مطالعه فراوانی شش ژن مولد آنتروتوکسین در استافیلوکوکوس آرئوس های جدا شده از پنیرهای محلی به روش Multiplex PCR

بهداشت مواد غذایی

مقاله 1، دوره 3، 4 (12) زمستان، اسفند 1392، صفحه 1-7   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

سامان مهدوی^*

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مراغه، استادیار گروه میکروبیولوژی، مراغه، ایران.

چکیده

با توجه به اهمیت انتروتوکسین‌های استافیلوکوکوس آرئوس به عنوان یکی از عوامل عمده مسمومیت‌های غذایی، بررسی روش‌های متعدد نظیر جداسازی، شناسایی و دسته‌بندی این انتروتوکسین‌ها ضروری است. در این تحقیق 22 سویه باکتری استافیلوکوکوس آرئوس کوآگولاز مثبت جدا شده از پنیرهای سنتی روستاهای شهرستان مراغه برای بررسی وجود شش ژن انتروتوکسین با استفاده از روش Multiplex PCRمورد ارزیابی قرار گرفتند. ابتدا DNA نمونه‌ها استخراج شده و سپس Multiplex PCR برای حضور ژن‌های انتروتوکسین a، b، g،h ،i و j  بر روی نمونه‌ها انجام شد. در بین ژن‌های انتروتوکسین مورد آزمایش ژن Seg با بیشترین فراوانی (8 سویه) و ژن Seb با کمترین فراوانی (منفی) گزارش شد. در 9 مورد (9/40 %) از جدایه‌ها، ژن‌های انتروتوکسین مورد آزمایش مشاهده شد. چهار مورد (18/18%) دارای بیش از یک نوع ژن انتروتوکسین بودند. نتایج مطالعه نشان داد اکثر استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از پنیرهای محلی دارای پتانسیل تولید انتروتوکسین می‌باشند. 

کلیدواژه‌ها

استافیلوکوکوس آرئوس؛ ژن انتروتوکسین؛ پنیر؛ Multiplex PCR

اصل مقاله

مقدمه

   استافیلوکوکوس آرئوس یک گونه باکتریایی بسیار مهم مولد مسمومیت غذایی در بسیاری از کشورهای جهان می‌باشد. مسمومیت حاصل از این باکتری، یکی از شایع‌ترین مسمومیت‌های غذایی است و در اغلب کشورها از نظر وقوع در لیست سه مسمومیت درجه اول قرار دارد (رضویلر، 1381). این باکتری طیف وسیعی از ترشحات سمی را تولید می‌نماید. در میان سموم تولید شده، انتروتوکسین‌ها دارای اهمیت بسزایی هستند. انتروتوکسین‌ها پروتئین‌های نسبتاً مقاوم به حرارت بوده و تقریباً به‌طور انحصاری توسط سویه‌های کوآگولاز مثبت استافیلوکوکوس آرئوس تولید می‌شوند و به عنوان عامل استفراغ در مسمومیت‌های غذایی و گاستروآنتریت‌ها مطرح می‌باشند (ملک‌زاده، 1381). انتروتوکسین استافیلوکوکی (SE) برخلاف انتروتوکسین‌های دیگر مثل کلراتوکسین روی سلول‌های اپتیلیال عمل نکرده بلکه اثر استفراغ‌زایی آنها به علت اثر روی عصب واگ و سمپاتیک است و بنابراین می‌توان سموم SE را به‌طور صحیح‌تر نوروتوکسین نامید (رضویلر، 1381). سویه‌های انتروتوکسین‌زای استافیلوکوکوس آرئوس می‌توانند یک یا چندین نوع از توکسین‌هایی را که از نظر سرولوژیکی متفاوت هستند هم‌زمان تولید کنند. اخیراً ژن‌های بیشتری از SE (U, K-R) علاوه بر ژن‌هایی که قبلا گزارش شده بود (َA-J) تشخیص داده شده است ولی نقش آنها در مسمومیت‌های غذایی مشخص نیست (Letertre et al., 2003). بیش از 95% از انتروتوکسین‌های این باکتری که ایجاد مسمومیت‌های غذایی می‌کنند جزء گروه A-E هستند (Cremonesi et al., 2005).

