مطالعه پلی‌مورفیسم ژن کوآگولاز در استافیلوکوکوس آرئوس‌های جدا شده از شیر گاومیش

بهداشت مواد غذایی

مقاله 3، دوره 3، 1 (9) بهار، خرداد 1392، صفحه 25-31   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

جلال شایق^{* 1}؛ علی رضا منادی²

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، استادیار گروه دامپزشکی، شبستر، ایران.

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، استادیار گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران

چکیده

هدف از این مطالعه آنالیز ژن کوآگوالاز در استافیلوکوکوس آرئوس‌های جدا شده از شیر گاومیش‌های بومی در شمال غربی ایران بود. برای این منظور تعداد 75 جدایه استافیلوکوکوس آرئوس به روش PCR-RFLP مورد آزمایش قرار گرفتند. نتیجه تکثیر شده برای ژن کوآگولاز تولید باندهای با اندازه‌های 600، 700، 760 و 850 جفت باز بود که به ترتیب 12، 25، 29 و 9 مورد از جدایه‌های مورد آزمایش را شامل می‌شد. از هضم باندهای مذکور با آنزیم AluI الگوهای متفاوتی از هر اندازه بدست آمد. اما الگوهای متعلق به یک اندازه، مشابه هم بودند. نتایج آنالیز ژن کواگولاز در این مطالعه مشابه نتایج حاصل از جدایه‌های گاوی بودند.

کلیدواژه‌ها

استافیلوکوکوس آرئوس؛ ژن کوآگولاز؛ پلی مورفیسم؛ شیر گاومیش؛ PCR-RFLP

اصل مقاله

مقدمه

   حداقل ٣٠ گونه استافیلوکوکوس وجود دارد که اکثراً فلور طبیعی مخاط و پوست محسوب می‌شوند، برخی از آنان قادرند به‌صورت فرصت‌طلب ایجاد بیماری‌های مهمی را بنمایند، تولید آنزیم کوآگولاز با قدرت بیماری‌زائی آنان ارتباط مستقیم دارد. در این میان استافیلوکوکوس آرئوس اهمیت ویژه‌ای را داراست، چرا که  می‌تواند به عنوان عامل بسیار مهم در ایجاد بیماری در دام مورد توجه قرار گیرد. همچنین از جمله بیماری‌های مهم که توسط این باکتری ایجاد می‌شود مسمومیت غذایی است که از بسیاری کشورهای جهان گزارش شده است (Razavilar, 1999). گاومیش‌ها حدوداً تولید 5 در صد شیر در جهان را در اختیار داشته و در کشور ما نیز از منابع مهم تأمین شیر محسوب می‌شوند (Bromandi Jazi, 2006). اگر چه جداسازی و شناسایی آزمایشگاهی این باکتری کار چندان دشواری نمی‌باشد، اما هنوز اپیدمیولوژی مولکولی بیماری نیاز به تجزیه و تحلیل بیشتری دارد (Dastmalchi Saei and Ahmadi, 2010). تاکنون روش‌های متعددی برای مطالعه مولکولی باکتری  استافیلوکوکوس آرئوس پیشنهاد شده است که از آن جمله می‌توان به هضم کوروموزمی DNA (Weller, 2000 Busch and Nitschko, 1999;)، multilocus sequence typing (Enright et al., 2000)، pulsed-field gelelectrophoresis  (Melles et al., 2007) و تعیین تیپ بر اساس آنالیز ژن‌های Spa (Strommenger et al., 2008)، کواگولاز (Ishino et al., 2007) وaroA  (Marcos et al., 1999) اشاره نمود. استفاده از این تعداد روش متعدد بر این فرض استوار است که سویه‌های محدودی از استافیلوکوکوس آرئوس در ایجاد مسمومیت‌های غذایی یا بیماری خاص دخالت دارند (Fitzgerald et al., 1997). از آنجایی که عمده این مطالعات بر روی نمونه‌های گاوی، انسانی و حتی گوسفندی تمرکز داشته‌اند، مطالعه بر روی سویه‌های گاومیشی که جزو احشام مهم تولیدی منطقه می‌باشد می‌تواند به عنوان مطالعه‌ای ره‌‎گشا در این زمینه باشد.

 اگرچه مطالعاتی در خصوص بررسی پلی مورفیسم ژن کوآگولاز در مورد جدایه‌های استافیلوکوکوس آرئوس گاو از جمله در ایران انجام پذیرفته (Dastmalchi  Saei et al., 2009)، اما تاکنون مطالعه‌ای در خصوص جدایه‌های استافیلوکوکوس گاومیشی انجام نپذیرفته است. هدف از این مطالعه تعیین پلی مورفیسم ژن کوآگولاز استافیلوکوکوس آرئوس‌های جدا شده از شیر گاومیش در شهرستان تبریز بر اساس روش PCR-RFLP  می‌باشد.

