وضعیت آلودگی شیر گاو به مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه پاراتوبرکلوزیس در گاوداری‌های سنتی منطقه مغان

بهداشت مواد غذایی

مقاله 5، دوره 1، 4 زمستان، اسفند 1390، صفحه 45-52   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

منصور خاکپور^{* 1}؛ مسعود فردین²؛ هیوا احمدی³؛ آیدا نهضتی⁴

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران.

²2- دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، دانشکده پزشکی، گروه میکروبیولوژی، اردبیل، ایران.

³3- دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دوره دکتری دامپزشکی، تبریز، ایران

⁴1- دانشگاه تبریز، دانشکده علوم پزشکی، دانش آموخته پزشکی، تبریز، ایران.

چکیده

   مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس عامل بیماری یون است که یک بیماری مزمن غیرقابل درمان در تمامی نشخوارکنندگان می­باشد و از نظر اقتصادی حائز اهمیت می­باشد. در این پژوهش با مراجعه به یازده گاوداری شیری سنتی شیری در منطقه مغان دام‌های موجود به دقت از نظر علائم بیماری یون و تاریخچه مورد بررسی قرار گرفتند و 86 نمونه مدفوعی اخذ گردید. نمونه‌ها ابتدا به روش مشاهده مستقیم میکروسکوپی آزمایش شدند. سپس به صورت تصادفی 20 نمونه از موارد مثبت و 10 نمونه از موارد منفی در آزمایش مستقیم میکروسکوپی انتخاب و بعد از نمونه­گیری شیر از دام­های مربوطه، به وسیله آزمایش PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. در آزمایش مشاهده میکروسکوپیکی از مجموع 86 نمونه تعداد 51 (59%) نمونه مثبت و 35 (41%) نمونه منفی تشخیص داده شدند. همچنین از 20 نمونه مثبت تعداد 19 (95%) مورد و از 10 نمونه منفی، 3 (30%) مورد در PCR نتیجه مثبت نشان دادند. نتایج حاصله بیانگر ارتباط مستقیم بین آلودگی مدفوع و شیر در دام­های عفونی است. همچنین با در نظر همبستگی نتایج آزمایش مشاهده میکروسکوپیکی نمونه مدفوع و PCR در نمونه شیر، می­توان از آزمایش میکروسکوپیکی به عنوان ارزیابی اولیه برای تعیین آلودگی شیر به مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس استفاده نمود. با توجه به نتایج پژوهش حاضر که نشان­دهنده آلودگی بالای شیر با مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس می­باشد و با توجه به ارتباط احتمالی این باکتری با بیماری کرون انسان، لزوم توجه بیشتر در این مورد احساس می­شود

کلیدواژه‌ها

مغان؛ بیماری یون؛ شیر؛ مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس

اصل مقاله

وضعیت آلودگی شیر گاو به مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه پاراتوبرکلوزیس در
گاوداری­های سنتی منطقه مغان

 

منصور خاکپور^1*، مسعود فردین²، هیوا احمدی³، آیدا نهضتی⁴ 

 

1-   دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران.

2-   دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، دانشکده پزشکی، گروه میکروبیولوژی، اردبیل، ایران.

3-   دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دوره دکتری دامپزشکی، تبریز، ایران.

4-   دانشگاه تبریز، دانشکده علوم پزشکی، دانش آموخته پزشکی، تبریز، ایران.

^*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 11/4/90   پذیرش نهایی:4/3/91)

 

 

 

