and Khani, 2012a)، در صورت عدم پاستوریزاسیون موثر و یا آلودگی ثانویه، احتمال وجود این باکتری در شیرهای پاستوریزه وجود خواهد داشت. لذا در این مطالعه، تلفیقی از روش­های کشت و PCR که در مقایسه با بکارگیری انفرادی هر یک از این روش­ها، حساسیت بسیار بیشتری در یافتن ارگانیسم­ها دارند، برای ردیابی سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا در شیر پاستوریزهاستفاده گردید. همچنین نمونه­های شیر پاستوریزه از نظر غیرفعال شدن آنزیم فسفاتاز قلیایی (ALP) متعاقب فرآیند پاستوریزاسیون و نیز تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

مواد و روش­ها

- روش نمونه­گیری

   تعداد 242 نمونه­ شیر پاستوریزه از بخش­های مختلف شهر تبریز طی یک دوره 10 ماهه (از اردیبهشت تا بهمن ماه سال­ 1390) از محصولات 15 کارخانه مختلف تولید کننده شیر پاستوریزه جمع­آوری و در شرایط سرد به آزمایشگاه منتقل شد. با هدف بررسی کفایت فرایند پاستوریزاسیون در شیر پاستوریزه، آزمایش ALP کیفی (Lactognost, Germany) بر روی نمونه­ها صورت پذیرفت (Anzabi and Hanifian, 2012). سپس آزمایش­های مربوط به جستجوی یرسینیا انتروکولیتیکا و همچنین شمارش باکتری­های شاخص بهداشتی بر روی نمونه­های شیر پاستوریزه انجام گرفت. 

- نحوه غنی­سازی نمونه­ها

   ابتدا نمونه­های شیر پاستوریزه به طور کامل مخلوط و یکنواخت گردید. سپس مقدار 25 میلی­لیتر از نمونه با 225 میلی­لیتر محیط غنی­کننده PSBB (Peptone Sorbitol Bile Broth) به مدت 5 دقیقه مخلوط شد. مخلوط حاصل به مدت 10 روز در دمای 10 درجه سلسیوس غنی­سازی گردید (Weagant et al., 1998).

- آماده­سازی نمونه­های غنی­شده برای آزمایش PCR و کشت

   در انتهای دوره غنی­سازی، دو مقدار 1 میلی­لیتری از نمونه غنی­شده به دو تیوب 2 میلی­لیتری انتقال یافت. تیوب­ها به مدت 5 دقیقه در سانتریفیوژ با شتاب×g  16099 رسوب داده شد (Hanifian and Khani, 2012a). رسوب تیوب اول برای استخراجDNA  استفاده گردید و رسوب تیوب دوم در 200 میکرولیتر فسفات بافر حل شد و پس از افزودن گلیسرول (10 درصد) استریل، در 70- درجه سلسیوس نگه­داری گردید تا در صورت مثبت شدن نتایج آزمایش PCR مرحله اول، برای آزمایش کشت مورد استفاده قرار گیرد (Hanifian and Khani, 2012a).

- انتخاب پرایمر

   ژن کروموزومی ail و ژن پلاسمیدی virF در مطالعات متعدد برای ردیابی و شناسایی سویه­های حاد یرسینیا انتروکولیتیکا مورد استفاده قرار گرفته­اند (Thisted Lambertz and Danielsson-Tham, 2005; Fredriksson-Ahomaa, et al., 2007; Hudson et al., 2008; Hanifian and Khani, 2012b). در این مطالعه نیز برای ردیابی و شناسایی سویه­های حاد و بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا در آزمایش PCR، ژن­های ail و virF به عنوان توالی هدف انتخاب شدند. برای این منظور از پرایمرهای با مشخصات مندرج در جدول (1) استفاده گردید.

 

 

جدول 1: نام ژن، نام و مشخصات پرایمرهای مورد استفاده و اندازه توالی هدف در آزمایش PCR جهت ردیابی و شناسایی سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا

نام ژن	نام پرایمر	توالی پرایمر	اندازه توالی (bp)	منبع
ail	9 A	5¢-GTT TAT CAA TTG CGT CTG TTA ATG TGT ACG-3¢	454	Thisted Lambertz and Danielsson-Tham
	10 A	5¢-CTA TCG AGT TTG GAG TAT TCA TAT GAA GCG-3¢
virF	11 A	5¢-AAG GTT GTT GAG CAT TCA CAA GAT GG-3¢	700	Thisted Lambertz and Danielsson-Tham
	12 A	5¢-TTT GAG TGA AAT AAG ACT GAC TCG AGA ACC-3¢

 

- ردیابی یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه­های غنی­شده با روش PCR