مواد و روش­ها

نمونه‌ها

   تعداد 75 جدایه از  استافیلوکوکوس آرئوس‌های جدا شده از شیر گاومیش که قبلا از سطح دامداری‌های سنتی شهرستان تبریز جمع‌آوری شده بود تهیه و به عنوان نمونه‌های مورد مطالعه استفاده شد. بر روی کلیه نمونه‌ها آزمایش‌های کامل بیوشیمیایی انجام شده و جهت حصول اطمینان بیشتر با استفاده از روش واکنش PCR برپایه ژن نوکلئاز (nuc) نیز تعلق آنها به گونه استافیلوکوکوس آرئوس اثبات شده بود (Shayegh et al., 2013).

استخراج DNA

   استخراج DNA از 75 نمونه کشت داده شده در محیط آبگوشت قلب - مغز انجام شد. یک میلی‌لیتر از کشت‌های باکتریایی در شتابÍ g 10000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد. بعد از ریختن بافر لیزکننده شامل تریس 1 مولار (5/7 pH=)، کلرید سدیم 5 مولار، EDTA 5/0 مولار، C-TAB 2 درصد بر روی رسوب مخلوط در دمای 65 درجة سلسیوس به مدت دو ساعت در بن ماری قرار داده شده و سپس ویال‌های حاوی سلول‌های لیزشده به مدت 5 دقیقه در شتاب g Í12000 سانتریفیوژ و مایع رویی به ویال‌های دیگر منتقل و هم حجم آن کلروفرم- ایزوآمیل الکل با نسبت های 1:24 به آن اضافه و به آرامی تکان داده شد. پس از تشکیل دو فازمایع در ویال و برداشتن لایة ‌رویی و انتقال به تیوپ 5/1 میلی‌لیتری دیگر، 5/0 میکرولیتر RNAase به آن اضافه گردید و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجة سلسیوس در بن ماری قرار گرفت. بعد از 30 دقیقه، ویال‌ها را برداشته و هم حجم آنها ایزوپروپانول اضافه شد و به مدت 15 دقیقه در دمای 20- قرار داده شد. با سانتریفیوژ در شتاب g Í12000، DNA ترسیب و با قرار دادن ویال‌ها در دمای اتاق، DNA خشک گردید. در پایان، DNA خشک شده در 50 میکرولیتر آب دیونیزه حل گردید (Shayegh et al., 2013).

انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز برای ژن کواگولاز

   واکنش زنجیره‌ای پلی مراز در حجم 25 میکرو­لیتر، شامل کیت مستر PCR 5/12 میکرولیتر، پرایمرهای اختصاصی (MWG, Germany) 4/0 میکرومولار (جدول1) وDNA  استخراج شده شامل 1 میکرولیتر (50 نانوگرم) انجام گرفت. واکنش زنجیرة پلیمرازی در دستگاه ترموسایکلر (Techne) با چرخه‌های واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سلسیوس به‌مدت 5 دقیقه، 30 چرخه با مرحله واسرشته سازی در 94 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، مرحله اتصال آغازگر در دمای 55 درجه سلسیوس به‌مدت 1 دقیقه، بسط در 72 درجه سلسیوس به‌مدت 1 دقیقه و نهایتا یک چرخه بسط نهایی در 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد (Hookey et al., 1998). از محصولات حاصله در آگارز 5/1% الکتروفورز و با استفاده از ژل داکیومنت (Uvitech) عکسبرداری انجام گرفت.

 

 

 

 

جدول1- پرایمرهای مورد استفاده در واکنش PCR

نام ژن	توالی	منبع
COA	F; 5-ATA,GAG,ATG,CTG,GTA,CAG,C R; 5- GCTTCC,GAT,TGT,TCG,ATGC	Hookey et al. ,1998

 

 

برش آنزیمی قطعات تکثیر شده ژن کواگولاز

  برش آنزیمی پس از تکثیر ژن کواگولاز با پرایمرهای اختصاصی، با استفاده از آنزیم‌های برشی، اجرا شد. نوع آنزیم برشی بر اساس جایگاه برشی موجود در مقالات انتخاب شد. برای هر محصول PCR، دو بار واکنش هضم به طور جداگانه با آنزیم AluI   (Fermentas) به عمل آمد. واکنش‌های هضم به مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه‌ی سلسیوس گرم‌خانه گذاری شدند و در پایان، محصولات هضم آنزیمی با استفاده از آگارز 2 درصد الکتروفورز و نوارهای حاصل از برش در زیر نور UV مشاهده و عکس برداری انجام شد (Hookey et al., 1998).