چکیده

   مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس عامل بیماری یون است که یک بیماری مزمن غیرقابل درمان در تمامی نشخوارکنندگان می­باشد و از نظر اقتصادی حائز اهمیت می­باشد. در این پژوهش با مراجعه به یازده گاوداری شیری سنتی شیری در منطقه مغان دام‌های موجود به دقت از نظر علائم بیماری یون و تاریخچه مورد بررسی قرار گرفتند و 86 نمونه مدفوعی اخذ گردید. نمونه‌ها ابتدا به روش مشاهده مستقیم میکروسکوپی آزمایش شدند. سپس به صورت تصادفی 20 نمونه از موارد مثبت و 10 نمونه از موارد منفی در آزمایش مستقیم میکروسکوپی انتخاب و بعد از نمونه­گیری شیر از دام­های مربوطه، به وسیله آزمایش PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. در آزمایش مشاهده میکروسکوپیکی از مجموع 86 نمونه تعداد 51 (59%) نمونه مثبت و 35 (41%) نمونه منفی تشخیص داده شدند. همچنین از 20 نمونه مثبت تعداد 19 (95%) مورد و از 10 نمونه منفی، 3 (30%) مورد در PCR نتیجه مثبت نشان دادند. نتایج حاصله بیانگر ارتباط مستقیم بین آلودگی مدفوع و شیر در دام­های عفونی است. همچنین با در نظر همبستگی نتایج آزمایش مشاهده میکروسکوپیکی نمونه مدفوع و PCR در نمونه شیر، می­توان از آزمایش میکروسکوپیکی به عنوان ارزیابی اولیه برای تعیین آلودگی شیر به مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس استفاده نمود. با توجه به نتایج پژوهش حاضر که نشان­دهنده آلودگی بالای شیر با مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس می­باشد و با توجه به ارتباط احتمالی این باکتری با بیماری کرون انسان، لزوم توجه بیشتر در این مورد احساس می­شود

 

واژه­های کلیدی: مغان، بیماری یون، شیر، مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس

 

 

 

 

 

مقدمه

   بیماری یون یا پاراتوبرکلوزیس (Paratuberculosis) یک بیماری مزمن غیرقابل درمان در تمامی نشخوارکنندگان بوده و از نظر اقتصادی حائز اهمیت می­باشد. این بیماری انتشار جهانی دارد و شیوع آن در برخی از کشورها در حال افزایش می­باشد. تاکنون وقوع این بیماری در گاو از استان­های کشور ما نیز گزارش شده ولی در مورد میزان وقوع و فراوانی این بیماری در گاو، گوسفند و بز در مناطق مختلف کشور آمار دقیقی وجود ندارد (Tabatabayi, 2001). اما با توجه به شواهد موجود، بیماری در بسیاری از نواحی کشور بخصوص در گله­های عشایری استان فارس رو به افزایش می­باشد با توجه به علائم بالینی بیماری یون که منجر به کاهش تولید و بهره­وری در حیوانات پرورشی می­شود و از طرف دیگر غیرقابل درمان بودن بیماری این امر خسارات جبران ناپذیری را بر سیستم دامپروری کشور وارد می­نماید (Tabatabayi, 2001). عامل بیماری مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس (Mycobacterium avium paratuberculosis) می­باشد که در شیر، مدفوع، منی، کبد و جنین گاو آلوده موجود باشد. در این میان نقش بالقوه شیر در انتقال عامل بیماری یون از مادران آلوده به گوساله­ها و همچنین انتقال آن به سایر گاوها در گاوداری­های سنتی و صنعتی به عنوان یکی از مهمترین عوامل گسترش آلودگی شناخته شده است (Tabatabayi, 2001 Anzabi, 2005;). نکته بسیار مهم دیگر نقش باکتری ایجاد کننده­ بیماری یون در بیماری کرون انسانی (Crohn's disease) می­باشد. و هر چند که تاکنون علت اساسی برای بیماری کرون بیان نشده ولی تئوری­های زیادی در خصوص باکتریایی بودن منشاء آن ارائه گردیده که در این رابطه مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس نقش عمده­ای دارد. چون در بررسی­های مختلف از افراد مبتلا به کرون جداسازی و شناسایی شده و اکثر آنتی بیوتیک­هایی که در مورد بیماران کرون مؤثر بوده­اند همان­هایی هستند که علیه مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس هم مورد استفاده قرار می­گیرند (Anadolu, 1999). هدف از انجام پژوهش حاضر اولاً ارزیابی ویژگی­های تکنیک PCR شیر در شناسایی موارد مثبت یون در مقایسه با روش آزمایش مشاهده مستقیم بوده و در ثانی مشخص کردن میزان آلودگی شیر تولیدی منطقه مغان به این باکتری می­باشد.

 

مواد و روش­ها

   در این پژوهش با مراجعه به یازده گاوداری سنتی در منطقه مغان مجموعاً 86 رأس گاو شیری دوشا که دارای علایم بالینی بیماری یون بودند (لاغری مفرط، اسهال مزمن مقاوم به درمان، ...) به عنوان جمعیت مورد مطالعه انتخاب شدند.