   برای استخراج DNA از روش Vishnubhatla et al., 2000 استفاده شد و DNA استخراج شده در 50 میکرولیتر آب یون­زدایی شده (deionized) عاری از DNA/RNA حل گردید. مخلوط واکنش در آزمایش PCR شامل 5/12 میکرولیتر مسترمیکس ×2 (Fermentas, Germany)، 60 پیکومول از هر جفت پرایمر (Eurofins, Germany) و 25 نانوگرم DNA الگو بود که با افزودن آب یون­زدایی شده عاری از DNA/RNA (CinnaGen, Iran) به حجم نهایی 25 میکرولیتر رسید. از سویه استاندارد یرسینیا انتروکولیتیکا (DSM 11502) (DSM, Germany) به عنوان کنترل مثبت واکنش PCR و از نمونه حاوی آب یون­زدایی شده عاری از DNA/RNA به جای DNA الگو به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. واکنش PCR با دستگاه ترمال­سایکلر (Eppendorf AG, Germany) و طی مراحل دمایی و زمانی زیر انجام گرفت: یک مرحله دمایی 94 درجه سلسیوس به مدت 4 دقیقه برای دناتوراسیون مقدماتی (initial denaturation) آغاز گردید. سپس 35 سیکل متوالی شامل 94 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه جهت دناتوراسیون، 60 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه برای چسبیدن پرایمرها (annealing) و 72 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه جهت توسعه (extension) توالی هدف و در نهایت یک مرحله دمایی 72 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه برای توسعه نهایی (final extension) اعمال گردید (Thisted Lambertz and Danielsson- Tham, 2005). محصول PCR (باند bp 454 ژن ail و  bp 700 ژن virF) متعاقب ­الکتروفورز ژل آگارز (1 درصد) (Invitrogen, USA) و رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید (5/0 میلی­گرم در میلی­لیتر) (Merck, Germany) ارزیابی گردید.

- جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکولیتیکا با روش کشت

   نمونه­های غنی شده­ای که در آزمایش  PCRمرحله اول واجد حداقل یکی از ژن­های ail یا virF  تشخیص داده شدند، از نمونه ذخیره شده مربوطه (که در در 70- درجه سلسیوس نگه­داری شده بود) متعاقب تیمار قلیایی (پتاس 5/0 درصد به مدت 5 ثانیه) در محیط (cefsulodin irgasan novobiocin) CIN آگار حاوی مکمل آنتی­بیوتیکی CIN (Merck, Germany) و همچنین مک­کانکی آگار (Merck, Germany) کشت داده شد (Hanifian and Khani, 2012b). محیط­ها در 30 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرمخانه­گذاری گردید. در محیط CIN آگار پرگنه­های با قطر 2-1 میلی­متر، با رنگ قرمز تیره در مرکز پرگنه و دارای حاشیه مشخص (red bull’s eye) و پرگنه­های با قطر 2-1 میلی­متر و بی­رنگ در مک­کانکی آگار انتخاب گردید (Weagant and Feng, 2001). پرگنه­های انتخاب شده در محیط BHI آگار (Merck, Germany) به صورت خطی کشت داده شد تا ضمن ارزیابی خالص بودن کشت، باکتری در محیط عمومی احیا شده و نتایج دقیقی در آزمون­های بیوشیمیایی با هدف تعیین بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکا ایجاد نماید (Weagant and Feng, 2001). به منظور تأیید بیماریزا بودن جدایه­های به دست آمده، تعداد 2 پرگنه از محیط BHI آگار برای استخراج DNA و بررسی وجود ژن­های عامل ویرولانت ail و virF استفاده گردید. پرگنه­های تأیید شده با روش PCR برای تعیین بیوتیپ باکتری تحت آزمایش­های بیوشیمیایی معینی (جدول 2) قرار گرفت. 

- تعیین بیوتیپ جدایه­های یرسینیا انتروکولیتیکا

   از آن جایی که یرسینیا انتروکولیتیکاهای بیماری­زا به بیوتیپ­های خاصی تعلق دارند، بنابراین برای تعیین بیوتیپجدایه­های یرسینیا انتروکولیتیکا، آزمون­های بیوشیمیایی مندرج در جدول (2) که بر گرفته از روش Wauters می­باشد، بر روی جدایه­های یرسینیا انتروکولیتیکا انجام گرفت و نتایج بدست آمده با جدول مربوطه مقایسه گردید (Weagant and Feng, 2001).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2: آزمون­های بیوشیمیایی جهت تعیین بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکا ⁽¹⁾

آزمون بیوشیمیایی	A 1	B 1	2	3	4	5	6
لیپاز	+	+	-	-	-	-	-
اسکولین/سالیسین	+/-	-	-	-	-	-	-
ایندول	+	+	(+) (2)	-	-	-	-
زایلوز	+	+	+	+	-	V (3)	+
ترهالوز	+	+	+	+	+	-	+
پیرازین­آمیداز	+	-	-	-	-	-	+
بتادی­گلوکوزیداز	+	-	-	-	-	-	-
وژ-پروسکوئر	+	+	+	+/-	+	(+) (2)	-

⁽¹⁾ بر اساس روش Wauters؛ ⁽²⁾ واکنش تأخیری؛ ⁽³⁾ واکنش متغیر

 

