شناسایی، جداسازی، تخلیص و بررسی طیف اثر باکتریوسین‌های چند سویه لاکتوباسیلوس بومی جدا شده از محصولات لبنی ایران

بهداشت مواد غذایی

مقاله 7، دوره 1، 3 پاییز، آذر 1390، صفحه 55-69   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

سعید میردامادی^* ؛ مهرنوش تنگستانی

سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی، تهران، ایران.

چکیده

  در این مطالعه سویه­های لاکتوباسیل جدا شده از فرآورده­های شیری سنتی ایرانی که برای تولید باکتریوسین بر علیه 8سویه استاندارد باکتری گرم مثبت، گرم منفی و مخمر با روش انتشاری غربالگری شدند. تعداد 8 سویه لاکتوباسیل بومی که از نظر تولید مناسب تشخیص داده شدند، انتخاب و از بین آنها 2 سویه جهت مطالعه بیشتر در نظر گرفته شدند. باکتریوسین­های تولید شده توسط 2 سویه فوق­الذکر با استفاده از رسوب­دهی با ایزوپروپانول و آمونیوم ­سولفات و سپس دیالیز و کروماتوگرافی تخلیص گردید. آزمایش ژل الکتروفوز وجود باکتریوسین­هایی با وزن مولکولی 45 تا 2/66 کیلودالتون را در این سویه­ها مشخص نمود. نتایج حاصله نشان داد سویه­های جدا شده بومی قادر به تولید مواد باکتریوسینی هستند که به میزان بیشتر علیه میکروکوکوس لوتئوس (Micrococcus luteus PTCC1169)، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیسStaphylococcus epidermidis) PTCC1435 ) و باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus PTCC1247) و به مقدار کمتر بر روی لیستریا منوسیتوژنزListeria monocytogenes PTCC 1301)) مؤثر می­باشند. در بین میکروارگانیسم­های شاخص، میکروکوکوس لوتئوس به عنوان حساسترین باکتری و کاندیدا البیکنس (Candid albicans PTCC5027)به عنوان مقاوم­ترین ارگانیسم شناخته شدند. این مطالعه نشان داد، باکتریوسین­های تولید شده توسط این لاکتوباسیل­ها قادر به مهار طیف وسیعی از میکروارگانیسم­های بیماری­زای موجود در مواد غذایی می­باشند و می­توانند به عنوان نگه­دارنده­های بیولوژیک در فرآورده­های غذایی مورد استفاده قرار گیرند.

کلیدواژه‌ها

لاکتوباسیلوس؛ باکتریوسین؛ محافظت کننده؛ فرآورد‌ه‌های غذایی؛ نیسین

اصل مقاله

 

شناسایی، جداسازی، تخلیص و بررسی طیف اثر باکتریوسین­های چند سویه لاکتوباسیلوس بومی جدا شده از محصولات لبنی ایران

 

سعید میردامادی^1*، مهرنوش تنگستانی¹

 

1- سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی، تهران، ایران.

^*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 15/4/90   پذیرش نهایی: 7/9/90)

 

 

چکیده

  در این مطالعه سویه­های لاکتوباسیل جدا شده از فرآورده­های شیری سنتی ایرانی که برای تولید باکتریوسین بر علیه 8سویه استاندارد باکتری گرم مثبت، گرم منفی و مخمر با روش انتشاری غربالگری شدند. تعداد 8 سویه لاکتوباسیل بومی که از نظر تولید مناسب تشخیص داده شدند، انتخاب و از بین آنها 2 سویه جهت مطالعه بیشتر در نظر گرفته شدند. باکتریوسین­های تولید شده توسط 2 سویه فوق­الذکر با استفاده از رسوب­دهی با ایزوپروپانول و آمونیوم ­سولفات و سپس دیالیز و کروماتوگرافی تخلیص گردید. آزمایش ژل الکتروفوز وجود باکتریوسین­هایی با وزن مولکولی 45 تا 2/66 کیلودالتون را در این سویه­ها مشخص نمود. نتایج حاصله نشان داد سویه­های جدا شده بومی قادر به تولید مواد باکتریوسینی هستند که به میزان بیشتر علیه میکروکوکوس لوتئوس (Micrococcus luteus PTCC1169)، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیسStaphylococcus epidermidis) PTCC1435 ) و باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus PTCC1247) و به مقدار کمتر بر روی لیستریا منوسیتوژنزListeria monocytogenes PTCC 1301)) مؤثر می­باشند. در بین میکروارگانیسم­های شاخص، میکروکوکوس لوتئوس به عنوان حساسترین باکتری و کاندیدا البیکنس (Candid albicans PTCC5027)به عنوان مقاوم­ترین ارگانیسم شناخته شدند. این مطالعه نشان داد، باکتریوسین­های تولید شده توسط این لاکتوباسیل­ها قادر به مهار طیف وسیعی از میکروارگانیسم­های بیماری­زای موجود در مواد غذایی می­باشند و می­توانند به عنوان نگه­دارنده­های بیولوژیک در فرآورده­های غذایی مورد استفاده قرار گیرند.

 

