مطالعه اثر غلظت‌های مختلف نمک بر بقای مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه پاراتوبرکلوزیس در پنیر سفید فراپالایشی ایرانی

بهداشت مواد غذایی

مقاله 1، دوره 2، 4 (8) زمستان، اسفند 1391، صفحه 1-14   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

شهرام حنیفیان^{* 1}؛ حسین جدیری²

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، گروه علوم و صنایع غذایی، تبریز، ایران.

²شرکت شیر پاستوریزه پگاه آذربایجان شرقی، بخش تحقیق و توسعه، تبریز، ایران

چکیده

   مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه پاراتوبرکلوزیس (مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس) به دلیل ارتباط احتمالی با بیماری کرون (Crohn’s disease) در انسان به عنوان یک مخاطره بهداشتی برای سلامتی عمومی محسوب می­گردد. هدف این مطالعه بررسی اثر غلظت­های مختلف نمک بر بقای مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس طی دوره رسیدن و نگه‌داری پنیر سفید فراپالایشی ایرانی است. شیر پاستوریزه گاوی متعاقب فرآیند فراپالایش با تعداد 2 واحد لگاریتمی در هر گرم (Log cfu/g) مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیستلقیح و سپس نمونه­های پنیر حاوی مقادیر 2%، 3% و 4% نمک از آن تهیه گردید.تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس طی دوره رسیدن و نگه‌داری با استفاده از روش­­های F57-Quantitative Real-Time PCR (F57-qPCR) و کشت ارزیابی شد. به موازات آن، جمعیت باکتری­های لاکتیکی کشت آغازگر و خصوصیات فیزیکوشیمیایی در نمونه­های پنیر تعیین گردید. بر اساس نتایج مطالعه، کاهش تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در نیمه اول دوره نگه‌داری (روز 1 تا روز 30) در تمامی نمونه­ها آهسته و غیرمعنی­دار (05/0p>) بود. اما با پیشرفت این دوره (از روز 30 تا روز 60)، روند کاهش تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس سریع و به لحاظ آماری معنی­دار (01/0p<) گردید. هم­چنین، در پایان دوره نگه‌داری (روز 60) تفاوت تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در نمونه­های پنیر دارای 4% نمک، به طور معنی­داری (01/0>p) کمتر از نمونه­های تهیه شده با 2% و 3 % نمک بود. با این حال در تمامی نمونه­ها مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس بقای خود را تا انتهای دوره نگه‌داری حفظ نمود. به نظر می‌رسد استفاده از غلظت­های بالاتر نمک روند کاهش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس را تسریع می­کند. به علاوه، با توجه به اثر زمان بر روند از بین رفتن مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس، نگه‌داری پنیر سفید فراپالایشی تا اواخر دوره موجب غیرفعال شدن تعداد بیشتری از مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس می­گردد. 

کلیدواژه‌ها

پنیر سفید فراپالایشی ایرانی؛ مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه پاراتوبرکلوزیس؛ نمک؛ F57-Real-Time PCR

اصل مقاله

مقدمه

   پنیر سفید فراپالایشی ایرانی (Iranian ultra-filtrate white cheese) از شیر پاستوریزه (72 درجه سلسیوس و 15 ثانیه) گاو و متعاقب فرآیند فراپالایش تولید می‌گردد. این پنیر با افزودن رنت و باکتری­های آغازگر لاکتیکی مزوفیل (mesophilic lactic acid bacteria) تهیه می­شود. از دیگر خصوصیات پنیر سفید فراپالایشی دارا بودن حداقل میزان 34 درصد (وزنی-وزنی) ماده خشک و حداقل pH بین 6/4 تا 8/4 می­باشد. در این نوع پنیر، نمک به مقدار 2 تا 4 درصد و به صورت خشک (dry salting) به لخته اضافه می­شود (Karami et al., 2009). طبق دستورالعمل تهیه پنیر سفید فراپالایشی ایرانی، این نوع پنیر پس از طی دوره رسیدن (Ripening) کوتاه مدت (در دمای 27 درجه سلسیوس به مدت 1 روز) و دوره نگه‌داری (در دمای 8 درجه سلسیوس به مدت 1 تا 2 هفته) به بازار عرضه می­گردد (Karami et al., 2009).