- آزمایش­های میکروبی نمونه­های شیر پاستوریزه

   با هدف بررسی وضیعت میکروبی نمونه­های شیر پاستوریزه، شمارش باکتری­های شاخص بهداشتی شامل باکتری­های مزوفیل­ هوازی، کلی­فرم­ها و انتروکوک­ها انجام گرفت. ابتدا لوله­های سریال رقت (^1-10 تا ^6-10) با استفاده از آب پپتونه (Merck, Germany) 01/0 درصد تهیه گردید. جهت شمارش باکتری­های مزوفیل هوازی از محیط پلیت کانت آگار (Merck, Germany) به صورت کشت مخلوط (pour-plate) در دمای 32 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت و برای شمارش کلی­فرم­ها از محیط ویولت رد بایل آگار (Merck, Germany) در 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت (Hanifian and Khani, 2012b) استفاده گردید. هم­چنین شمارش انتروکوک­ها در محیط کانامایسین اسکولین آزاید آگار (Merck, Germany) در دمای 42 درجه سلسیوس به مدت 3 روز در شرایط هوازی صورت پذیرفت (Domig et al., 2003).

 

- تجزیه و تحلیل آماری

   نتایج حاصل از شمارش گروه­های مختلف باکتریایی ابتدا به مقیاس لگاریتمی تبدیل گردید و سپس آنالیزهای توصیفی (میانگین و انحراف معیار) بر روی داده­های مزبور، انجام گرفت (SPSS, Version 17). تفاوت تعداد باکتری­ها (مزوفیل­های هوازی، کلی­فرم­ها و انتروکوک­ها) در نمونه­های شیر ALP مثبت و منفی با آنالیز واریانس (ANOVA) و آزمون دانکن (Duncan’s test) در سطح احتمال 1 درصد مقایسه گردید.

یافته­ها

در جدول (3) نتایج جستجوی یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در شیر پاستوریزه با روش کشت و PCR نشان داده شده است. همچنین در این جدول به نتایج آزمون­های میکروبی، ALP و نوع بیوتیپ یرسینیا انتروکولیتیکا اشاره شده است. از مجموع 242 نمونه شیر پاستوریزه، یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در 16 نمونه (61/6%) با استفاده از ژن ail و در 10 نمونه (13/4%) با بکارگیری ژن virF به عنوان توالی هدف ردیابی شد. از این تعداد، 5 نمونه شیر پاستوریزه دارای نتیجه مثبت در آزمایش ALP بودند. بر اساس نتایج آزمون­های بیوشیمیایی انجام شده بر روی جدایه یرسینیا انتروکولیتیکا و تطبیق آن با نتایج جدول (2)، باکتری جداسازی شده از شیر پاستوریزه از نوع بیوتیپ 4 تعیین گردید (جدول 3).

 

 

جدول 3: موارد مثبت یرسینیا انتروکولیتیکا در آزمایش PCR و نتایج سایر آزمون­ها در نمونه­های شیر پاستوریزه.

شماره نمونه	کشت	PCR				ALP	بیوتیپ
		Ail	virF		AMB			C­	E
17	-	+	+		32/3	90/0	59/1		-	-
22	-	+	+		68/4	26/2	19/2		+	-
39	-	+	-		39/5	69/0	36/1		-	-
54	-	+	+		41/4	30/0	20/1		-	-
86	-	+	+		64/4	(**)ND	95/0		-	-
101	-	+	+		13/5	30/0	90/0		-	-
103	-	+	-		88/3	47/0	85/0		-	-
118	-	+	-		44/4	92/1	94/1		+	-
132	-	+	+		52/4	47/0	04/1		-	-
147	-	+	-		50/3	30/2	99/1		+	-
149	+	+	-		62/4	50/2	34/2		+	4
165	-	+	+		77/3	ND	ND		-	-
177	-	+	+		34/4	30/0	00/1		-	-
191	-	+	+		41/5	75/2	92/2		+	-
208	-	+	+		68/4	69/0	60/0		-	-
211	-	+	-		19/3	ND	30/0		-	-
کل	1	16	10

^(*) HIB: باکتری­های شاخص بهداشتی؛ AMB: باکتری­های مزوفیل­­ هوازی؛ C: کلی­فرم؛ E: انتروکوک. ^(**) عدم ردیابی

  

 

از مجموع 16 نمونه غنی­سازی شده شیر پاستوریزه که در مرحله اول آزمایش PCR مثبت تشخیص داده شدند (جدول 3)، یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا فقط از 1 نمونه با روش کشت جداسازی و با duplex-PCR (با استفاده از ژن­های ail و virF) تأیید گردید (شکل 1). از 15 نمونه مثبت باقی­مانده، یرسینیا انتروکولیتیکای
 بیماری­زا جداسازی نشد.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: ژل الکتروفورز و رنگ­آمیزی محصول PCR با اتیدیوم بروماید و مشاهده باندهای مربوط به ژن­های ail (bp 454) و virF (bp 700) یرسینیا انتروکولیتیکا. L: DNA ladder با اندازه bp 100؛ P: شاهد مثبت؛ N: شاهد منفی؛ شماره­های 1، 2 و 4 نتایج منفی و شماره 3: نتیجه مثبت.