واژه­های کلیدی:لاکتوباسیلوس، باکتریوسین، محافظت کننده، فرآورد­ه­های غذایی، نیسین

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه

  در سالهای اخیر با مشخص شدن مضرات برخی از نگه­دارنده­های شیمیایی، محققین توجه خود را به ترکیبات نگه­دارنده طبیعی معطوف کرده اند زیرا نگه­داری مواد غذایی و کنترل کیفیت آن از نظر میکروبی یکی از مشکلات و چالش­های تولید کنندگان مواد غذایی است (Boziaris et al., 2006). بیماری­های منتقل شده از طریق مواد غذایی هنوز از اهمیت بالایی برخوردار است. از جمله شایع­ترین آنها می­توان به بیماری­های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیاکولای، سویه های سالمونلا و لیستریا مونوسیتوژنز اشاره نمود. از مهمترین راه­های انتقال این باکتری­ها به انسان، مصرف مواد غذایی آلوده به این پاتوژن­ها به ویژه شیر و فرآورده­های آن می­باشد. مرکز کنترل بیماری­های آمریکا در سال 1999 اعلام کرد که سالیانه 76 میلیون مورد بیماری ناشی از مصرف غذا رخ می­دهد که حدود 5000 مورد آنها  به مرگ ختم می­شود (Cleveland et al., 2001). حتی یکی از عوامل سقط جنین و یا عقب ماندگی ذهنی نوزاد لیستریا مونوسیتوژنز گزارش می­شود که در ایران سرو تایپ­های عامل آن شناسایی گردیده است (Mirdamadi et al., 1994). این بیماری­ها سالیانه بین 5/6 تا 9/34 بیلیون دلار هزینه به آمریکا تحمیل می­کنند (Cleveland et al., 2001). در طی دهه گذشته مطالعات زیادی بر روی مواد ضد میکروبی مترشحه از باکتری­های  تخمیرکنندة مواد غذایی، صورت گرفته است تا در آینده ­بتوانند جایگزین نگه­دارنده­های شیمایی مانند دی اکسید سولفور، بنزوئیک اسید، سوربیک اسید، نیترات و نیتریت گردند (Mirdamadi et al.,  2007).

 

   درتخمیر که فرآیندی ناشی از فعالیت بیولوژیکی میکروارگانیسم­ها است ضمن رشد میکروارگانیسم­ها، متابولیت­های مختلفی تولید می­شود که برخی از آنها ضمن بی­خطر بودن برای مصارف انسانی، مانع رشد و زندگی میکروارگانیسم­های  ناخواسته در مواد غذایی می­شود. این مواد نگه­دارنده را محافظت­کننده­های بیولوژیکی (bio-preservative) می­نامند (Hugas, 1991).

  اگرچه باکتریوسین­ها توسط بسیاری از باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی تولید می­شوند اما از آنجایی که باکتری­های لاکتیک، بی­ضرر (GRAS) Generaly regarded as safe می­باشند، به طور کلی تمایل بیشتری برای استفاده از باکتریوسین­های آنها وجود دارد. باکتری­های لاکتیک (LAB) شامل نژادهای لاکتوکوکوس، استرپتوکوکوس، لاکتوباسیلوس و پدیوکوکوس­ها هستند که به علت توانایی گسترده­شان در تولید باکتریوسین­ها و نقش نگه­دارنده­ای که دارند، امروزه مورد توجه خاص پژوهشگران قرار گرفته­اند (Holzapfel et al., 1995). به علاوه، لاکتوباسیل­ها به دلیل توانایی­شان در تخمیر و نیز اهمیت­شان در سلامتی انسان، به عنوان پروبیوتیک­ها مورد توجه زیادی قرار گرفته­اند. آنها ترکیباتی مانند اسیدهای آلی، دی استیل، هیدروژن پراکساید و نیز باکتریوسین­ها را در طی تخمیر لاکتیک، تولید می­کنند که اثر حفاظتی آنها در مواد غذایی از اهمیت ویژه­ای برخوردارند (Mead et al., 1999; Mirdamadi et al., 2007; Tafreshi et al., 2010a).

   واژه باکتریوسین شامل گروه بزرگ و وسیعی از پروتئین­ها یا پپتیدهای ضدمیکروبی ریبوزومی خارج سلولی می­باشد که به عنوان مواد باکتری­کشی معرفی شده­اند که توسط باکتری­ها ساخته می­شوند و بر سویه­های مشابه یا سویه­های وابسته، اثر کشندگی یا مهارکنندگی دارند. آنها به طورکلی بر غشاء سیتوپلاسمیک اثرگذار هستند و با ایجاد نیروی حرکتی پروتون باعث تشکیل حفره­هایی در دو لایه فسفولیپیدی غشاء می­شوند. طیف فعالیت ضعیف آنها و مشخصة پروتئینی بودنشان، آنها را از آنتی بیوتیک­ها متمایز ساخته است (Mirdamadi et al.,  2009).

یکی از این باکتریوسین­ها نیسین است که به عنوان یک نگه­دارنده طبیعی از نظرFAO  وWHO تائید شده است و جزو ترکیباتGRAS  طبقه­بندی می­شود. این ماده باکتریوسینی در دماهای پاستوریزاسیون نسبتاً پایدار و دمای 95-85 درجه سلیسیوس را به مدت بیش از 20 دقیقه تحمل و حدود 15 درصد فعالیت آن کاهش می­یابد. استفاده توام از این نگه­دارنده با سایر عوامل ضد میکروبی باعث اثر بخشی بیشتر آن در افزایش ایمنی ماده غذایی بویژه در مقابل باکتری­های گرم منفی می­شودRauch et al., 1991)  Tafreshi et al., 2010b ; Mirdamadi et al., 2009;).

  با توجه به طیف اثر متفاوت باکتریوسین­ها و لزوم شناسایی ترکیبات جدید در این پژوهش با هدف شناسایی، جداسازی و تخلیص باکتریوسین­های سویه­های لاکتوباسیل بومی جدا شده از مواد لبنی طراحی و طیف اثر آنها جهت استفاده بالقوه به عنوان نگه­دارنده زیستی  (Bio preservative)سالم و بی­خطر بررسی گردید.

مواد و روش­ها

سویه­ها و محیط­های کشت

  سویه­های لاکتوباسیل مورد بررسی از نظر تولید باکتریوسین، لاکتوباسیل­های جداشده از محصولات لبنی بومی مناطق مختلف ایران بوده است که در فریزر 76- درجه سلیسیوس نگه ­داشته و در هنگام آزمایش در محیط MRS broth (MERCK)، به عنوان محیط کشت مایع برای رشد و بررسی تولید باکتریوسین، کشت داده می­شد.

 

بررسی طیف اثر

  بررسی طیف اثر باکتریوسین تولیدی بر روی سویه­های استاندارد بررسی گردید. سویه­های استاندارد مورد استفاده بعنوان سویه­های موردآزمایش شامل

Micrococcus luteus PTCC 1169; Bacillus cereus PTCC1247; Staphylococcus epidermidis PTCC 1435; Candida albicans PTCC 5027; Escherichia coli PTCC 1399; Staphylococcus aureus PTCC 1431: Listeria monocytogenes PTCC 1310; Entrococcus fecalis PTCC 1393

به صورت لیوفیلیزه از مرکز کلکسیون قارچ­ها و باکتری­های ایران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهیه گردیدند.