 

یافته‌ها

نتایج انجام واکنش PCR و برش آنزیمی برای ژن کواگولاز

   ژن کوآگولاز با استفاده از جفت آغازگرهای طراحی شده توسط Hookey  و همکاران طی واکنش زنجیره‌ای پلی مراز تکثیر داده شد که در شکل 1 نشان داده شده است. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود محصولات تکثیری با اندازه‌های تقریبی 600، 700،760 و 850 جفت نوکلئوتید حاصل شدند.

 

 

 

شکل 1- الکتروفورز محصولات PCR نمونه های ژن کوآگولاز جداسازی شده از شیر گاومیش:

M: مارکر،A: باند 850،B: 760،C:700 و D:600 جفت باز

 

  

 

از 75 نمونه استافیلوکوکوس آرئوس مورد مطالعه در این پژوهش تعداد 12 نمونه حاوی ژن کوآگولاز دارای قطعه تکثیر  bp 600 جفت، 25 نمونه قطعه تکثیر  bp 700، 29 نمونه قطعه تکثیر  bp 750 و 9 نمونه دارای قطعه تکثیر  bp850 بودند

   نتایج حاصل از برش ژن کواگولاز با استفاده از آنزیم‌ برشیAluI، در شکل 2 نشان داده شده است. برای هر محصول PCR، دو واکنش هضم به طور جداگانه با آنزیم AluI  به عمل آمد. نتایج حاصل 4 الگوی مختلف برش از ژن مورد نظر را نمایش می دهد. اما هر کدام از این الگوها مربوط به یک اندازه از محصولات تکثیری بوده و تنوع خاصی در داخل یک محصول تکثیری مشاهده نشد.

 

 

 

 

 

شکل 2- الکتروفورز محصولات حاصل از برش ژن کواگولاز با استفاده از آنزیم‌ برشی AluI

M: مارکر،A: برش باند  850،B: برش باند 760،C:برش باند 700 و D: برش باند 600 جفت باز

 

بحث و نتیجه‌گیری

   این پژوهش اولین مطالعه پلی مورفیسم ژن کوآگواز در جدایه‌های استافیلوکوکوس آرئوس از شیر گاومیش در ایران محسوب شده می‌شود. مطالعه چندی در خصوص پلی مرفیسم این ژن در استافیلوکوکوس آرئوس جدا شده از شیر گاو در خارج و داخل کشور وجود دارد (Dastmalchi  Saei et al., 2009 Ishino et al., 2007;)؛ ولی به طور کلی مطالعات اندکی در خصوص استافیلوکوکوس‌های جدا شده از شیر گاومیش در جهان انجام پذیرفته است. اخیراً مطالعه در خصوص پلی مورفیسم ژن‌های aroA و spa در کشور انجام و نتایج آن منتشر شده است (Shayegh et al., 2013).

   در مطالعه حاضر 4 محصول مختلف PCR متعلق به تکثیر انتهای´ 3 ژن coa بدست آمده است. مطالعه مشابه توسط محققین دیگر نیز تنوع اندازه باند متعلق به ژن coa را تائید می‌نمایند (Dastmalchi  Saei et al., 2009 Reinoso et al., 2007;). دلیل مشخصی برای این تنوع معین نشده ولی احتمالاً ردیف‌های حذفی یا جایگزینی در داخل ژن کوآگواز موجب به وجود آمدن چنین تنوعی می‌گردند و این امر احتمالاً می‌بایستی موجب تغییر خصوصیات آنتی ژنی آنزیم در انتهای ´ 3 ژن کواگولاز نیز گردد (Dastmalchi  Saei et al., 2009). شاید یکی از دلایل تنوع آنتی ژنی و مقاومت عفونت‌های استافیلوکوکوس آرئوس همین امر باشد. به هر حال نتایج مطالعه حاضر نشان می‌دهد که تنوع باندی حاصل از ژن coa در جدایه‌های گاومیشی استافیلوکوکوس آرئوس مشابه تنوع‌های ژن مذکور در جدایه‌های گاوی آن است.

    در مطالعه حاضر آنزیم Alu I بکار رفته و اگرچه 4 الگوی مختلف برشی از ژن coa در جدایه‌های گاومیشی استافیلوکوکوس آرئوس را بدست داده ولی هر یک از این الگوها متعلق به یک نوع اندازه ژن coa  بوده و این آنزیم نتوانست تفاوت و تنوع داخلی در سایز باندهای مختلف ژن coa را نشان دهد. در مطالعه دیگری هم، این آنزیم نتوانسته بود برش مناسب در ژن coa جدایه استافیلوکوکی گاوی ایجاد نماید (Stutzenberger and San Clemente, 1967)؛ بنابراین به نظر می‌رسد آنزیم مناسبی برای نشان دادن تنوع درونی در ژن coa نباشد ولی تجربیات موفقی در استفاده از آنزیم Hae III توسط دیگران گزارش شده‌اند (Dastmalchi  Saei et al., 2009).