  

 

نمونه­های شیر پاستوریزه بر اساس نتیجه آزمایش ALP به دو دسته ALP مثبت و منفی تقسیم شدند. در جدول (4) به تعداد و درصد نمونه­ها و هم­چنین به میانگین تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی در هر گروه اشاره شده است. بر اساس نتایج بدست آمده، از مجموع 242 نمونه شیر پاستوریزه 28 نمونه (57/11%) نتیجه مثبت در آزمون ALP نشان دادند. به علاوه تفاوت تعداد باکتری­های مزوفیل هوازی، کلی­فرم­ها­ و انتروکوک­ها (باکتری­های شاخص بهداشتی) در نمونه­های ALP مثبت و منفی از نظر آماری (ANOVA) و آزمون دانکن (Duncan’s test) معنی­دار (01/0>p) بود.

 

جدول 4: نتیجه آزمون ALP و تعداد (میانگین ± انحراف معیار) باکتری­های شاخص بهداشتی در نمونه­های شیر پاستوریزه

فسقاتاز قلیایی

تعداد

درصد

(*)  HIB (log cfu/ml)

AMB

C

E

منفی

214

43/88

a24/0 ± 11/3

a18/0 ± 60/0

a06/0 ± 77/0

مثبت

28

57/11

b81/0 ± 55/5

b78/0 ± 21/3

b54/0 ± 37/2

^(*)HIB: باکتری­های شاخص بهداشتی؛ AMB: باکتری­های مزوفیل­­ هوازی؛ C: کلی­فرم­ها؛ E: انتروکوک­ها.

a و b: حروف غیرمشترک در هر ستون بیانگر تفاوت معنی­دار (01/0>p) بین میانگین­ تعداد گروه­های باکتریایی است.

 

بحث و نتیجه­گیری

   با توجه به نتایج جدول (3) میزان شیوع یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا با روش کشت 41/0 درصد (1 مورد از 242 نمونه) برآورد گردید. در حالی که با روش PCR بر پایه ژن ail، یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در 61/6 درصد (16 مورد از 242 نمونه) و با روش PCR بر پایه ژن virF در 13/4 درصد (10 مورد از 242 نمونه) از نمونه­ها تشخیص داده شد. در مطالعات متعدد که با هدف تعیین میزان شیوع یرسینیا انتروکولیتیکا در مواد غذایی انجام یافته است، میزان شیوع این باکتری با روش PCR به طور قابل ملاحظه­ای بالاتر از روش­های کشت گزارش گردیده است (Fredriksson-Ahomaa et al., 2000; Skurnik et al., 2010; Hanifian and Khani, 2012a). در این مطالعه نیز نتایج به دست آمده نشان داد، در مقایسه با روش کشت متداول، روش virF-PCR با 10 برابر حساسیت بیشتر و روش ail-PCR با 16 برابر حساسیت بالاتر یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زارادر نمونه­های شیر پاستوریزه ردیابی نموده است. این موضوع بیانگر حساسیت بیشتر روش PCR در مقایسه با روش کشت جهت ردیابی یرسینیا انتروکولیتیکا می­باشد. اما باید توجه داشت که روش PCR قادر به تفریق ارگانیسم­های زنده و مرده نمی­باشد و این موضوع صحت نتایج مثبت در آزمون PCR را تحت تأثیر قرار می­دهد.

   جداسازی یرسینیا انتروکولیتیکا با استفاده از
روش­های کشت در محیط­های انتخابی، در کنار زمان­بر بودن از دقت عمل کمتری برخوردار است. به علاوه، در حال حاضر روش کشت جامعی وجود ندارد تا بتوان با بکارگیری آن تمامی سویه­های یرسینیا انتروکولیتیکا را جداسازی نمود. بنابراین در بررسی­های به عمل آمده، شیوع کم یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه­های غذایی
می­تواند در نتیجه حساسیت پایین روش­های کشت باشد (Fredriksson-Ahomaa and Korkeala, 2003). در ایران، نتایج مطالعاتی که بر پایه کشت و با هدف تعیین میزان شیوع یرسینیا انتروکولیتیکا در شیر خام و پاستوریزه انجام یافته است نشانگر شیوع بسیار کم این باکتری در شیر خام و عدم آلودگی در شیر پاستوریزه می­باشد (Soltan-Dallal et al., 2004; Sharifzade et al., 2005).

   نتایج به دست آمده این مطالعه نشان­دهنده تفاوت حساسیت ژن­های ail و virF در ردیابی یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زاست (جدول 3). تصور بر این است، به دلیل ماهیت ناپایدار پلاسمید یرسینیا انتروکولیتیکا که طی تجدید کشت، تقسیم سلولی و همچنین نگه­داری کشت در دماهای سرد به طور خود به خود حذف می­گردد، لذا روش PCR بر پایه ژن­های پلاسمیدی نظیر virFوyad Aدر مقایسه با روش­های PCR بر پایه ژن­های کروموزومی از جمله ail و inv از حساسیت کمتری برخوردار باشد (Hanifian and Khani, 2012b). لذا برای افزایش حساسیت روش جستجوی سویه­های بیماری­زای یرسینیا انتروکولیتیکا لازم است از روش­های PCR بر پایه ردیابی ژن­های کروموزومی استفاده نمود.