   برای تشخیص توکسین بهترین وسیله = روش سرولوژیکی است ولی خالص‌سازی توکسین جدا شده از غذا هنوز مشکل عمده این نوع آزمایشات می‌باشد (رضویلر، 1381). با این وجود روش‌های مولکولی برای تشخیص ژن‌های مولد سموم SE نیز بطور گسترده‌ای توسعه یافته‌اند. روش‌های مولکولی از جمله مولتی پلکس PCR در مقایسه با آزمایشات ایمونولوژیکی تولید توکسین، سریع‌تر، اختصاصی‌تر، حساس‌تر و قابل اطمینان‌تر است (Pinto et al., 2005).

   با توجه به عدم رعایت شرایط بهداشتی مناسب در طی شیردوشی و نیز عدم حرارت دادن مناسب شیر قبل از تهیه پنیر سنتی در روستاها و مصرف بالای پنیرهای محلی در ایران، بررسی ژن‌های مولد انتروتوکسین‌های استافیلوکوکی جدا شده از پنیرهای محلی بسیار حائز اهمیت می‌باشد. هدف از انجام این تحقیق، تعیین فراوانی شش ژن مولد انتروتوکسین در استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از نمونه‌های پنیر محلی روستاهای شهرستان مراغه به روش Multiplex PCR بود.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‌ها

   تعداد 22 سویه باکتری استافیلوکوکوس آرئوس کوآگولاز مثبت جدا شده به عنوان نمونه مورد استناد در این مطالعه استفاده شد.

استخراجDNA

   استخراج DNA از 22 نمونه کشت داده شده باکتری استافیلوکوکوس آرئوس کوآگولاز مثبت در محیط آبگوشت قلب- مغز (شرکتMerck، کشور آلمان) انجام شد. یک میلی‌لیتر از کشت‌های باکتریایی با شدت ×g5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شده و مایع رویی دور ریخته شد. بعد از افزودن 1 میلی‌لیتر بافر لیزکننده شامل تریس 1 مولار (5/7=pH)، کلریدسدیم 5 مولار، EDTA 5/0 مولار، C-TAB 2 درصد بر روی رسوب مخلوط، در دمای 85 به مدت 30 دقیقه در بن ماری قرار داده شد و سپس ویال‌های حاوی سلول‌های لیزشده به مدت 5 دقیقه با شدت g×12000 سانتریفیوژ و مایع رویی به ویال‌های دیگر منتقل و هم حجم آن کلروفرم – ایزوآمیل الکل با نسبت 24: 1 به آن اضافه و به آرامی تکان داده شد. پس از تشکیل دو فاز مایع در ویال و برداشت لایه رویی و انتقال آن به تیوپ 5/1 میلی‌لیتری دیگر، 5/0 میکرولیتر RNAase به آن اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای37 در بن ماری قرار گرفت. بعد از 30 دقیقه، ویال‌ها را برداشته و هم حجم آنها ایزوپروپانول اضافه شد و به مدت 15 دقیقه در دمای 20- قرار داده شده و با سانتریفیوژ با شدت ×g12000، DNA ترسیب و با قرار دادن ویال‌ها در دمای اتاق، DNA خشک گردید. در پایان، DNA خشک شده در 50 میکرو لیتر آب دیونیزه حل گردید (Atashpaz et al., 2010).

انجام مولتی پلکس PCR برای ژن‌های انتروتوکسین     

   این واکنش در حجم 25 میکرو­لیتر با استفاده از پرایمرهای انتخاب شده برای باکتری‌ها انجام گرفت که پرایمرها و توالی اختصاصی آنها در جدول (1) آورده شده است. کیت مسترPCR  5/12 میکرولیتر، پرایمرهای اختصاصی 5/0 میکرومولار و DNA استخراج شده شامل 1 میکرولیتر (50 نانوگرم) مخلوط واکنش را تشکیل می‌دادند. واکنش زنجیرة پلیمرازی با چرخه‌های واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سلسیوس به مدت 4 دقیقه، 32 چرخه با مرحله واسرشته سازی در 94 درجه سلسیوس به مدت 50 ثانیه، مرحله اتصال آغازگر در دمای 56 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، بسط در 72 درجه سلسیوس به مدت 2 دقیقه و نهایتا یک چرخه بسط نهایی در 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصولات حاصله در آگارز 5/1% الکتروفورز شد و با استفاده از دستگاه ژل داکیومنت مورد عکس‌برداری قرار گرفتند. برای نشان دادن اندازه قطعات تکثیری از Ladder  bp 100 استفاده شد.