   در ادامه با تهیه لام میکروسکوپی از مدفوع و تراشه­های روده و انجام رنگ­آمیزی ذیل‌نلسون، از طریق باکتریوسکوپی وجود کلامپ­های باکتریایی در گسترش­های میکروبی بررسی شد و تعداد موارد مثبت و منفی مشخص گردید. در ادامه کار از نمونه شیرهای اخذ شده از دام­های مورد نظر تعداد 20 نمونه از موارد مثبت آزمایش مستقیم و 10 نمونه از موارد دارای علایم بالینی ولی منفی از نظر آزمایش مستقیم مورد آزمایش PCR قرار گرفتند. برای انجام کار ابتدا نمونه‌های شیراخذ شده به صورت استریل به آزمایشگاه انتقال داده شدند. در آزمایشگاه این نمونه‌ها را سانتریفیوژ کرده و سپس مرحله استخراج DNA از رسوب شیر انجام گرفت. نمونه­های DNA با برنامه تدوین شده دستگاه ترمال سایکلر بعد از افزودن اجزاء PCR مورد بررسی قرار گرفتند. در ادامه محصول PCR نمونه­ها در مرحله الکتروفورز وارد تانک الکتروفورز گردید.

 

مراحل انجام PCR

   استخراج DNA: در این مرحله از روش سدیم دو دسیل سولفات (SDS) و پروتئیناز (K) استفاده شد. بدین ترتیب که دولوپ پر از رسوب حاصل از سانتریفوژ نمونه­های شیر با بافر TE(EDTA,Tris) مخلوط سپس به مدت 20 دقیقه در 80 درجه سانتی­گراد قرار داده شد تا باکتری­ها غیرفعال شوند. در ادامه به مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد با 50 میکرولیتر لیزوزیم مجاور کرده و در نهایت با محلول SDS 10% مخلوط کرده و مراحل استخراج DNA بصورت زیر انجام گرفت. ده میکرولیتر از محلول کلریدسدیم 5 مولار به میکروتیوب­ها افزوده و در حین همزدن 80 میکرولیتر محلول CTAB/Nacl که قبلاً تا 65 درجه گرم شده اضافه گردید. در این حالت به مدت 30 دقیقه در 65 درجه انکوبه شد.

  75 میکرولیتر از محلول chloroform/isoamylalchol به تیوب­ها اضافه و به مدت هشت دقیقه در 11000 دور سانتریفوژ انجام گرفت.

حدود 40 میکرولیتر ایزوپروپانول به میکروتیوب­ها اضافه و به آهستگی بهم زده شد. پس از مدتی اسیدهای نوکلئیک در میکروتیوب­ها ظاهر شدند. در این حالت میکروتیوب­ها را به فریزر منفی 20 منتقل کرده و حدود سه دقیقه در این دما نگه­داری شد.

   میکروتیوب­ها در 12000 دور به مدت پانزده دقیقه سانتریفوژ و سپس مایع رویی بیرون ریخته شد و حدود 1 میلی لیتر اتانول 70% سرد شده در فریزر روی رسوب­ها اضافه و با بهم زدن میکروتیوب­ها رسوب شستشو داده شد. دوباره در 12000 دور به مدت پنج دقیقه سانتریفوژ کرده، پس از اتمام سانتریفوژ اتانول بیرون ریخته شد و رسوب­ها در دمای اتاق خشک گردید (Supply, 2001).

   انجام PCR: در این پژوهش با استفاده از مقالات موجود (Pillai, 2002; Bhide, 2005) و با مراجعه به بانک ژنی (Gene Bank) و بررسی سکانس IS900 کروموزوم باکتری مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس در نهایت یک جفت پرایمر به شرح زیر از طریق شرکت آلمانی TIB TIB) MOLBIOL GmbH ) تهیه و آماده گردید (Anzabi, 2005).

   تمامی 30 نمونه DNA استخراج شده بصورت جداگانه در میکروتیوب­های استریل با اجزای آزمایش PCR مخلوط شدند.