   آن چه بیش از جداسازی یرسینیا انتروکولیتیکا از نمونه­های غذایی و بالینی اهمیت دارد، تفریق سویه­های حاد و بیماریزای این باکتری از انواع غیربیماریزاست. چرا که در بین بیوسروتیپ­های متعدد یرسینیا انتروکولیتیکا، فقط تعداد محدودی در انسان بیماریزا هستند. متداول­ترین بیوسروتیپ­هایی که در سرتاسر جهان از موارد بیماری جداسازی شده­اند شامل 3:O/4، 9:O/2، 5:O/2، 27:O/2 و 8:O/B1 می­باشند (Hanifian and Khani, 2012a). با توجه به پراکندگی زیاد
سویه­های یرسینیا انتروکولیتیکا در محیط­های آبی، سطح گیاهان و روده برخی پستانداران، امکان جداسازی سویه­های غیر حاد و فاقد قدرت بیماری­زایی از مواد غذایی خام بسیار محتمل است (Robins-Browne and Hartland, 2003; Weagant et al., 1998). بنابراین تعیین بیماری­زا بودن باکتری با آزمون­هایی نظیر عدم رشد یرسینیا انتروکولیتیکا در محیط کشت فاقد کلسیم، مقاومت بالا نسبت به سرم خون انسان، قابلیت ایجاد التهاب ملتحمه در خوکچه هندی و یا تأیید وجود
ژن­های عامل ویرولانس (Browne and Hartland, 2003) متعاقب جداسازی آن­ها از مواد غذایی و یا نمونه­های بالینی حائز اهمیت است. بر همین اساس، در مطالعه اخیر از ژن کروموزومی ail و ژن پلاسمیدی virF و ردیابی آن­ها در نمونه­های غنی­ شده، به عنوان آزمون غربالگری (screening test) جهت پیشگویی حضور یا عدم حضور یرسینیا انتروکولیتیکای بیماریزا در
نمونه­های مورد آزمایش استفاده گردید. همچنین
پرگنه­های جدا شده با روش کشت از لحاظ وجود
ژن­های ail و virF مورد ارزیابی و شناسایی مجدد قرار گرفت (شکل 1).  

   طبق نتایج مطالعه، تعداد 28 نمونه (57/11%) شیر پاستوریزه ALP مثبت بودند. مقایسه میانگین تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی بین نمونه­های ALP مثبت و منفی نشان­­دهنده تفاوت 44/2، 61/2 و 60/1 واحد لگاریتمی به ترتیب بین باکتری­های مزوفیل هوازی، کلی­فرم­ها و انتروکوک­ها می­باشد. استاندارد ملی ایران (ISIRI No. 2406, 2008) حداکثر میزان مجاز تعداد مزوفیل­های هوازی (شمارش کلی) و کلی­فرم­ها را به ترتیب 10⁴×5/7 و 10 عدد تعیین نموده است. با توجه به نتایج به دست آمده (جدول 3 و جدول 4)، تعداد این باکتری­ها در نمونه­های ALP مثبت بیش از حد مجاز است. همچنین بالا بودن تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی در برخی از نمونه­های ALP منفی می­تواند در نتیجه نگه­داری شیرهای پاستوریزه در دماهای محیط در طی مدت زمان عرضه شیر باشد. در دمای محیط، شرایط برای رشد سریع­تر باکتری­های شاخص بهداشتی نظیر مزوفیل­های هوازی، کلی­فرم­ها و انتروکوک­ها فراهم می­گردد.

با توجه به این که عدد D (D-value) یرسینیا انتروکولیتیکا در 3/68 درجه سلسیوس 09/0 دقیقه (4/5 ثانیه) است، لذا این باکتری حتی در درجه حرارت­های کمتر از دمای پاستوریزاسیون HTST (76 درجه سلسیوس و مدت 15 ثانیه) به سرعت غیرفعال
می­گردد. مطالعات تلقیحی انجام یافته نشان داد، فرایند حرارتی برابر با 5/62 درجه سلسیوس برای مدت 15 ثانیه می­تواند تعداد 7 واحد لگاریتمی یرسینیا انتروکولیتیکا را به کمتر از 2/0 واحد لگاریتمی برساند (Pearce et al., 2012). در شیرهای پاستوریزه تولید شده در ایران که از دمای 76 درجه سلسیوس به مدت 15 ثانیه (Anzabi and Hanifian, 2012) استفاده
می­کنند، حتی در صورت عدم اعمال دقیق دما و زمان پاستوریزاسیون، یرسینیا انتروکولیتیکا غیرفعال می­گردد. بنابراین در مطالعه حاضر، مهمترین دلیل حضور یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در نمونه شیر پاستوریزه آلودگی ثانویه می­باشد. اگر چه یرسینیا انتروکولیتیکای بیماری­زا در 16 نمونه شیر پاستوریزه (اعم از ALP مثبت و منفی) ردیابی گردید، اما صرفاً در یک مورد باکتری زنده جداسازی شد. با توجه به این که در آزمایش PCR امکان تفریق زنده یا غیرزنده بودن ارگانیسم هدف میسر نمی­باشد؛ لذا نتایج مثبت آزمایش PCR به ویژه در غذاهای فرآوری شده نظیر شیر پاستوریزه، مستلزم جداسازی و شناسایی ارگانیسم زنده با روش کشت می­باشد (Anzabi and Hanifian, 2012). نتایج مطالعه نشان داد، نمونه شیر پاستوریزه­ای­ که بیوتیپ 4 یرسینیا انتروکولیتیکا از آن جداسازی و تأیید گردید، دارای نتیجه مثبت در آزمون ALP بود (جدول 4).