   مایکوباکتریوم اویوم زیرگونه پاراتوبرکلوزیس (مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس) عامل بیماری یون (John’s disease) در نشخوارکنندگان اهلی و وحشی است (Botsaris et al., 2010). به دلیل ماهیت مزمن این بیماری، علایم بالینی معمولاً 2 تا 5 سال بعد از آلوده شدن دام بروز می­یابد. این در حالی است که دام‌های آلوده 18 ماه قبل از شروع علایم بیماری، باکتری را از طریق مدفوع و شیر دفع می‌کنند (Slana et al., 2008). به ویژه آن که اسهال مزمن و مقاوم به درمان از علایم بارز این بیماری است و می­تواند موجب آلودگی شیر و محیط دامداری گردد. مطالعات انجام یافته نیز حاکی از افزایش احتمال آلودگی ثانویه شیر هنگام شیردوشی دستی می­باشند (Grant and Rees, 2010; Hanifian et al., 2013).

   از سال 1932 فرضیه مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس به عنوان عامل احتمالی بیماری کرون (Crohn’s disease) در انسان مطرح شد (Rodrίguez-Lázaro et al., 2005). چرا که در بسیاری از مطالعات انجام یافته این باکتری از بیماران مبتلا به کرون جداسازی گردید. در مقابل در تعدادی دیگر از بررسی­ها، مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و شواهد حضور آن از جمله وجود آنتی­بادی اختصاصی و DNA باکتری در مبتلایان به کرون گزارش نشده است (Harris and Barletta, 2001). به رغم یافته­های متناقض در این باره، شباهت‌های علایم بالینی و کالبدگشایی بیماری یون و کرون احتمال نقش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در بیماری کرون را قوت می­بخشد. به همین دلیل این باکتری به عنوان یک مخاطره بهداشتی برای سلامتی عمومی مطرح شده است (Klanicova et al., 2012). در همین راستا مطالعات متعددی با هدف ردیابی و جداسازی مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس انجام یافته است (Eltholth et al., 2009). نتیجه این بررسی­ها در سرتاسر جهان حاکی از شیوع بالای این باکتری در بین گله­های گاو شیرده و شیر تولیدی آن‌هاست (Okura et al., 2012). در ایران نیز شیوع بالای مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در شیرهای خام و پاستوریزه گزارش گردیده است (Hanifian et al., 2013 Fathi et al., 2011; Anzabi and Hanifian, 2012;).

   به رغم شواهد موجود در ارتباط با آلودگی بالای شیرهای خام با مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و پیامدهای آن برای سلامت مصرف کنندگان شیر و فرآورده­های آن، بررسی‌های محدودی در مورد بقای این باکتری در مواد غذایی و از آن جمله در انواع مختلف پنیر صورت پذیرفته است (Spahr and Schafroth, 2001; Donaghy et al., 2004). این مطالعه با هدف بررسی رفتار مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و ارزیابی غلظت‌های مختلف نمک بر بقای آن طی دوره رسیدن و نگه‌داری پنیر سفید فراپالایشی ایرانی انجام گرفت.

 

مواد و روش‌ها

 

- تهیه مقدار تلقیح مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس

 

   در این مطالعه مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس سویه44133 DSM  (German Collection of Microorganisms and Cell, Germany) برای تلقیح در پنیر سفید فراپالایشی مورد استفاده قرار گرفت. برای این منظور ابتدا باکتری در محیط اختصاصی Middlebrook 7H9 broth (Fluka, Switzerland) کشت و به مدت 45 روز در 37 درجه سلسیوس به صورت هوازی گرمخانه­گذاری گردید. سپس سلول­های میکروبی با استفاده از سانتریفیوژ با شتاب g× 4000 و مدت 20 دقیقه جداسازی شد. سلول­های میکروبی در 5/2 میلی­لیتر محلول استریل فسفات­بافرنمکی (PBS) حاوی 05/0 درصد (حجمی-حجمی) توین 20 (PBS-T) (Merck, Germany) با pH معادل 4/7 به طور کامل مخلوط گردید تا سوسپانسیون یکنواختی به دست آید (Donaghy et al., 2004). یکنواختی پراکندگی سلول‌های باکتریایی و هم­چنین تعداد تقریبی آن در سوسپانسیون با استفاده از لام Thoma ارزیابی گردید. سپس تعداد دقیق مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در سوسپانسیون با روش (F57-qPCR) F57-quantitative real time PCR تعیین شد (Hanifian et al., 2013). قبل از تلقیح باکتری، سوسپانسیون باکتری با استفاده از محلول استریل PBS-T رقیق گردید تا تعداد آن به 2 واحد لگاریتمی در هر گرم (Log cfu/g) از شیر فراپالایش شده برسد.