 

 

 

CCA GGT TCG ACG GGG ATG GC	Forward(FP-25)
GGT CGG TAC CCT CGG CGT CC	Reverse(RP-25)

 

                                                                                                      

جدول 1: اجزای آزمایش PCR و غلظت مورد استفاده برای هر کدام از آنها

اجزای آزمایش	حجم	غلظت نهایی
Sterile, redistilled H2O	14.15l	-
10x PCR buffer	2	Kcl: 50mM, Tris-Cl20M
Mgcl2	0.6	1.5mM
dNTP mix	0.2	100M
Forward primer Reverse primer	0.4 0.4	500 n M 500 n M
Taqpolymerase enzyme   (57)	0.25	1.25 U
Templet DNA	2	100ng
حجم کلی	20 mL

 

 

   سپس میکروتیوب­ها در داخل دستگاه ترمال سایکلر شرکت اپندورف (Ependorf) قرار داده شدند و با انتخاب برنامه زمانی و حرارتی مرتبط به صورت ذیل عمل گردید. مرحله اول، دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 4 دقیقه جهت واسرشت DNA، مرحله دوم، دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت30 ثانیه (واسرشت)، دمای 70 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه (اتصال)، دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 40 ثانیه (توسعه) و مرحله نهایی، دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 7 دقیقه. برنامه فوق به غیر از مرحله اول و مرحله نهایی 35 سیکل تکرار گردید (Anzabi, 2005).

   در نهایت محصولات PCR برای مشخص کردن اندازه قطعات، مورد آزمایش ژل الکتروفورز قرار گرفتند در این مرحله با استفاده از آگارز 1% و جریان 70 ولت الکتروفورز انجام گرفت.

 

 

 

 

 

یافته­ها

   در این پژوهش از 86 نمونه مدفوع مورد آزمایش 51 نمونه از کل نمونه‌ها معادل 59 درصد مثبت گزارش شدند و 35 نمونه منفی بودند که حدود 41 درصد کل نمونه‌ها می‌باشد.

   از 20 نمونه انتخاب شده جهت انجام آزمایش PCR که از نظر آزمایش مستقیم میکروسکوپی از مدفوع مثبت بودند. 19 نمونه PCR مثبت بود که شامل حدود 95% کل نمونه‌ها می‌گردد و 1 نمونه PCR منفی بود که شامل حدود 5% نمونه‌ها می‌گردد. همچنین از 10 نمونه شیر انتخاب شده جهت انجام آزمایش PCR که از نظر آزمایش مستقیم میکروسکوپی از مدفوع منفی بودند. 3 نمونه PCR مثبت بود که شامل حدود 30% کل نمونه‌ها می‌گردد و 7 نمونه PCR منفی بود که شامل حدود 70% کل نمونه‌ها می‌گردد.

   در مجموع از کل 30 نمونه مورد آزمایش PCR، 22 نمونه مثبت بود که شامل حدود 69% کل نمونه­ها می‌گردد. و 8 نمونه منفی بود که شامل حدود 31%  کل نمونه‌ها می‌گردد.

 

 

 

 

	PCR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: درصد هم­خوانی نتایج  PCR نمونه­های شیر با آزمایش مستقیم (لام) مدفوع در جستجوی مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس در گاوهای دارای علائم بالینی یون

 

 

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                                                                                                                                                                                  228 bp

                                                      

 

 

شکل 1: ردیف 2 کنترل منفی و ردیف 10 کنترل مثبت و درخانه‌های شماره 3 ، 4، 5، 6، 7، 8، 9، نمونة مثبت که قطعه‌ای به اندازه  bp228 ایجاد کرده است ردیف 1 و ردیف 11 نیز حاوی سایز مارکر bp100 DNA ladder plus  شرکت Fermentas  

 

بحث و نتیجه­گیری

   با توجه به نتایج این پژوهش مشخص می‌گردد در منطقه مغان درگاوداری­های سنتی که سابقه درگیری با بیماری یون را داشته‌اند، وجود علایم بالینی به عنوان یک نشانه غربالگری برای تشخیص بیماری یون دارای کاربرد بوده و PCR نمونه‌های شیر این دام­ها به عنوان یک تست تأییدی هم­خوانی بالایی را دارد.