 

 

جدول 1- پرایمرهای مورد استفاده در واکنش PCR جهت تشخیص 6 ژن آنتروتوکسین

نام ژن	نام پرایمر	توالی	اندازه باند (جفت باز)	منبع
Sea	SEA-F SEA-R	GCA GGG AAC AGC TTT AGG C GTT CTG TAG AAG TAT GAA ACA CG	521	Monday and Bohach, 1999
Seb	SEB-F SEB-R	ACA TGT AAT TTT GAT ATT CGC ACT G TGC AGG CAT CAT GTC ATA CCA	667	Lovseth et al., 2004
Seg	SEG-1 SEG-2	AAG TAG ACA TTT TTG GCG TTC C AGA ACC ATC AAA CTC GTA TAG C	287	Rall et al., 2008
Seh	SHE-F SHE-R	CAA CTG CTG ATT TAG CTC AG GTC GAA TGA GTA ATC TCT AGG	360	Monday and Bohach, 1999
Sei	SEI-1 SEI-2	GGT GAT ATT GGT GTA GGT AAC ATC CAT ATT CTT TGC CTT TAC CAG	454	Rall et al., 2008
Sej	SEJ-1 SEJ-2	CAT CAG AAC TGT TGT TCC GCT AG CTG AAT TTT ACC ATC AAA GGT AC	142	Monday and Bohach, 1999

 

یافته‌ها

   نتایج مربوط به مولتی پلکس PCR در شکل 1 نشان داده شده است. فراوانی ژن‌های مولد انتروتوکسین و فراوانی باهم بودن این ژن‌ها در یک سویه در جدول 2 نشان داده شده است. در بین ژن‌های انتروتوکسین مورد آزمایش، ژن Seg بیشترین فراوانی (8 سویه) و ژن Sebکمترین فراوانی (منفی) را داشت. تنها در 9 مورد (9/40 %) از نمونه‌ها، ژن‌های انتروتوکسین مورد آزمایش مشاهده شد. چهار مورد (18/18%) دارای بیش از یک نوع ژن انتروتوکسین بودند که ژن Seg در تمام آنها مشترک بود.

 

    

 

شکل1- الکتروفورز محصول مولتی پلکس PCR در آگارز 5/1 درصد. به ترتیب از سمت چپ به راست شامل:

Lad: Ladder ، Sha:S.aureus PTCC 1112 ، محل های تشکیل باند:  bp287 :  Sha، شماره 1: bp  287 ، شماره 4 : bp 454 ،

شماره 10 : bp  287 و bp 454 ، شماره 13 : bp 521 ، شماره 53 : bp 287 ، شماره 86 : bp  287 و bp 454 و bp 142 ،

شماره 36 : bp 287 و bp 521 ، شماره 6 : bp 287 و  bp 360 ، شماره 57 : bp 287

 

جدول2- فراوانی ژن‌های مولد انتروتوکسین و فراوانی باهم بودن این ژن‌ها در یک سویه

تعداد سویه‌ها	ترکیب ژن‌ها	تعداد سویه‌ها	ژن
1	Sea+Seg	2	Sea
1	Seg+Seh	-	Seb
1	Seg+Sei	8	Seg
1	Seg+Sei+Sej	1	Seh
		3	Sei
		1	Sej
		22	جمع