 

- تهیه پنیر سفید فراپالایشی ایرانی

   نمونه­های پنیر در کارخانه شیر پاستوریزه پگاه آذربایجان‌شرقی و طبق دستورالعمل تهیه پنیر سفید فراپالایشی تهیه گردیدند (Bylund, 1995). برای این منظور ابتدا شیر گاو تا دمای 72 درجه سلسیوس و مدت 15 ثانیه پاستوریزه شد. سپس طی فرآیند فراپالایش مقدار 1/5 کیلوگرم شیر به 1 کیلوگرم شیر فراپالایش شده (Retentate) تغلیظ شد و این بار در دمای 78 درجه سلسیوس به مدت 60 ثانیه پاستوریزه گردید. شیر تغلیظ شده ابتدا تا 35 درجه سلسیوس خنک‌سازی و با تعداد Log cfu/g 2 از مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس تلقیح شد. سپس کشت آغازگر متشکل از باکتری­های لاکتیکی هوموفرمانتاتیو (FD-DVS FRC-65) (Chr. Hansen, Denmark) به مقدار 100 گرم به ازای 5000 کیلوگرم شیر فراپالایش شده اضافه گردید و به ظروف مخصوص پنیر که قبلاً به ماده ضدچسبندگی (ppm 15) آغشته شده بود (Danapak, Denmark) انتقال داده شد. در نهایت رنت (Chr. Hansens, Denmark) به مقدار 002/0 درصد (وزنی-وزنی) و ماده ضدکف (ppm 10) به مخلوط اضافه گردید. مرحله لخته شدن پنیر در دمای 30 درجه سلسیوس و مدت 20 دقیقه انجام گرفت. سطح لخته با کاغذ مخصوص (Parchment paper) پوشانده شد و پس از افزودن مقادیر 2، 3 و 4 درصد نمک بر روی نمونه­های مختلف پنیر، درب ظروف با فویل آلومینیمی مسدود گردید. نمونه­های پنیر برای طی دوره رسیدن به مدت 1 روز (یعنی تا هنگام نزول pH نمونه­ها به حدود 1/0 ± 7/4) در گرمخانه 27 درجه سلسیوس قرار گرفتند. در نهایت نمونه­ها به مدت 2 ماه در سردخانه 8 درجه سلسیوس نگه‌داری شدند  (Karami et al., 2009).

 

- طرح مطالعه

   سه نوع پنیر سفید فراپالایشی (با در نظر گرفتن غلظت­های 2، 3 و 4 درصد نمک) و به تعداد 8 نمونه از هر نوع پنیر تهیه شد. آزمون­های میکروبی (شمارش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و شمارش باکتری‌های کشت آغازگر) و شیمیایی (pH، درصد رطوبت و درصد نمک) بر روی نمونه­های پنیر در یک دوره 60 روزه و طی مراحل زیر انجام گرفت: 1- زمان تهیه پنیر (روز صفر)؛ 2- متعاقب رسیدن (Ripening) در 27 درجه سلسیوس به مدت 1 روز (روز 1)؛ 3- طی دوره نگه‌داری در دمای 8 درجه سلسیوس  (روزهای 10، 20، 30، 40، 50 و 60). 

 

 - آماده­سازی نمونه­های پنیر برای آزمایش

   مقدار 10 گرم از هر نمونه پنیر با 90 میلی­لیتر محلول رقیق‌کننده پنیر مخلوط گردید. ترکیب محلول رقیق­کننده از سیترات سدیم (2 درصد)، کازیتون (1 درصد) و کلریدسدیم (5/0 درصد) (Merck, Germany) تشکیل شده بود (Hanifian and Khani, 2012). مخلوط پنیر و رقیق­کننده به مدت 45 دقیقه در بن­ماری 37 درجه سلسیوس قرار گرفت تا سوسپانسیون کاملاً یکنواخت به دست آید. دو مقدار 50 میلی‌لیتری از هر سوسپانسیون به دو فالکون استریل انتقال یافت و در شتاب ×g 4000 و مدت 30 دقیقه رسوب داده شد. مایع رویی فالکون­ها حذف و هر یک از رسوب‌ها در 2 میلی­لیتر PBS-T حل و به میکروتیوب استریل انتقال داده شد. محتویات میکروتیوب با شتاب ×g 16099 رسوب داده شد و مایع رویی حذف گردید (Hanifian and Khani, 2012). رسوب­های حاصل از هر نمونه پنیر برای استخراج DNA و آزمایش کشت میکروبی مورد استفاده قرار گرفت.