 

تولید باکتریوسین

  سویه­های مولد در MRS broth کشت به مدت 48

 ساعت در37 درجه سانتی گراد و دور rpm 150 (دور در دقیقه) گرماگذاری شدند. به منظور کاهش فعالیت مهارکنندگی اسیدهای آلی تولید شده،  pH محیط تخمیری توسط سود 4 نرمال خنثی گردید همچنین برای حذف سلول­های باکتریایی، سانتریفیوژ در rpm 5000 به مدت 15 دقیقه ((Model:CLEMENTS انجام گردید و سوپرناتانت حاصله به منظور بررسی فعالیت باکتریوسینی، مورد ارزیابی قرار گرفت (Tafreshi et al., 2010b; Mirdamadi et al., 2009).

 

 

جداسازی پروتئین­ها (باکتریوسین­ها)

استفاده از 2-پروپانول

  سوپرناتانت حاصله به آرامی در مجاورت یخ با ایزوپروپانول سرد (MERCK)، با نسبت50 درصد  حجمی، مخلوط گردید. سپس نمونه­ها در rpm 15000 به مدت 40 دقیقه در 4 درجه سلیسیوس سانتریفیوژ ((BECKMAN model J2 شد. رسوب حاصله در بافر سیترات فسفات 1/0 مولار 5/4pH=، حل و از نظر فعالیت باکتریوسینی، مورد ارزیابی قرار گرفت.

 

استفاده از آمونیوم سولفات

   پروتئین­های موجود در مایع تخمیری فاقد سلول و خنثی شده، توسط سولفات آمونیم(MERCK) در4 درجه سلیسیوس رسوب داده شد. رسوب پروتئینی حاصله توسط سانتریفیوژ با دور rpm 15000 به مدت 40 دقیقه در 4 درجه سلیسیوس جدا و در بافر پتاسیم فسفات (7  pH= و 06/0 مولار) حل گردید و سپس فعالیت باکتریوسینی آن ارزیابی شد.

 

تخلیص پروتئین­ها (باکتریوسین­ها)

دیالیز

  نمونه حاصله از مرحله قبل به مدت 48 ساعت با  بافر پتاسیم فسفات (06/0 مولار (pH=7,، در 4 درجه سلیسیوس، تحت دیالیز قرار گرفت و سپس با استفاده از معرف نسلر حذف یونهای آمونیم از محلول، اثبات گردید. نمونه­ها برای اندازه­گیری فعالیت باکتریوسینی، علیه سویه­های حساس ارزیابی شدند.

 

کروماتوگرافی

  ستون با ژل سفادکس G-100 (Sephadex G-100 ,pharmacia ,Code No.17-0060-02) پر گردید و به عنوان فاز متحرک از بافر پتاسیم فسفات (7 pH= و06/0 مولار) استفاده شد. نمونه پروتئین روی ستون وارد و ستون توسط بافر شستشو گردید تا کلیه پروتئین­های متصل نشده از ستون خارج شوند.

   فراکنش­های خارج شده از ستون توسط فراکشن کالکتور جمع­آوری گردید و بخشی از آن برای تعیین فعالیت باکتریوسین و غلظت پروتئین استفاده و باقیماندة آن برای تغلیظ بیشتر، لیوفیلیزه گردید. پودر حاصل از لیوفیلیزه در  ml1 بافر استریل حل و برای تخلیص بیشتر استفاده شد.

 

 

 

الکتروفورز

   به منظور تعیین وزن مولکولی پروتئین­­ها از تکنیک الکتروفورز با تکنیک  SDS-PAGEو رنگ­آمیزی کماسی بلو مطابق دستورالعمل کاتالوگBIORAD ,Mini- PROTEAN 3 cell Instruction manual,cat.No.165-3301,165-3302 استفاده گردید. الکتروفورز روی ژل 17% پلی آکریلامید با حضور10% سدیم دودسیل سولفات، در یک ژل عمودی با ضخامت  mm5/1 و غلظتN' ,N متیلن بیس آکریلامید 30%، در حضور عوامل پلیمریزه کننده آمونیوم پرسولفات10% و TEMED انجام گرفت. ژل به مدت 10 دقیقه در جریان 60 ولت قرار داده شد و سپس الکتروفورز به مدت30 دقیقه در 120 ولت انجام شد.

 

تعیین فعالیت باکتریوسینی

  از روش ­ (well diffusion assay)سنجش چاهک برای اندازه گیری فعالیت باکتریوسین استفاده شد (Schillinger and Luke,1989) . در این روش 50 میکرولیتر از هریک از محلول­های باکتریوسینی بدست آمده در مراحل مختلف در چاهک­های ایجاد شده روی پلیت کشت که از قبل با یک لایه نازک از کشت مایع تست استرین بذردهی شده بودند، ریخته شد. به منظور دیفیوز مایع پروتئینی در ژل، پلیت­ها به مدت 30 دقیقه در یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار گرفتند و سپس به مدت 24 ساعت در دمای مناسب رشد گرماگذاری شدند. قطر هاله عدم رشد تعیین و میزان فعالیت باکتریوسینی محاسبه گردید.

 

میزان واحد باکتریوسین تولیدی بر اساس بالاترین رقت نمونه که قدرت ایجاد هاله عدم رشد بر سویه استاندارد را دارد، تعریف گردیده است (Tafreshi et al., 2010a ; Mirdamadi et al., 2007 ).