   انتروکوک­ها دسته دیگر از باکتری­های شاخص بهداشتی در مواد غذایی هستند. این باکتری­ها گسترش زیادی در طبیعت دارند و جزو فلور طبیعی روده حیوانات خونگرم و خونسرد و حتی حشرات می­باشند. انتروکوک­ها از طریق مدفوع دام­ها، آب و تجهیزات آلوده به شیر و فرآورده­های آن راه پیدا می­کنند. گزارشاتی در خصوص توانایی تحمل فرایند پاستوریزاسیون توسط انتروکوک­ها ارائه شده است (Hartman et al., 2001). در این مطالعه، انتروکوک­ها حتی در شیرهای پاستوریزه با ALP منفی ردیابی گردید که حاکی از توانایی تحمل فرایند پاستوریزاسیون توسط این باکتری­هاست. با این تفاوت که میانگین تعداد آن­ها در نمونه­های ALP منفی 77/0 واحد لگاریتمی و در ALP مثبت 37/2 واحد لگاریتمی برآورد گردید (جدول 4). تفاوت تعداد در نمونه­های ALP مثبت و منفی، نتیجه اثر فرآیند پاستوریزاسیون در کاهش تعداد انتروکوک­هاست. با ذکر این نکته که انتروکوک­ها درجات متفاوتی از تحمل حرارتی را دارند. به این معنی که انتروکوکوس فکالیس (Enterococcus faecalis) حساس­ترین گونه و انتروکوکوس دورانس (Enterococcus durans) مقاوم­ترین گونه نسبت به حرارت می­باشد (Hartman et al., 2001). با توجه به ویژگی فوق، می­توان شمارش انتروکوک­ها را در کنار سایر شاخص­های بهداشتی (شمارش کلی و شمارش کلی­فرم­ها) به طور متداول در شیر و فرآورده­های آن انجام داد. 

   با توجه به ردیابی یرسینیا انتروکولیتیکا در 61/6 درصد از نمونه­های شیر پاستوریزه با روش PCR و جداسازی یرسینیا انتروکولیتیکای زنده از 41/0 درصد نمونه­ها، این باکتری می­تواند به عنوان خطر بالقوه در ارتباط با مصرف شیرهای پاستوریزه­ای باشد که دچار آلودگی ثانویه شده­اند و یا احتمالاً فرآیند پاستوریزاسیون به طور موثر بر روی آن­ها اعمال نشده است. به ویژه آن که یرسینیا انتروکولیتیکا توانایی رشد و تزاید در طی مدت زمان نگه­داری مواد غذایی در یخچال را دارد و این مسأله بر اهمیت موضوع و میزان مخاطره بهداشتی می­افزاید. از آن جایی که حداقل توانایی بهترین روش­های کشت برای ردیابی یرسینیا انتروکولیتیکا، وجود تعداد 3 تا 4 واحد لگاریتمی از باکتری زنده و فعال می­باشد (Fredriksson-Ahomaa, et al., 2007)، لذا امکان حضور یرسینیا انتروکولیتیکای زنده در نمونه­های شیر ممکن است بیش از میزانی باشد که این مطالعه به آن دست یافته است. به علاوه مثبت بودن ALP در 57/11 درصد از نمونه­ها و بالا بودن تعداد باکتری­های شاخص بهداشتی حاکی از عدم کنترل شرایط بهداشتی در طی بسته­بندی و نگه­داری شیر پاستوریزه و یا احتمالاً عدم پایش دقیق دما و یا زمان پاستوریزاسیون در برخی از کارخانجات شیر و فرآورده­های آن می­باشد. این موضوع منجر به بقای برخی میکروب­های بیماری­زا به ویژه متحملین گرما نظیر مایکوباکتریوم­ها خواهد گردید (Anzabi and Hanifian, 2012). بنابراین اتخاذ تدابیر بهداشتی در ارتباط با جلوگیری از بروز آلودگی ثانویه به موازات

 

پایش دقیق دما و زمان پاستوریزاسیون در شیرهای پاستوریزه تولیدی، ضروری است.

 

سپاسگزاری

بخشی از بودجه این مطالعه توسط معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی تبریز تأمین شده است.