 

- استخراج DNA و شمارش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس با روش Quantitative Real-Time PCR

   برای استخراج DNA ژنومی مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس از روش (Hanifian et al., 2013) استفاده گردید. به منظور کنترل صحت فرآیند استخراج مقدار 4 میکرولیتر از Internal DNA Extraction Control به هر لوله استخراج DNA اضافه شد (PrimerDesign LTD, UK). غلظت DNA استخراج شده (نانوگرم در هر میکرولیتر) با (Thermo Scientific, USA) Nanodrop 1000  و در طول موج 260 نانومتر بررسی شد. به علاوه، جهت ارزیابی خلوص DNA از نسبت طول موج­های 280/260 استفاده گردید.

   برای جستجوی اختصاصی و هم‌چنین تعیین کمیت مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس از ژن اختصاصی F57 (با طول 147 جفت باز) استفاده گردید (Grant and Rees, 2010). ترکیب واکنش از 10 میکرولیتر2× Precision MasterMix (PrimerDesign LTD, UK)، 1 میکرولیتر مخلوط پرایمر و پروب Internal Extraction Control، 1 میکرولیتر مخلوط پرایمرها و پروب TaqMan® (FAM labeled, BHQ quenched)، و 5 میکرولیتر DNA الگو تشکیل شده بود. حجم نهایی مخلوط واکنش با افزودن آب یون­زدایی شده (deionized) (CinnaGen, Iran) به 20 میکرولیتر رسید. منحنی استاندارد حاوی توالی کامل ژن F57 با تهیه رقت­های سریال از 10⁶ × 00/1 تا 10¹ × 00/1 طبق دستورالعمل سازنده کیت (PrimerDesign LTD, UK) ترسیم گردید.

واکنش F57-qPCR در ترمال‌سایکلر (Bio-Rad, USA) با یک سیکل دمایی 95 درجه سلسیوس و مدت 10 دقیقه جهت فعال­سازی آنزیم آغاز گردید. سپس 50 سیکل دمایی 95 درجه سلسیوس به مدت 10 ثانیه و 60 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه تکرار گردید. جهت تخمین تعداد قطعی (Absolute quantification) ژن F57، سیکل آستانه (Cycle of threshold = Ct) به دست آمده برای هر نمونه در نرم­افزار Bio-Rad iQ5 با منحنی استاندارد مقایسه گردید و تعداد قطعی ژن برآورد گردید. تمامی نمونه­ها و هم‌چنین نمونه­های شاهد مثبت (واکنش حاوی ژن F57) و منفی (واکنش حاوی آب یون­زدایی شده به جای DNA الگو) در دو تکرار ارزیابی گردید.

 

- شمارش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس با روش کشت

   رسوب حاصل از میکروتیوب دوم هر نمونه برای آزمایش کشت مورد استفاده قرار گرفت. برای جلوگیری از رشد میکروب‌های ناخواسته موجود در نمونه­های پنیر (از جمله باکتری‌های کشت آغازگر و باکتری‌های آلوده‌کننده) در طی دوره طولانی گرمخانه‌گذاری، نمونه­ها قبل از کشت در محیط اختصاصی آلودگی­زدایی (decontamination) گردید. برای این کار رسوب­ها پس از انتقال به فالکون استریل، مقدار 15 میلی‌لیتر محلول استریل و تازه تهیه شده هگزادسیل‌پریدینیوم کلراید (hexadecylpyridinium chloride) (Merck, Germany) 75/0 درصد (وزنی-وزنی) بر روی آن­ها اضافه شد و به مدت 5 ساعت در دمای آزمایشگاه (حدود 25 درجه سلسیوس) نگه‌داری گردید (Dundee et al., 2001). رسوب فالکون با شتاب ×g 4000 و مدت 15 دقیقه جداسازی شد و با 5/2 میلی­لیتر محلول استریل PBS-T مخلوط گردید. از سوسپانسیون در پنج فلاسک­ کشت بافت حاوی محیط اختصاصی (مقدار 5/0 میلی­لیتر در هر محیط) کشت داده شد. برای کشت از محیط پایه (Sigma-Aldrich, USA) Middlebrook 7H11 agar حاوی مکمل رشد OADC (Fluka, Switzerland)، فاکتور جذب آهن مایکوباکتین (2 میکروگرم در میلی‌لیتر)، کاربینیسیلین (50 میکروگرم در میلی­لیتر)، تری‌متوپریم (20 میکروگرم در میلی­لیتر)، پلی­میکسین B (200 واحد در میلی­لیتر) و آمفوتریسین B (10 میکروگرم در میلی­لیتر) (Sigma–Aldrich, USA) استفاده گردید. محیط­های کشت در شرایط هوازی، دمای 37 درجه سلسیوس و مدت 16 هفته گرمخانه‌گذاری گردید (Whittington et al., 1999).   