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

   مطاله بر روی مسمومیت‌های غذایی با منشاء  استافیلوکوکوس آرئوس به قرن 19 باز می‌گردد (Abbar, 2010)، زمانی که به نظر می‌رسید شیر و فرآورده‌های آن اهمیت زیادی در خصوص چنین مسمومیت‌هایی دارند. اعتقاد بر این است که میزان آلودگی فرآورده‌های شیر بدلیل آلودگی‌هایی است که در طی فرآیند تولید آنها اتفاق می‌افتد. تحقیقات دقیق نشان داده که منابع آلودگی پنیر شامل شیرخام، شیر با پاستوریزاسیون ناقص و یا آلودگی مجدد شیر پاستوریزه با میکروب‌های ناشی از شیرخام یا از محیطی که در آن پنیرسازی انجام می‌شود می‌باشد (Little et al., 2008). در بین بسیاری از توکسین‌های خارج سلولی استافیلوکوکوس آرئوس، انتروتوکسین‌ها بیشترین خطر را ایجاد می‌کنند (Akineden et al., 2008). طبق گزارشات محققین، بیشترین فراوانی ژن انتروتوکسین مربوط به ژن Sea می‌باشد (Gilmour and Harvey, 1990). در مطالعه‌ای که بر روی ژن‌های انتروتوکسین استافیلوکوکوس آرئوس از محصولات لبنی سنتی صورت گرفت 1/31% کل سویه‌های جدا شده از مواد لبنی، یکی از دو ژن Sea و Seb یا هر دو را دارا بود که درصد سویه‌های استافیلوکوکوس آرئوس دارای ژن‌های Sea،Seb  و Sea+Seb به ترتیب 6/15 ، 3/9 و 2/6 درصد بودند .(Imani Fooladi et al., 2010) نتایج مشابهی در ارتباط با غالب بودن ژن Sea در بین سویه‌های با منشاء انسانی گزارش گردیده است (Haveri et al., 2007). در این تحقیق بیشترین فراوانی ژن انتروتوکسین مربوط به ژن Seg بود که با نتایج تحقیقات سائر و همکاران مطابقت دارد (Sauer et al., 2008). در تحقیقی بر روی میزان فراوانی ژن‌های مولد انتروتوکسین استافیلوکوکی از نمونه‌های شیر، بیشترین فراوانی مربوط به ژن Seg گزارش شد (Ahmadi and Dastmalchi Saei, 2013). در مطالعه‌ای مشخص شده است که انتروتوکسین‌های G،  Iو J بیش از سایر انواع انتروتوکسین در بین سویه‌های استافیلوکوکوس آرئوس جدا شده از موارد التهاب پستان گاو شایع می‌باشند (Akineden et al., 2001). در تحقیقی دیگر که بر روی میزان شیوع ژن‌های انتروتوکسین‌های معمول در استافیلوکوکوس آرئوسهای جدا شده از شیر گاومیش صورت گرفته بود، بیشترین میزان شیوع، مربوط به ژن Sec گزارش شد و ژن Sea در هیچ‌کدام از سویه‌ها شناسایی نشد (اثنی عشری و همکاران، 1391). انتروتوکسین Seg  بیشتر با منشاء دامی می‌باشد و نشان‌دهنده آلودگی نمونه‌های پنیر با شیر خام آلوده با منشاء دامی است که این امر به کم بودن میزان دستکاری انسانی در خصوص شیر خام صحه می‌گذارد. در اکثر مطالعات پیشین، موارد مثبت آلودگی‌های محصولات لبنی به استافیلوکوکوس آرئوس حاوی ژن انتروتوکسین با منشاء انسانی گزارش شده بود ولی در تحقیق اخیر، اکثر آلودگی با منشاء دامی بوده و دستکاری انسانی در آن دخیل نیست که این امر با نتایج مطالعات اثنی عشری و همکاران (1391) و احمدی و دستمالچی ساعی (2013) مطابقت دارد. انتشار وسیع سویه‌های مولد انتروتوکسین در شیر، خطر حضور چنین سویه‌هایی را در فرآورده‌های غذایی افزایش می‌دهد هر چند که میزان آن در مقایسه با خود شیر پایین است (Haveri et al., 2007). نتایج مطالعات بدست آمده در این تحقیق در مقایسه با سایر مطالعات، نشان‌دهنده اختلاف در پراکندگی ژن‌های موثر در تولید انواع انتروتوکسین در بین سویه‌های مختلف استافیلوکوکوس آرئوس می‌باشد که این امر احتمالا از تفاوت‌های جغرافیایی و نیز اختلاف در منشاء اکولوژیکی سویه‌های جدا شده (شیر، انسان و دام‌های مختلف) ناشی می‌شود.