   از طرف دیگر وجود موارد مثبت آزمایش PCR در بین نمونه‌هایی که از نظر آزمایش مستقیم میکروسکوپی منفی بودند نشان دهنده این است که تست مستقیم میکروسکوپی نمی‌تواند به عنوان یک تست تشخیصی منفرد سطح اطمینان بالایی را از نظر اپیدمیولوژیک ایجاد کند بطوریکه موارد منفی این تست در پژوهش، دارای نمونه‌های مثبت PCR بودند (30% موارد) با توجه به ماهیت درون سلولی عامل بیماری یون و ایجاد فرم مزمن و حتی عدم وجود علائم واضح در برخی از موارد بیماری، این نتایج در مورد سایر روش­های تشخیصی نیز قابل پیش‌بینی می‌باشد (نمودار 1).

   در یک پژوهش که در ایتالیا صورت گرفته است، در مرحله اول گوسفندها از نظر سرولوژیک مورد بررسی قرار گرفته‌ و در ادامه نمونه‌های مثبت و منفی از نظر سرولوژیک از طریق PCR  شیر آزمایش شده‌‌اند که تعداد 9 نمونه از 15 دام سرم مثبت و تعداد 4 نمونه از 14 دام سرم منفی از نظر آزمایش PCR شیر مثبت گزارش شده‌اند (Nebbia, 2003).

   پژوهش دیگری که در هند بر روی گاومیش آبی صورت گرفته است نشان می‌دهد که از 20 مورد دارای علایم بالینی 14 نمونه از نظر آزمایش PCR و تنها 6 نمونه از نظر کشت مثبت گزارش شده‌اند (Sivakumar, 2004).

   در پژوهش دیگر که در هند انجام گرفته است بصورت مقایسه‌ای حساسیت روش­های مختلف تشخیص بیماری یون مورد بررسی قرار گرفته که از بین
روش­های تست یونین، کشت بافت، کشت مدفوع، PCR بافتی و الایزا، روش PCR بافتی بعد کشت بافتی مناسب­ترین حساسیت را داشته است (Tripathi, 2005).

   در پژوهش دیگر که در سال 2007 در هند انجام گرفته بطور مقایسه‌ای سه روش الایزای شیر، کشت شیر و PCR شیر بر روی گاوهای بومی صورت گرفته است که در این بین PCR شیر بهترین نتایج را بدنبال داشته است. در این پژوهش هم از رسوب و هم از خامه شیر به عنوان منبع باکتری برای استخراج DNA استفاده شده که بصورت مقایسه‌ای استفاده از رسوب با 62% مثبت نسبت به خامه ارجح­تر گزارش شده (خامه 50% مثبت) (Sharma, 2007) در پژوهش حاضر نیز از رسوب شیر استفاده شده است.

   علاوه بر شیر از نمونه‌های بافتی و حتی سلول­های خون نیز برای PCR استفاده می‌کنند. بطوریکه در یک پژوهش که در اسلواکی صورت گرفته است از بافی کوت به عنوان نمونه PCR استفاده شده است (Bhide, 2005).

   در پژوهش دیگری که در منطقه تبریز توسط انزابی و همکاران صورت گرفته است با انجام آزمایش PCR بر روی شیر 80 رأس گاو مشکوک به ابتلا به بیماری یون تعداد 25 نمونه مثبت گزارش شده است. (32%) همچنین موارد متعدد مثبت در بین گاوهای بظاهر سالم و شیر پاستوریزه نیز گزارش شده است (Anzabi, 2005) که نشان دهنده آلودگی نسبتاً بالای منطقه می‌باشد. میزان آلودگی در مناطق مختلف ایران و سایر کشورهای جهان متفاوت است بطوریکه مطالعات سالهای اخیر نشان می‌دهد در گله‌های گاو شیرده در امریکا قریب به 40% گاوها آلوده به عامل یون می‌باشند (Pillai, 2002).

   مطالعات دیگر در انگلستان در دهه نود میزان آلودگی شیرهای پاستوریزه که توسط آزمایش PCR مثبت شده‌اند را 30% گزارش نموده‌اند (Millar, 1996).

   با پیشرفت‌ روش­های تشخیص مولکولی از جمله تکنیک PCR اهمیت و ارزش استفاده از آن در تشخیص بیماری­ها روز به روز بیشتر می‌شود. این امر در ارتباط با تشخیص بیماری یون نیز به اثبات رسیده است.

   بطوریکه در مطالعات متعدد استفاده از آزمایش PCR در مقایسه با سایر روش­ها تعداد نمونه‌های مثبت بیشتر را به همراه داشته و حساسیت بالا و ویژگی مناسب این تکنیک را در تشخیص بیماری یون نشان می‌دهد.