 

- آزمایش­های میکروبی و فیزیکوشیمیایی

   شمارش لاکتوکوکوس­های کشت آغازگر در محیط (Merck, Germany) M17 agar در دمای 30 درجه سلسیوس و مدت 3 روز صورت پذیرفت (Domig et al., 2003) و لاکتوباسیلوس­ها در محیط (Merck, Germany) Rogosa agar در دمای 37 درجه سلسیوس و مدت 3 روز شمارش گردید. برای تأمین شرایط اتمسفری لازم جهت رشد لاکتوباسیلوس­ها از گازپک نوع C (Merck, Germany) و جار بی‌هوازی استفاده شد (Gardiner et al., 1998; Østlie et al., 2004).

   میزان pH نمونه­های پنیر با pH متر دیجیتال مجهز به پروب دمایی (Hanna Instruments, USA) تعیین گردید. هم­چنین اندازه­گیری درصد رطوبت با روش خشک کردن در آون (دمای 2 ± 102درجه سلسیوس) (Hanifian and Khani, 2012) و درصد نمک با روش ولهارد (Volhard) صورت پذیرفت (Rajković et al., 2010).

 

- تجزیهوتحلیلآماری

   این مطالعه چهار بار و طی روزهای مجزا تکرار گردید. ابتدا نتایج حاصل از شمارش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و باکتری­های کشت آغازگر به مقیاس لگاریتمی تبدیل شد. نرمال بودن توزیع داده­ها با آزمون‌هایSkewness  و Kurtosis بررسی شد. پس از انجام آمار توصیفی (میانگین و انحراف معیار) بر روی داده­های مطالعه، تغییرات آن­ها در طی مراحل مختلف تهیه، رسیدن و نگه‌داری پنیر با آنالیز واریانس (ANOVA) و آزمون دانکن (Duncan’s test) مقایسه گردید (SPSS, Version 17).

 

یافته­ها

   در اغلب نتایج کشت، کلونی‌های قابل شمارش پس از 6 تا 8 هفته گرمخانه­گذاری ظاهر گردید و ادامه گرمخانه­گذاری منجر به رشد کلونی­های بیشتر نشد. حتی در برخی مواقع، گرمخانه­گذاری طولانی­تر (8 تا 16 هفته) منجر به رشد میکروب­های آلوده‌کننده- که اغلب متعلق به استرپتومایسس­ها و جنس­های مختلف کپکی بودند - گردید. در مواردی نیز نتیجه کشت در پایان دوره گرمخانه­گذاری منفی بود که موجب بروز تفاوت زیاد در برآورد نتایج شمارش مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس با روش کشت و F57-qPCR می‌گردید. به عبارتی تعداد کلونی­های شمارش شده کمتر از تعدادی بود که در  F57-qPCRدر نمونه­های مشابه تعیین گردیده بود. لذا در این مطالعه، تحلیل­های آماری و هم­چنین بحث و نتیجه­گیری بر اساس داده­های مستخرج از روش F57-qPCR انجام گرفت.         