 

یافته­ها

  در این تحقیق سویه­های لاکتوباسیل بومی از ماست و لبنیات مناطق مختلف ایران جداسازی و از نظر تولید باکتریوسین مقایسه گردیدند. از میان سویه­های بومی هشت سویه بیشترین باکتریوسین را تولید نمودند (جدول 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1: قطر هاله­های عدم رشد متابولیت­های حاصل از کشت لاکتوباسیل­های مختلف (بر حسب میلی­متر)

L. monocytogenes	E.  fecalis	C. albicans	B. cereus	E. coli	S. epidermidis	S. aureus	M. loteus	تست استرین سویه ها ی لاکتوباسیلو س
12	4	3	13	4	10	5	19	B43 Lactobacillus	1
10	3	3	9	3	9	8	25	B4      Lactobacillus	2
9	5	5	8	3	8	13	25	48       Lactobacillus	3
9	3	4	13	6	9	3	26	M 18    Lactobacillus	4
8	3	5	12	5	13	4	24	M31     Lactobacillus	5
9	4	4	14	4	11	11	23	M40     Lactobacillus	6
11	5	4	20	5	8	7	21	M46     Lactobacillus	7
10	4	3	17	6	8	5	25	M48     Lactobacillus	8

 

 

  پس از بررسی طیف اثر آنها دو سویه با نام­هایb4 و 48 برای بررسی_­های بیشتر انتخاب گردید.

  دو سویه لاکتوباسیل بومی b4 و 48 تقریباً علیه تمام سویه­های استاندارد با قدرت متفاوت اثر مهاری داشتند و قوی­ترین سویه­ها از نظر تولید باکتریوسین بودند. همچنین M .luteus PTCC 1169  به عنوان حساس­ترین سویه وE. coli PTCC1399; Candida  albicans PTCC5027; E. fecalis PTCC1393  مقاوم­ترین تست­استرین­ها تشخیص داده شدند.

  هریک از لاکتوباسیل­ها الگوی مهار رشد متفاوتی علیه تست استرین­ها نشان دادند بطوریکه در شکل1 مشاهده می­گردد این باکتری­ها علاوه بر سویه میکروکوکوس لوتئوس بر باکتری اسپوردار باسیلوس سرئوس نیز اثر مهاری نشان دادند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: هاله عدم رشد باکتریوسین های حاصل از لاکتوباسیل­ها بر سویه­های استاندارد باسیلوس سرئوس (شکل الف) و میکروکوکوس لوتئوس (شکل ب).

 

 

 

 

  جهت حذف اثر اسیدهای آلی، وبررسی خواص باکتریوسین تولیدی مراحل خالص سازی انجام گردید. برای جداسازی این مولکول­های پروتئینی از روش رسوب­دهی با سولفات آمونیوم و سپس بعد از دیالیز پروتئین­ها، نمونه­ها لیوفیلیزه و محصول در 15 میلی­لیتر بافر حل و برای ژل فیلتراسیون استفاده گردید. برای نمونه­های باکتریوسین سویه­های بومی b4 و 48 در هر مرحله تخلیص، مقدار پروتئین و فعالیت باکتریوسینی اندازه­گیری (جداول2 و3) و بطورکلی کاهش در مقدار پروتئین و افزایش فعالیت ویژه (Specific Activity) ما را به درصد تخلیص باکتریوسین رهنمون ساخت.

 

 

 

 

جدول 2 : مراحل مختلف و ضرایب تخلیص باکتریوسین حاصل از سویه b4

Purification Fold	Purification  Yield (%)	Specific Activity (U/mg)	Total Protein  (mg)	Protein Concentration (mg/ml)	Total Activity	Activity (Unit/ml)	حجم نمونهml))	سویه b4
1	100	5/14	4/455	45/3	6600	50	132	مایع تخمیر
-	54/54	-	-	-	3600	100	36	قبل از دیالیز
48/14	6/35	08/210	71/10	238/0	2350	50	45	بعد از دیالیز
22/26	72/22	22/380	945/3	263/0	1500	100	15	نمونه لیوفیلیزه حل شده در بافر
4/157	3/13	2282	298/0	271/0	880	800	1/1	بعد از ژل فیلتراسیون

 

 

جدول 3 : مراحل مختلف و ضرایب تخلیص باکتریوسین حاصل از سویه 48

Purification Fold	Purification  Yield (%)	Specific Activity U/mg))	Total Protein (mg)	Protein Concentration (mg/ml)	Total Activity	Activity unit/ml))	حجم نمونه(ml)	سویه 48
1	100	83/21	28/302	29/2	6600	50	132	مایع تخمیر
-	54/54	-	-	-	3600	100	36	قبل از دیالیز
58/5	81/31	95/121	22/17	41/0	2100	50	42	بعد از دیالیز
94/5	75/25	87/129	1/13	77/0	1700	100	17	نمونه لیوفیلیزه حل شده در بافر
08/458	6/16	10000	11/0	02/0	1100	1000	1/1	بعد از ژل فیلتراسیون

 

 

همانگونه که در نمودار (1 الف و ب) دیده می­شود، در این بررسی هریک از سویه­های مورد آزمایش در ژل فیلتراسیون، دو ناحیه جذبی در250 نانومتر

تشخیص داده شد که در مورد سویه 48 لوله­های شماره 11 تا 16 و در مورد سویه b4 لوله­های شماره 10 تا 15 فعالیت ضد رشد داشتند.

 

 

 

 

نمودار1 : منحنی بررسی خروج فراکشن­های پروتئینی از ستون­های ژل فیلتراسیون برای باکتریوسین­های سویه­های 48 (نمودار الف) و b4 (نمودارب)

 

شکل2، الکترفورز باکتریوسین­های حاصل از دو سویه را نشان می­دهد مقایسه باندها با مارکر نشان داد که وزن باکتریوسین­های موجود در این دو سویه­ها حدود 40 تا 50 کیلودالتون می­باشد .

 

 

شکل 2: الکتروفورز نمونه­های b4 (تصویر A) و 48 (تصویر B) به همراه مارکر وزن مولکولی. نمونه 1 تا 6 مربوط به تکرارهای متفاوت در مراحل مختلف تخلیص است.