   بعنوان نمونه در یک مطالعه در سال 1997 از 72 رأس گاو شیری 60% نمونه‌های شیر از نظر PCR مثبت بوده‌‌اند در حالیکه همین نمونه‌ها از طریق کشت باکتریایی تنها 30% مثبت گزارش شده­اند (Stevenson, 1997) گزارش­های متعدد با نتایج بررسی­های ما از این نظر هم­خوانی دارد.

   در پژوهش حاضر از توالی‌های IS900 در ژنوم مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیس برای تشخیص مولکولی این باکتری استفاده شده است که در پژوهش­های متعدد بعنوان یک روش کارآمد از این توالی‌ برای طراحی پرایمر استفاده شده است. همچنین در برخی مطالعات بصورت مقایسه‌ای از دیگر سکانس­های موجود در ژنوم این باکتری از جمله IS901 و توالی­های MIRU استفاده شده است که همچنان توالی IS900 به عنوان روش استاندارد مطرح می‌باشد (Tripathi, 2005;  Sivakumar, 2004  Sharma, 2007; Nebbia, 2003; ; Bhide, 2005).

   در نهایت با توجه به نتایج پژوهش حاضر که نشان­دهنده آلودگی بالای شیر تولیدی منطقه می­باشد و توجه به ارتباط احتمالی این باکتری با بیماری کرون انسانٰ، لزوم توجه بیشتر در این مورد احساس می­شود (Anadolu, 1999). از سوی دیگر مقاومت نسبتاٌ بالای این باکتری به تیمارهای حرارتی وویژگی درون سلولی بودن آن که همگی منجر به بقای بیشتر این باکتری بویژه در جریان پاستوریزه کردن شیر می­گردد، بایستی مورد توجه بیشتر محققین به خصوص در زمینه بهداشت عمومی قرار گیرد (Tabatabayi, 2001 ; Anzabi, 2005).

 

 

منابع   

• Anzabi, Y., Tabatabayi, A.H. and Asgharzadeh, M. (2005). A survey on the infection status of Mycobacterium avium paratuberculosis in dairy cattle using PCR of Tabriz. Journal of Iran veterinary science, 4: 125-131[In Farsi].  
• Anadolu, R., Calikoghn, E., Karayalcin, S. and Gurgey, E. (1999). Cutaneous Crohn's disease: metastatic Crohn's is a misnomer'. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 13 (1): 61-8.
• Bhide, M., Chakurkar, E., Tkacikova, L., Barbuddhe, S., Novak, M. and Mikula, I. (2005). IS900-PCR-based detection and characterization of Mycobacterium avium sub Sp. paratuberculosis from buffy coat of cattle and sheep. Veterinary Microbiology, 112 (1): 33-41.
• Millar, D., Ford, J., Sanderson, J., Withey, S., Tizard, M., Doran, T. and Herman-Taylor, J. (1996). IS900 PCR to detect Mycobacterium paratuberculosis in retail supplies of whole pasteurized cows milk in England and Wales. Journal of Applied and Enviromental Microbiology, 17: 3446-52.
• Nebbia, P., Robino, P., Robino, P., Zoppi, S. and De Meneghi, D. (2003). Detection and excretion pattern of Mycobacterium avium sub sp paratuberculosis in milk of asymptomatic sheep and goats by Nested- PCR. Small ruminant research, 66: 1-3.
• Pillai, S.R. and Jayarao, B.M. (2002). Application of IS900 PCR for detection of Mycobacterium avium sub sp. paratuberculosis directly from raw milk. Journal of Dairy Science, 85: 1052-1057.
• Sharma, G., Singh, S.V., Sevilla, I., Singh, A.V., Whittington, R.J., Just, R.A., Kumar, S., Gupta, V.K., Singh, P.K., Sohal, J.S. and Vihan, V.S. (2007). Evaluation of indigenous milk ELISA with m-culture and m-PCR for the diagnosis of Bovine Johne's (BJD) in lactating Indian dairy cattle. Research Veterinary Science, 84 (1): 30-37.
• Sivakumar, P., Tripathi, B.N. and Nem, singh. (2004). Detecion of Mycobacterium avium sub sp. paratuberculosis in intestinal and lymph node tissues of water buffaloes (Bubalus bubalis) by PCR and bacterial culture. Veterinary Microbiology. 108 (3-4): 263-270.
• Stevenson, K. and Sharp, JM. (1997). The contribution of molecular biology to Mycobacterium avium sub sp.  paratuberculosis research. Veterinary Journal, 153: 269-286.
• Supply, P., Lesjean, S., Savine, E., Kremer, K., Van Soolingen, D. and Locht, D. (2001). Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units. Journal of Clinical Microbiology, 39: 3563-3571.
• Tabatabayi, A.H. and Firouzi, R. (2001). Diseases of animals due to Bacteria, Tehran University Press, pp. 414 [In Farsi].  
• Tripathi, B.N., Periasamy, S., Paliwal, O.P. and Singh, N. (2005). Comparison of IS900 tisuue PCR, bacterial culture, johnin and serological test for diagnosis of naturally occurring paratuberculosis in goats. Veterinary Micribiology, 116: 129-137.