مراجع

• اثنی عشری، مهرداد؛ شایق، جلال و نصرالهی عمران، آیت‌اله (1391). مطالعه میزان شیوع ژن‌های آنتروتوکسین‌های معمول در استافیلوکوکوس آرئوس‌های جدا شده از شیر گاومیش‌های شهرستان تبریز به روش Multiplex PCR. مجله بهداشت مواد غذایی، سال دوم، شماره2، صفحات: 68-61.
• رضویلر، ودود (1381). میکروب‌های بیماری‌زا در مواد غذایی و اپیدمیولوژی مسمومیت‌های غذایی. چاپ دوم. انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 129-128.
• ملک‌زاده، فریدون (1381). میکروب شناسی. چاپ سوم. انتشارات دانشگاه تهران. صفحه: 65.
  • Ahmadi, M. and Dastmalchi Saei, H. (2013). Detection of the enterotoxin-producing genes in Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis milk by PCR in Tabriz and Urmia regions. Iranian Veterinary Journal, 9(3): 27-35.  
  • Akineden, O., Ahmed Hassan, A., Schneider, E. and Usleber, E. (2008). Enterotoxigenic properties of Staphylococcus aureus isolated from goats' milk cheese. International Journal of Food Microbiology, 124: 211-216.
  • Akinden, O., Annemuller, C., Hassan, A.A., Lamller, C., Wolter, W. and Zschock, M. (2001). Toxin genes and other characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology, 8: 959-964.
  • Atashpaz, S., Khani, S., Barzegari, A., Barar, J., Vahed, S.Z., Azarbaijani, R., et al. (2010). A robust universal method for extraction of genomic DNA from bacterial species. Mikrobiologiia, 79(4): 562-566.
  • Cremonesi, P., Luzzana, M., Brasca, M., Morandi, S., Lodi, R., Vimercati, C., et al. (2005). Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products. Molecular and Cellular Probes, 19: 299-305.
  • Gilmour, A. and Harvey, J. (1990). Staphylococci in milk and milk products. Journal of Applied Microbiology, 147s-166s.
  • Haveri, M., Roslof, A., Rantala, L. and Pyprala, S. (2007). Virulence genes of bovine Staphylococcus aureus from persistent and nonpersistent intramammary infections with different clinical characteristics. Journal of Applied Microbiology, 103: 993-1000.
  • Imani Fooladi, A.A., Tavakoli, H.R. and Naderi, A. (2010). Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates in domestic dairy products. Iranian Journal of Microbiology, 2(3): 137–142.
  • Letertre, C., Perelle, S., Dilasser, F. and Fach, P. (2003). Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by the egc cluster of Staphylococcus aureus. Journal of Applied Microbiology, 95: 38–43.
  • Little, C.L., Rhoades, J.R., Sagoo, S.K., Harris, j., Greenwood, M., Mithani,V., et al. (2008). Microbiological quality of retail chesse made form raw thermizd or pasterurizd milk in the UK. Food Microbiology, 25: 304-312.
  • Lovseth, A., Loncarevic, S. and Berdal, K.G. (2004). Modified multiplex PCR method for detection of pyrogenic exotoxin genes in Staphylococcal isolates. Journal of Clinical Microbiology, 42: 3869-3872.
  • Monday, S.R. and Bohach, G.A. (1999). Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in Staphylococcal isolates. Journal of Clinical Microbiology, 37(10): 3411-3414.
  • Pinto, B., Chenoll, E. and Aznar, R. (2005). Identification and typing of foodborne Staphylococcus aureus by PCR-based techniques. Systematic and Applied Microbiology, 28: 340-352.
  • Rall, V.L.,Vieira, F.P., Rall, R., Vieitis, R.L., Fernandes, A.Jr., Candeias, J.M., et al. (2008). PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Veterinary Microbiology, 132(3-4): 408-13.
  • Sauer, P., Sıla, J., Stosova, T., Vecerova, R., Hejnar, P., Vagnerova, I., et al. (2008). Prevalence of genes encoding extracellular virulence factors among meticillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the University Hospital, Olomouc, Czech Republic. Journal of Medical Microbiology, 57:403-410.