 

 

بحث و نتیجه­گیری

  سویه­های مختلف باکتری­های اسید لاکتیک نظیر لاکتوباسیل­ها و لاکتوکوکوس­ها با تولید اسیدهای آلی از جمله اسید لاکتیک، تولید آنزیم­ها و متابولیت­های مختلف و از جمله باکتریوسین­ها توانایی بالایی جهت کنترل آلودگی­های مختلف میکروبی در مواد غذایی دارند (Rajaram et al., 2010). بسیاری از این باکتری­ها به عنوان پروبیوتیک­ها در حفظ سلامت انسان نقش به سزایی دارند. قدرت پروبیوتیک­ها در داشتن خواص فوق باعث گسترش تحقیقات در این زمینه گردیده است ((Mirdamadi et al., 2007. یکی از باکتریوسین­های مجازی که اکنون در صنعت غذا کاربرد فراوان یافته نیسین است. نیسین بوسیله لاکتوکوکوس لاکتیس تولید (Tafreshi et al., 2010a) و به عنوان یک نگه­دارنده بیولوژیک طبیعی در فرآورده­های غذایی استفاده می­گردد امروزه محققین با به دام­ اندازی نیسین در نانو ساختارهای بیولوژیک، فرمول­های آهسته رهش آنرا برای مواد غذایی تخمیری طراحی نموده­اند (Zohri et al., 2009; Mirdamadi et al., 2009). با وسیع­تر شدن دامنه استفاده از این باکتریوسین و گسترش مقاومت سویه­های میکروبی به مواد ضد رشد، محققین به فکر شناسایی باکتریوسین­های جدید دیگر افتاده و تحقیقات زیادی جهت شناسایی و تولید این مواد طبیعی در کشور­های مختلف دنیا در جریان است Anas et al., 2008 (Mirdamadi et al., 2007, Poor Ahmad et al., 2006; (Rajaram et al., 2010. از ویژگی­های مهم این باکتریوسین­ها طیف اثر گسترده آن می­باشد. همانگونه که ذکر شد، در این تحقیق سویه­های لاکتوباسیل بومی از ماست و لبنیات مناطق مختلف ایران جداسازی و از نظر تولید باکتریوسین مقایسه گردیدند. از میان هشت سویه که بیشترین باکتریوسین را تولید نمودند (جدول1). دو سویه با نام­هایb4 و 48 با طیف اثر وسیع انتخاب و باکتریوسین تولیدی آنها خالص گردید.

  هریک از لاکتوباسیل­ها الگوی مهار رشد متفاوتی علیه سویه­های مورد آزمایش نشان دادند (شکل1). دو سویه لاکتوباسیل بومی b4 و48 تقریبا  علیه تمام سویه­های استاندارد با قدرت متفاوت اثر مهاری داشتند و قوی­ترین سویه­ها از نظر تولید باکتریوسین بودند. همچنین M .luteus PTCC 1169 به عنوان حساس­ترین سویه وE. coli PTCC1399;  Candida  albicans PTCC5027;  E. fecalis PTCC1393  مقاوم­ترین تست استرین­ها تشخیص داده شدند. عدم تاثیر قوی این باکتریوسین­ها بر روی باکتر­ی­های گرم منفی مشابه نیسین می­باشد. نیسین روی باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسایتوژنز و گونه­های مختلف باسیلوس و کلستریدیوم اثر باکتری کشی دارد. اما بطور خالص بر باکتری­های گرم منفی بی­تأثیر است. این باکتریوسین به همراه مواد شلاته کننده و متابولیت­های دیگر در مواد غذایی به خوبی رشد باکتری­های گرم منفی را نیز مهار می­نماید (Mirdamadi et al., 2009; Tafreshi et al., 2010b)، لذا می­توان امیدوار بود که این باکتریوسین­ها نیز با سایر هردل­ها اثر بیشتری بر تمام سویه­ها داشته باشد. 

  باکتریوسین­ها در فرم خام، ترکیباتی غیر قابل دیالیز، مقاوم به حرارت، غیرحساس به کاتالاز و حساس به آنزیم­های پروتئولیتیک، هستند (Ogunbanwo et al., 2003) و لذا در مراحل تخلیص، تکنیک­های مختلف به راحتی مورد ارزیابی قرار گرفت. در این روش حلالیت پروتئین با افزودن نمک سولفات آمونیوم، حلال ایزوپروپانل کاهش داده و رسوب­دهی را برای تفکیک پروتئین­ها از یکدیگر انجام شد. همچنین می­توان از آن به عنوان یک مرحله پیش از مراحل تخلیص نهایی برای جداسازی محصولات جانبی نامطلوب مانند اسیدهای نوکلئیک، رنگدانه­ها و دیگر اجزای باقیمانده از محلول حاصل از تخمیر استفاده کرد. استفاده از آمونیم سولفات در جداسازی باکتریوسین، کارایی بهتری نسبت به ایزوپروپانول نشان داده و دیالیز پروتئین­ها بطور چشمگیری موجب جداسازی بهتر باکتریوسین از املاح و افزایش فعالیت مهاری باکتریوسین­ها گردید (جدول 2). نتایج این مرحله با نتایج Ogunbanwo و همکاران (2003) در مورد تخلیص پروتئین­ها مطابقت نشان داد آنها  با استفاده از حلال­های آلی، نشان دادند که باکتریوسین­ها را می­توان نه­تنها از فاز آبی بلکه از فاز آلی نیز جدا نمود و این نشان می­دهد که حداقل قسمتی از مولکول­های باکتریوسین ویژگی هیدروفوبیک یا آب­گریزی دارند و این ویژگی در اغلب باکتریوسین­ها مشترک است.

  پدیوسینPA1 نیز توسط رسوب با آمونیوم سولفات و سپس کروماتوگرافی فاز معکوس خالص گردیده است (Ralphet al., 1995). این روش با کمی تغییر برای خالص سازی Mesentericin Y105 نیز بکار گرفته شده است  مایع کشت تحت کروماتوگرافی روی ستون آگارز قرار گرفت و با عبور از غشائی با Cut off 5 KDa اولترافیلتره و نهایتاً توسطHPLC  فاز معکوس خالص گردید (et al., 1995 (Leer.