 

مراجع

• Anzabi, Y., Tabatabayi, A.H. and Asgharzadeh, M. (2005). A survey on the infection status of Mycobacterium avium paratuberculosis in dairy cattle using PCR of Tabriz. Journal of Iran veterinary science, 4: 125-131[In Farsi].  
• Anadolu, R., Calikoghn, E., Karayalcin, S. and Gurgey, E. (1999). Cutaneous Crohn's disease: metastatic Crohn's is a misnomer'. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 13 (1): 61-8.
• Bhide, M., Chakurkar, E., Tkacikova, L., Barbuddhe, S., Novak, M. and Mikula, I. (2005). IS900-PCR-based detection and characterization of Mycobacterium avium sub Sp. paratuberculosis from buffy coat of cattle and sheep. Veterinary Microbiology, 112 (1): 33-41.
• Millar, D., Ford, J., Sanderson, J., Withey, S., Tizard, M., Doran, T. and Herman-Taylor, J. (1996). IS900 PCR to detect Mycobacterium paratuberculosis in retail supplies of whole pasteurized cows milk in England and Wales. Journal of Applied and Enviromental Microbiology, 17: 3446-52.
• Nebbia, P., Robino, P., Robino, P., Zoppi, S. and De Meneghi, D. (2003). Detection and excretion pattern of Mycobacterium avium sub sp paratuberculosis in milk of asymptomatic sheep and goats by Nested- PCR. Small ruminant research, 66: 1-3.
• Pillai, S.R. and Jayarao, B.M. (2002). Application of IS900 PCR for detection of Mycobacterium avium sub sp. paratuberculosis directly from raw milk. Journal of Dairy Science, 85: 1052-1057.
• Sharma, G., Singh, S.V., Sevilla, I., Singh, A.V., Whittington, R.J., Just, R.A., Kumar, S., Gupta, V.K., Singh, P.K., Sohal, J.S. and Vihan, V.S. (2007). Evaluation of indigenous milk ELISA with m-culture and m-PCR for the diagnosis of Bovine Johne's (BJD) in lactating Indian dairy cattle. Research Veterinary Science, 84 (1): 30-37.
• Sivakumar, P., Tripathi, B.N. and Nem, singh. (2004). Detecion of Mycobacterium avium sub sp. paratuberculosis in intestinal and lymph node tissues of water buffaloes (Bubalus bubalis) by PCR and bacterial culture. Veterinary Microbiology. 108 (3-4): 263-270.
• Stevenson, K. and Sharp, JM. (1997). The contribution of molecular biology to Mycobacterium avium sub sp.  paratuberculosis research. Veterinary Journal, 153: 269-286.
• Supply, P., Lesjean, S., Savine, E., Kremer, K., Van Soolingen, D. and Locht, D. (2001). Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units. Journal of Clinical Microbiology, 39: 3563-3571.
• Tabatabayi, A.H. and Firouzi, R. (2001). Diseases of animals due to Bacteria, Tehran University Press, pp. 414 [In Farsi].  
• Tripathi, B.N., Periasamy, S., Paliwal, O.P. and Singh, N. (2005). Comparison of IS900 tisuue PCR, bacterial culture, johnin and serological test for diagnosis of naturally occurring paratuberculosis in goats. Veterinary Micribiology, 116: 129-137.