   عقیده بر این است که غالب بودن الگوی خاصی از ژن کوآگولاز ممکن است با مقاوم بودن سویه‌های مذکور در برابر سیستم ایمنی میزبان مرتبط باشد این امر را می‌توان به نوعی فرار از سیستم ایمنی میزبان تلقی کرد. سویه‌های با اندازه ژنی 700 و 750 جفت باز آلی دارای چنین غالبیتی می‌باشند (Reinoso et al., 2007). اما برای بررسی تنوع داخل ژنی می‌بایست از آنزیم‌های برشی بیشتری که بتواند چنین تنوع را در داخل هر کدام از گروه‌های ژنی نشان دهد استفاده گردد.

 

 

مراجع

• برومندی جزی، مسعود (1384). پرورش گاومیش، انتشارات موسسه آموزشی عالی عامی کاربردی، چاپ اول.صفحه 104-94.
• رضویلر، ودود (1378). میکروب‌های بیمای‌زا در مواد غذایی و اپید میولوژی مسمومیت‌های غذایی انتشارات دانشگاه تهران صفحه 135-127.

 

• Bromandi Jazi, M. (2006). Buffaloes culture. Applied-scientific High educational institute, Tehran[In Farsi].
• Busch, U., Nitschko, H. (1999). Methods for the differentiation of microorganisms. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications ,722: 263–278.
• Dastmalchi  Saei,  H.,  Ahmadi,  M.,  Mardani,  K.,  Batavani,  R.A.  (2009). Molecular typing of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis based on polymorphism of the coagulase gene in the north west of Iran. Veterinary Microbiology, 137: 202-206.
• Dastmalchi Saei, H. and Ahmadi, M. (2010). Genotyping of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis based on PCR-RFLP analysis of the aroA gene. Comparative Clinical Pathology, 19: 163-168.
• Enright, M.C., Day, N.P., Davies, C.E., Peacock, S.J. and Spratt, B.G. (2000). Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology, 38:1008–1015.
• Fitzgerald, J.R., Meaney, W.J., Hartigan, P.J., Smyth, C.J. and Kapur, V. (1997). Fine-structure molecular epidemiological analysis of Staphylococcus aureus recovered from cows. Epidemiology and Infection, 119: 261–269.
• Hookey JV, Richardson JF, Cookson BD. (1998) Molecular typing of Staphylococcus aureus based on PCR restriction fragment length polymorphism and DNA sequence analysis of the coagulase gene. Journal of Clinical Microbiology.36:1083–1089.
• Ishino, K., Tsuchizaki, N., Ishikawa, J. and Hotta, K. (2007). Usefulness of PCR-restriction fragment length polymorphism typing of the coagulase gene to discriminate arbekacin-resistant methicillinresistant Staphylococcus aureus strains. Journal of Clinical Microbiology, 45: 607–609.
• Marcos, J.Y., Soriano, A.C., Salazar, M.S., Moral, CH., Ramos, S.S., Smeltzer, M.S. and Carrasco, G.N. (1999). Rapid identification and typing of Staphylococcus aureus by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the aroA gene. Journal of Clinical Microbiology, 37: 570-574.
• Melles, D.C., van Leeuwen, W.B., Snijders, S.V., Horst-Kreft, D., Peeters, J.K., Verbrugh, H.A. and van Belkum, A. (2007). Comparison of multilocus sequence typing (MLST), pulsed-field gel electrophoresis (PFGE),and amplified fragment length polymorphism (AFLP) for genetic typing of Staphylococcus aureus. Journal of  Microbiological Methods, 69: 371–375.
• Razavilar, V. (1999). Pathogenic Microorganisms in foods and Epidemiology of food borne intoxication. TehranUniversity Press [In Farsi].
• Reinoso, E.B., El-Sayed, A., Lammler, C., Bogni, C. and Zschock, M., (2008). Genotyping of Staphylococcus aureus isolated from humans, bovine subclinical mastitis and food samples in Argentina. Microbiological Research, 163: 314–322.
• Shayegh, J., Barzegari, A. and Mikaili, P. (2013). Molecular characteristics of Staphylococcus aureus isolates from buffaloes milk. The Journal of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Kafkas, 19 (4): 665-668.
• Strommenger, B., Braulke, C., Heuck, D., Schmidt, C., Pasemann, B., Nubel, U. and Witte, W. (2008). spa Typing of Staphylococcus aureus as a frontline tool in epidemiological typing. Journal of Clinical Microbiology, 46: 574–581.
• Stutzenberger, F.J. and San Clemente, C.L. (1967). Nephelometric assay of bovine ntistaphylocoagulase serum. Journal of Bacteriology, 94(4): 821–825.
• Weller, T.M. (2000). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus typing methods: which should be the international standard?. Journal of Hospital Infection, 44:160–172.