  همانگونه که در نمودار (1- الف) و (1- ب) دیده می­شود، در این بررسی هریک از سویه­های مورد آزمایش در ژل فیلتراسیون، دو ناحیه جذبی در250 نانومتر حاصل گردید. در بررسی فعالیت باکتریوسینی، هردو آنها دارای خاصیت مهار کننده رشد روی سویه­های استاندارد بودند و نشان داده شد که با افزایش خلوص باکتریوسین­ها، ‌به طور چشمگیری فعالیت ضد رشد آنها روی کلیه سویه­های استانداردافزایش می­یابد.

  همانگونه که در جداول شماره 2 و3 دیده می­شود در طی مراحل تخلیص، در هر مرحله غلظت پروتئین کاهش ولی فعالیت باکتریوسین افزایش پیدا می­کند بطوریکه برای سویه 48 میزان پروتئین از 28/302 به 11/0 میلی گرم می­رسد یعنی بیش از 2700 برابر پروتئین­های غیر باکتریوسینی در محیط کشت وجود داشته که در مراحل تخلیص دور ریخته شده است. در عوض میزان فعالیت از 6600 واحد به 1100 رسیده یعنی در این فرآیند 4/83 درصد باکتریوسین نیز از دست رفته یا غیر فعال گردیده است بطوریکه میزان فعالیت ویژه که نشان دهنده خلوص باکتریوسین است از 83/21 به 10000 رسیده است یعنی باکتریوسین حدود 458 برابر خالص گردیده است. این روند برای سویهb4 نیز با اختلافاتی تکرار می­گردد ولی برای این سویه میزان تخلیص کمتر و در حدود 157 برابر بوده است. این بدان مفهوم است که میزان پروتئین­های غیرباکتریوسینی در این سویه بسیار بیشتر تولید شده است و در نتیجه در مراحل خالص­سازی مقادیر بیشتری از باکتریوسین از دست رفته و یا ناخالصی بیشتری در محصول نهایی باقی مانده است. به عبارت دیگر محیط MRS برای تولید باکتریوسین توسط سویه 48 مناسب­تر می­باشد. یعنی محیط رشد برای تولید باکتریوسین نقش مهمی بازی می­کند و هر سویه در یک نوع ترکیب غذایی خاص قدرت بالاتری برای تولید باکتریوسین خواهد داشت. از این مطالب می­توان این نتیجه را گرفت که اگر از سویه­های لاکتوباسیل برای حفظ مواد غذایی از فساد و رشد باکتری­های بیماری­زا استفاده می­شود باید در نظر گرفت که کدام سویه در آن ماده غذایی خاص قدرت بالاتری دارد. این یافته در مورد لاکتوکوکوس لاکتیس PTCC  1336  که تولید کننده نیسین است در پنیر اولترافیلتر بررسی و نشان داده شد که میزان تولید نیسین در پنیر کاهش اما اثر هم افزایی نیسین با متابولیت­های دیگر باکتری بشدت افزایش می­یابد (Mirdamadi et al., 2009).

  در این تحقیق با توجه به وزن ملکولی بسیار نزدیک باکتریوسین­های حاصل از دو لاکتوباسیل 48 و b4 که حدود 40 تا 50 کیلودالتون بدست آمد (شکل 2)، طیف اثر تقریبا مشابه آنها (جدول 1) و الگوی خروج فراکشن­ها از ستون الکتروفورز هر دو باکتریوسین (شکل2­) این احتمال قوت می­یابد که این دو باکتریوسین ساختاری نزدیک به هم داشته باشند و تنها تفاوت عمده آنها سویه­های مولد آنها می­باشد.

  باکتریوسین­های متعددی از باکتری­های لاکتیکی گزارش شده استRajaram  و همکاران از یک سویه  لاکتوکوکوس لاکتیس جدا شده از محیط­های آبی یک نوع باکتریوسین را خالص خصوصیات آن­ را گزارش نمود (Rajaram et al., 2010). این در حالی است که بسیاری از محققین دیگر از سویه لاکتوکوکوس لاکتیس نیسین را جداسازی و خالص نموده اند ((Tafresh et al., 2010a.

  درمقایسه می­توان گفت که نیسین هم با  34 اسید آمینه و وزن ملکولی 12/3354 دالتون دارای دو فرم A وZ است، که تفاوت آنها در نوع اسید آمینه شماره 37 می­باشد. نوع A دارای هیستیدین و نوع  Zدارای اسید امینه آسپارژین است. همانگونه که سویه­های مختلف لاکتوکوکوس می­تواند انواع مختلف نیسین تولید نماید ((Tafreshi et al.,2010a. این دو سویه نیز باکتریوسین­هایی با ساختار و طیف اثر نزدیک به هم تولید نموده­اند. بررسی توالی اسیدهای آمینه این دو باکتریوسین می­تواند پاسخ نهایی به صحت و یا عدم صحت نظزیه فوق باشد، همچنین Noonpakdee و همکاران در سال 2009  نیز شناسایی دو پپتید از لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا شده از محصولات تخمیری که خاصیت باکتریوسینی دارند را گزارش کرده است.

  محققین زیادی اکنون در حال گزارش باکتریوسین­های تولیدی از میکروارگانیسم­ها بخصوص لاکتوباسیل­ها می­باشند. این واقعیت که اکثر این باکتری­ها قادر به تولید باکتریوسین­های مفید هستند توسط Ogunbanwo و همکاران (2003) در مورد باکتریوسین­های حاصل از  لاکتوباسیل­های موجود در کاساوا و دانه­های ذرت و Invanova و همکاران (2000) در مورد باکتریوسین­های حاصل از لاکتوباسیل­های موجود در پنیر زرد بلغار، Anas و همکاران (2008) فعالیت ضد میکروبی لاکتوباسیل­های جدا شده از شیر بز و نیز بسیاری دیگر گزارش گردیده است.اگرچه بعضی از مواد شبه باکتریوسینی تولید شده توسط باکتری­های گرم مثبت (بویژه برخی از آنها که توسطلاکتوباسیل­ها و لاکتوکوکسی­ها تولید می­شوند)، طیف مهارکنندگی نسبتاً کمی دارند؛ اما بسیاری از آنها، بسیار فعال­تر از کلیسین­ها هستند ((Ralph et al., 1995 و به طور کلی علیه طیف وسیعی از باکتریهای گرم مثبت و بعضی از سویه­های گرم منفی، مؤثرند مثلاً لاکتوکوکسین A که یک باکتریوسین کلاس II است به طور اختصاصی می­تواند لاکتوکوکوس­ها را بکشد (Holo et al., 1991). فعالیت مواد باکتریوسینی علیه سویه­های حساس و همچنین میزان حساسیت ظاهری سویه­ها، اساساً در بعضی  pH یا در حضور مواد شیمیایی که دیواره باکتری را ضعیف می­کنند، افزایش پیدا می­کند (Ganzle et al., 2000).