 

 

 

 

منابع

• Anzabi, Y. and Hanifian, S. (2012). Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in pasteurized milk by IS900 PCR and culture method. African Journal of Microbiology Research, 6: 1453-1456.
• Domig, K.J., Mayer, H.K. and Kneifel, W. (2003). Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp.: 1. Media for isolation and enumeration. International Journal of Food Microbiology, 88: 147-164.
• Fredriksson-Ahomaa, M., Korte, T. and Korkeala, H. (2000). Contamination of carcasses, offals and the environment with yad A-positive Yersinia enterocolitica in a pig slaughterhouse. Journal of Food Protection, 63: 31-35.
• Fredriksson-Ahomaa, M. and Korkeala, H. (2003). Low occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica in clinical, food, and environmental samples: a methodological problem. Clinical Microbiology Reviews, 16: 220-229.
• Fredriksson-Ahomaa, M., Hartmann, B., Scheu, P. and Stolle, A. (2007). Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in meat using real-time PCR. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2: 202-208.
• Grant, T., Bennett-Wood, V., and Robins-Browne, R.M. (1998). Identification of virulenceassociated characteristics in clinical isolates of Yersinia enterocolitica lacking classical virulence markers. Infectious and Immunity, 66: 1113-1120.
• Hanifian, S. and Karim, G. (2006). A study on the effect of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus on survival of Yersinia enterocolitica during manufacture and storage of Iranian white cheese. Iranian Journal of Veterinary Sciences, 3: 485-492 [In Farsi].
• Hanifian, S. (2009). The effect of inoculation levels of Yersinia enterocolitica on its survival in brined white cheese. Veterinary Journal of Islamic Azad University of Tabriz Branch, 3: 427-434 [In Farsi].
• Hanifian, S. and Khani, S. (2012a). Prevalence of virulent Yersinia enterocolitica in bulk raw milk and retail cheese in northern-west of Iran. International Journal of Food Microbiology, 155: 89-92.
• Hanifian, S. and Khani, S. (2012b). Fate of Yersinia enterocolitica during manufacture, ripening and storage of Lighvan cheese. International Journal of Food Microbiology, 156: 141-146.
• Hartman, P.A., Deibel, R.H. and Sieverding, L.M. (2001). Enterococci, In: Pouch Downes, F., Ito, K. (Editors.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3^th Edition. American Public Health Association, Washington DC, pp. 83-87.
• Hudson, J., King, N., Cornelius, A., Bigwood, T., Thom, K. and Monson, S. (2008). Detection, isolation and enumeration of Yersinia enterocolitica from raw pork. International Journal of Food Microbiology, 123: 25-31.
• Institute of Standards and Industrial Research of Iran. (2008). Microbiology of milk and milk products specifications. 2^nd revision, ISIRI No. 2406 [In Farsi].
• Pearce, L.E., Smythe, B.W., Crawford, R.A., Oakley, E., Hathaway, S.C. and Shepherd, J.M. (2012). Pasteurization of milk: the heat inactivation kinetics of milk-borne dairy pathogens under commercial-type conditions of turbulent flow. Journal of Dairy Science, 95: 20-35.
• Robins-Browne, R.M. and Hartland, E.L. (2003). Yersinia species, In: Miliotis, D. M. and Bier, J. W. (Editors.), International Handbook of Foodborne Pathogens. Marcel Dekker, Inc, pp. 143-144.
• Soltan-Dallal, M.M., Tabarraie, A. and MoezArdalan, K. (2004). Comparison of four methods for isolation of Yersinia enterocolitica from raw and pasteurized milk from northern Iran. International Journal of Food Microbiology, 94: 87-91.
• Sharifzade, A., Akhavan, M., Zarasvandi, A. and Al-Agha, S. (2005). Isolation of Yersinia enterocolitica and Listeria monocytogenes from raw and pasteurized milk of Chahar-Mahal-Bakhtiyari province. Iranian Food Science and Technology Journal, 1: 15-19 [In Farsi].
• Skurnik, M., Radström, P., Knutsson, R., Segerman, B., Hallanvuo, S., Thisted Lambertz, S., Korkeala, H. and Fredriksson-Ahomaa, M. (2010). Yersinia. In: Liu, D. (Editor), Molecular detection of foodborne pathogens. CRC Press, New York, pp. 501-513.
• Thisted Lambertz, S. and Danielsson-Tham, M.L. (2005). Identification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR and pulsed-field gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 71: 3674-3681.
• Vishnubhatla, A., Fung, D., Oberst, R., Hays, M., Nagaraja, T., and Flood, S. (2000). Rapid 5′-nuclease (TaqMan) assay for detection of virulent strains of Yersinia enterocolitica. Applied and Environmental Microbiology, 66: 4131-4135.
• Weagant, S.D. and Feng, P. (2001). Yersinia, In: Pouch Downes, F. and Ito, K. (Editors.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3^th Edition. American Public Health Association, Washington DC, pp. 421-428.
• Weagant, S.D., Feng, P. and Stanfield, J.T. (1998). Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis, In: Jackson, G.J., Merker, R.I. and Bandler, R. (Editors.), Bacteriological analytical manual, 8^th Edition. FDA publication, USA, pp. 156-170.