  در پایان با توجه به فعالیت باکتریوسینی این سویه­های بومی، به خوبی اهمیت تحقیق بر سویه­های بومی جهت جداسازی سویه­های مناسب پروبیوتیک و تولید کننده مواد بیولوژیک جدید که در محافظت از فرآورده­ها و غذاهای تخمیری سنتی و تجاری نقش دارند را نشان می­دهد.

 

 

منابع

• Anas, M., Eddine, H.J. and Mebrouk, K. (2008). Antimicrobial Activity of Lactobacillus Species Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk Against Staphylococcus aureus, World Journal of Dairy and Food Sciences, 3(2): 39-49.
• Boziaris, I.S. and Nychas, G.J.E. (2006). Effect of nisin on growth boundaries of Listeria monocytogenes at various temperatures, pH, and water activities. Food Microbiology, 23: 779-784.
• Cleveland, J., Motville, T.J., Nes, I.F. and Chikindas, M.L. (2001). Bacteriocins: Safe, natural antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 71: 1-20.
• Ganzle, M.G., Holtzel, A., Walter, J., Jung, G. and Hammes, W.P. (2000). "Characterization of reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584". Applied and Environmental Microbiology, 66: 4233-4333.
• Holo, H., Nilssen, O. and Nes, I.F. (1991). Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris isolation and characterization of the protein and its gene. Journal of Bacteriology, 173: 3879-3887.
• Holzapfel, W.H., Geisen, R. and Schillinger, U. (1995). Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology, 24: 343-362.
• Hugas, M. (1998). Bacteriocinogenic lactic acid bacteria for the biopreservation of meat and meat products. Meat Science, 49: 139-150.
• Invanova, I., Kabadjova, P., Panter, A., Danova, S. and Dousset, X. (2000). Detection, purification and partial characterization of a novel, Bacteriocin sub sp. Lactis B14 isolated from Boza-Bulgarian Traditional cereal Beverage. Biocatalysis, Fundamentals and Applications, 41(6): 47-53.
• Leer, R.J., van der Vossen, J.M., van Giezen, M., van Noort, J.M. and Pouwels, P.H. (1995). Genetic analysis of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus. Microbiology, 141: 1629-1635.
• Mead, P.S., Slutsker, L., Dietz, V., McCaig, L.F., Bresee, J.F., Shapiro, C., Griffin, P.M., Tauxe, R.V. (1999). Food-related illness and death in the United States, Emerging Infectious Diseases, 5(5): 607-625.
• Mirdamadi, S., Moazami, N. and Rafiei, T. (1994). Rate of Listeria Abortion in Tehran. Medical Journal of Islamic Republic of IRAN (MJIRI), 8(1): 1-4 [In Farsi].
• Mirdamadi, S., Moazami, N. and Rafiei, T. (1994). Determination of Dominant Serovars of Listeria monocytogenes. Medical Journal of Islamic Republic of IRAN (MJIRI), 3: 173-175.
• Mirdamadi, S., Aziz Mohseni, F., Fallahpour, M. and Tangestani, M. (2007). Screening of lactobacillus strains for bio-preservative production and probiotic activities from Iranian Yogurt. (2007). Annals of Nutrition and Metabolism, 51: 159-159.
• Mirdamadi, S., Agha Ghazvini, Sh. and Taffresh, H. (2009).  Production and Nano-Formulation of Nisin in Liposome as a slow Release Preservative Against  Important Food-Born Pathogens in Uf Cheese,  New Biotechnology , Volume 25, Suppl. 1, Elsevier, ISSN: 1871-678.
• Noonpakdee, W., Jumriangrit, P., Wittayakom, K., Zendo, J., Nakayama, J., Sonomoto, K. and Panyim, S. (2009). Two-peptide bacteriocin from Lactobacillus plantarum (PMU) 33 strain isolated from som-fak, a Thai low salt fermented fish product. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 17(1): 19-25.
• Ogunbanwo, S.T., Sanni, A.I. and Onilude, A.A. (2003). Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarumF1 and Lactobacillus bervis (OG1). African Journal of Biotechnology, 2(8): 219-227.
•  Poor Ahmad, R., Mazaheri Asadi, M. and Mirdamadi, S. (2006). Study of Anti bacterial effects of Isolated Iranian Native starter cultures. (2006), Food Technology and Nutrition, 3(1): 23-32.
• Rajaram, G., Manivasagan, P., Thilagavathi, B. and Saravanakumar, A. (2010). Purification and Characterization of a Bacteriocin Produced by Lactobacillus lactis Isolated from Marine Environment. Advance Journal of Food Science and Technology, 2(2): 138-144.
• Ralph, W., Jack John, R., Tagg, and Bibekray. (1995). Bacteriocin of gram-positive bacteria. Microbiology Reviews, 59(2): 171-200.
• Rauch, P.J.G., Beerthuyzen, M.M. and De Vos, W.M. (1991). Molecular analysis and evolution of conjugative transposons encoding nisin production and sucrose fermentation in Lactococcus lactis, pp. 243–249. In G. Jung and H.G. Sahl (ed.), Nisin and novel lantibiotics. Escom Publishers, Leiden, The Netherlands.
• Schillinger, U. and Lucke, F.K. (1989). Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from Meat. Applied and Environmental Microbiology, 55: 1901-1906.
• Tafreshi, H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari, S. (2010a). Effect of nonnutritional factors on nisin production. African Journal of Biotechnology, 9(9): 1382-1391.
• Tafreshi, H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari, S. (2010b). Optimization of Non-Nutritional Factors for a Cost-Effective Enhancement of Nisin Production Using Orthogonal Array, Method, Journal of Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2: 267-273.
  • Zohri, M., Gazori, T., Mirdamadi,
    