 

 

مراجع

• Anzabi, Y. and Hanifian, S. (2012). Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in pasteurized milk by IS900 PCR and culture method. African Journal of Microbiology Research, 6: 1453-1456.
• Domig, K.J., Mayer, H.K. and Kneifel, W. (2003). Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp.: 1. Media for isolation and enumeration. International Journal of Food Microbiology, 88: 147-164.
• Fredriksson-Ahomaa, M., Korte, T. and Korkeala, H. (2000). Contamination of carcasses, offals and the environment with yad A-positive Yersinia enterocolitica in a pig slaughterhouse. Journal of Food Protection, 63: 31-35.
• Fredriksson-Ahomaa, M. and Korkeala, H. (2003). Low occurrence of pathogenic Yersinia enterocolitica in clinical, food, and environmental samples: a methodological problem. Clinical Microbiology Reviews, 16: 220-229.
• Fredriksson-Ahomaa, M., Hartmann, B., Scheu, P. and Stolle, A. (2007). Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in meat using real-time PCR. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2: 202-208.
• Grant, T., Bennett-Wood, V., and Robins-Browne, R.M. (1998). Identification of virulenceassociated characteristics in clinical isolates of Yersinia enterocolitica lacking classical virulence markers. Infectious and Immunity, 66: 1113-1120.
• Hanifian, S. and Karim, G. (2006). A study on the effect of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus on survival of Yersinia enterocolitica during manufacture and storage of Iranian white cheese. Iranian Journal of Veterinary Sciences, 3: 485-492 [In Farsi].
• Hanifian, S. (2009). The effect of inoculation levels of Yersinia enterocolitica on its survival in brined white cheese. Veterinary Journal of Islamic Azad University of Tabriz Branch, 3: 427-434 [In Farsi].
• Hanifian, S. and Khani, S. (2012a). Prevalence of virulent Yersinia enterocolitica in bulk raw milk and retail cheese in northern-west of Iran. International Journal of Food Microbiology, 155: 89-92.
• Hanifian, S. and Khani, S. (2012b). Fate of Yersinia enterocolitica during manufacture, ripening and storage of Lighvan cheese. International Journal of Food Microbiology, 156: 141-146.
• Hartman, P.A., Deibel, R.H. and Sieverding, L.M. (2001). Enterococci, In: Pouch Downes, F., Ito, K. (Editors.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3^th Edition. American Public Health Association, Washington DC, pp. 83-87.
• Hudson, J., King, N., Cornelius, A., Bigwood, T., Thom, K. and Monson, S. (2008). Detection, isolation and enumeration of Yersinia enterocolitica from raw pork. International Journal of Food Microbiology, 123: 25-31.
• Institute of Standards and Industrial Research of Iran. (2008). Microbiology of milk and milk products specifications. 2^nd revision, ISIRI No. 2406 [In Farsi].
• Pearce, L.E., Smythe, B.W., Crawford, R.A., Oakley, E., Hathaway, S.C. and Shepherd, J.M. (2012). Pasteurization of milk: the heat inactivation kinetics of milk-borne dairy pathogens under commercial-type conditions of turbulent flow. Journal of Dairy Science, 95: 20-35.
• Robins-Browne, R.M. and Hartland, E.L. (2003). Yersinia species, In: Miliotis, D. M. and Bier, J. W. (Editors.), International Handbook of Foodborne Pathogens. Marcel Dekker, Inc, pp. 143-144.
• Soltan-Dallal, M.M., Tabarraie, A. and MoezArdalan, K. (2004). Comparison of four methods for isolation of Yersinia enterocolitica from raw and pasteurized milk from northern Iran. International Journal of Food Microbiology, 94: 87-91.
• Sharifzade, A., Akhavan, M., Zarasvandi, A. and Al-Agha, S. (2005). Isolation of Yersinia enterocolitica and Listeria monocytogenes from raw and pasteurized milk of Chahar-Mahal-Bakhtiyari province. Iranian Food Science and Technology Journal, 1: 15-19 [In Farsi].
• Skurnik, M., Radström, P., Knutsson, R., Segerman, B., Hallanvuo, S., Thisted Lambertz, S., Korkeala, H. and Fredriksson-Ahomaa, M. (2010). Yersinia. In: Liu, D. (Editor), Molecular detection of foodborne pathogens. CRC Press, New York, pp. 501-513.
• Thisted Lambertz, S. and Danielsson-Tham, M.L. (2005). Identification and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica isolates by PCR and pulsed-field gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 71: 3674-3681.
• Vishnubhatla, A., Fung, D., Oberst, R., Hays, M., Nagaraja, T., and Flood, S. (2000). Rapid 5′-nuclease (TaqMan) assay for detection of virulent strains of Yersinia enterocolitica. Applied and Environmental Microbiology, 66: 4131-4135.
• Weagant, S.D. and Feng, P. (2001). Yersinia, In: Pouch Downes, F. and Ito, K. (Editors.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3^th Edition. American Public Health Association, Washington DC, pp. 421-428.
• Weagant, S.D., Feng, P. and Stanfield, J.T. (1998). Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis, In: Jackson, G.J., Merker, R.I. and Bandler, R. (Editors.), Bacteriological analytical manual, 8^th Edition. FDA publication, USA, pp. 156-170.