    Address:
    S., Asadi, A. and Haririan, I. (2009). Polymeric NanoParticles: Production, applications and Advantage. The Internet Journal of Nanotechnology, 3(1): 1-7.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مراجع

• Anas, M., Eddine, H.J. and Mebrouk, K. (2008). Antimicrobial Activity of Lactobacillus Species Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk Against Staphylococcus aureus, World Journal of Dairy and Food Sciences, 3(2): 39-49.
• Boziaris, I.S. and Nychas, G.J.E. (2006). Effect of nisin on growth boundaries of Listeria monocytogenes at various temperatures, pH, and water activities. Food Microbiology, 23: 779-784.
• Cleveland, J., Motville, T.J., Nes, I.F. and Chikindas, M.L. (2001). Bacteriocins: Safe, natural antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 71: 1-20.
• Ganzle, M.G., Holtzel, A., Walter, J., Jung, G. and Hammes, W.P. (2000). "Characterization of reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584". Applied and Environmental Microbiology, 66: 4233-4333.
• Holo, H., Nilssen, O. and Nes, I.F. (1991). Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris isolation and characterization of the protein and its gene. Journal of Bacteriology, 173: 3879-3887.
• Holzapfel, W.H., Geisen, R. and Schillinger, U. (1995). Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology, 24: 343-362.
• Hugas, M. (1998). Bacteriocinogenic lactic acid bacteria for the biopreservation of meat and meat products. Meat Science, 49: 139-150.
• Invanova, I., Kabadjova, P., Panter, A., Danova, S. and Dousset, X. (2000). Detection, purification and partial characterization of a novel, Bacteriocin sub sp. Lactis B14 isolated from Boza-Bulgarian Traditional cereal Beverage. Biocatalysis, Fundamentals and Applications, 41(6): 47-53.
• Leer, R.J., van der Vossen, J.M., van Giezen, M., van Noort, J.M. and Pouwels, P.H. (1995). Genetic analysis of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus. Microbiology, 141: 1629-1635.
• Mead, P.S., Slutsker, L., Dietz, V., McCaig, L.F., Bresee, J.F., Shapiro, C., Griffin, P.M., Tauxe, R.V. (1999). Food-related illness and death in the United States, Emerging Infectious Diseases, 5(5): 607-625.
• Mirdamadi, S., Moazami, N. and Rafiei, T. (1994). Rate of Listeria Abortion in Tehran. Medical Journal of Islamic Republic of IRAN (MJIRI), 8(1): 1-4 [In Farsi].
• Mirdamadi, S., Moazami, N. and Rafiei, T. (1994). Determination of Dominant Serovars of Listeria monocytogenes. Medical Journal of Islamic Republic of IRAN (MJIRI), 3: 173-175.
• Mirdamadi, S., Aziz Mohseni, F., Fallahpour, M. and Tangestani, M. (2007). Screening of lactobacillus strains for bio-preservative production and probiotic activities from Iranian Yogurt. (2007). Annals of Nutrition and Metabolism, 51: 159-159.
• Mirdamadi, S., Agha Ghazvini, Sh. and Taffresh, H. (2009).  Production and Nano-Formulation of Nisin in Liposome as a slow Release Preservative Against  Important Food-Born Pathogens in Uf Cheese,  New Biotechnology , Volume 25, Suppl. 1, Elsevier, ISSN: 1871-678.
• Noonpakdee, W., Jumriangrit, P., Wittayakom, K., Zendo, J., Nakayama, J., Sonomoto, K. and Panyim, S. (2009). Two-peptide bacteriocin from Lactobacillus plantarum (PMU) 33 strain isolated from som-fak, a Thai low salt fermented fish product. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 17(1): 19-25.
• Ogunbanwo, S.T., Sanni, A.I. and Onilude, A.A. (2003). Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarumF1 and Lactobacillus bervis (OG1). African Journal of Biotechnology, 2(8): 219-227.
•  Poor Ahmad, R., Mazaheri Asadi, M. and Mirdamadi, S. (2006). Study of Anti bacterial effects of Isolated Iranian Native starter cultures. (2006), Food Technology and Nutrition, 3(1): 23-32.
• Rajaram, G., Manivasagan, P., Thilagavathi, B. and Saravanakumar, A. (2010). Purification and Characterization of a Bacteriocin Produced by Lactobacillus lactis Isolated from Marine Environment. Advance Journal of Food Science and Technology, 2(2): 138-144.
• Ralph, W., Jack John, R., Tagg, and Bibekray. (1995). Bacteriocin of gram-positive bacteria. Microbiology Reviews, 59(2): 171-200.
• Rauch, P.J.G., Beerthuyzen, M.M. and De Vos, W.M. (1991). Molecular analysis and evolution of conjugative transposons encoding nisin production and sucrose fermentation in Lactococcus lactis, pp. 243–249. In G. Jung and H.G. Sahl (ed.), Nisin and novel lantibiotics. Escom Publishers, Leiden, The Netherlands.
• Schillinger, U. and Lucke, F.K. (1989). Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from Meat. Applied and Environmental Microbiology, 55: 1901-1906.
• Tafreshi, H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari, S. (2010a). Effect of nonnutritional factors on nisin production. African Journal of Biotechnology, 9(9): 1382-1391.
• Tafreshi, H., Mirdamadi, S., Norouzian, D., Khatami, Sh. and Sardari, S. (2010b). Optimization of Non-Nutritional Factors for a Cost-Effective Enhancement of Nisin Production Using Orthogonal Array, Method, Journal of Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2: 267-273.
  • Zohri, M., Gazori, T., Mirdamadi,
    
    Address:
    S., Asadi, A. and Haririan, I. (2009). Polymeric NanoParticles: Production, applications and Advantage. The Internet Journal of Nanotechnology, 3(1): 1-7.