   تغییرات تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس شمارش شده با روش F57-qPCR در نمونه­های پنیر با درصد نمک متفاوت در نمودار (1) نشان داده شده است. بر اساس نتایج مطالعه، میانگین تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در روز 10 نسبت به زمان تلقیح باکتری افزایش مختصری داشته است که از نظر آماری غیرمعنی‌دار (05/0<p) بود. اما از روز 10 دوره نگه‌داری تا روز 60 کاهش تدریجی در تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس مشاهده گردید. با این تفاوت که در ابتدای دوره (روز 1 تا روز 30) میزان کاهش تعداد باکتری کم و غیرمعنی­دار (05/0<p) و در اواخر دوره به ویژه از روز 40 تا 60 کاهش از نظر آماری معنی­دار (05/0>p) بود. با این حال مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در انتهای 60 روز نگه‌داری در تمامی نمونه­ها ردیابی گردید.

   نتایج مطالعه نشان داد تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در نمونه­های دارای 2 و 3 درصد نمک تفاوت معنی­داری (05/0<p) ندارند. به این معنی که در پایان 60 روز نگه‌داری تعداد باکتری در این نمونه­ها به ترتیب 56/1 و Log cfu/g 48/1 بود. در مقابل، تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در نمونه­های حاوی 4 درصد نمک در انتهای دوره نگه‌داری به Log cfu/g 9/0 رسید که از نظر آماری معنی‌دار (01/0>p) بود.

 

 

 

 

نمودار 1- تغییرات تعداد (میانگین ± انحراف معیار) مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در نمونه­های پنیر با درصد نمک متفاوت طی فرآیند تولید، رسیدن و نگه‌داری

 

 

 

   در نمودار (2) میانگین تعداد باکتری­های کشت آغازگر در نمونه‌های مختلف پنیر نشان داده شده است. در این مطالعه برای تهیه نمونه­های پنیر، نسبت مساوی از لاکتوباسیلوس­ها و لاکتوکوکوس­های به عنوان کشت آغازگر استفاده گردید. با توجه به غیرمعنی­دار (05/0<p) بودن تفاوت تعداد لاکتوباسیلوس­ها و لاکتوکوکوس­ها در مراحل مختلف تهیه، رسیدن و نگه‌داری پنیر، میانگین تعداد این دو گروه از باکتری­ها مد نظر قرار گرفت. طبق این نتایج، تعداد باکتری­های کشت آغازگر طی دوره رسیدن (روز 1) افزایش معنی‌داری (01/0>p) نشان داد. سپس به تدریج جمعیت این باکتری­ها تا انتهای دوره نگه‌داری کاهش پیدا کرد. طبق نتایج مطالعه، تفاوت تعداد باکتری­های اسیدلاکتیک در نمونه‌های پنیر با درصدهای مختلف نمک به لحاظ آماری معنی­دار (05/0<p) نبود.

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2- تغییرات تعداد (میانگین ± انحراف معیار) باکتری­های لاکتیکی کشت آغازگر در نمونه­های پنیر با درصد نمک متفاوت طی فرآیند تولید، رسیدن و نگه‌داری

 

  

 

   خصوصیات شیمیایی نمونه­های پنیر در نمودار (3) نشان داده شده است. بر اساس این نتایج، میانگین pH از 4/6 در زمان تلقیح به حدود 7/4 در انتهای زمان رسیدن (روز 1) کاهش پیدا کرد که این مقدار کاهش از نظر آماری معنی­داری (01/0>p) بود (نمودار 3-1). اما در دوره نگه‌داری (روز 1 تا روز 60) یک روند تقریباً ثابت مشاهده گردید. در ضمن تغییرات pH در نمونه‌های با درصد نمک 2، 3 و 4 در طی فرآیند تهیه، رسیدن و نگه‌داری نمونه­های پنیر تفاوت معنی‌داری (05/0<p) نداشتند.

   در نمودار (3-2) و (3-3) به ترتیب درصد رطوبت و درصد نمک در نمونه­های مختلف پنیر نشان داده شده است. آن­چه از این دو نمودار مشهود است تغییرات بسیار مختصر در درصد رطوبت و نمک تا پایان دوره نگه‌داری است. به نحوی که میانگین رطوبت به میزان 55/1 درصد کاهش و میانگین نمک به میزان 4/0 درصد افزایش یافته است. در ضمن طبق یافته­های مطالعه، درصد رطوبت بین نمونه­های پنیر با درصدهای مختلف نمک تفاوت معنی‌داری (05/0<p) نشان نداد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3- تغییرات شیمیایی (میانگین ± انحراف معیار) در نمونه­های پنیر با درصد نمک متفاوت طی فرآیند تولید، رسیدن و نگه‌داری. 1- pH؛
2- درصد رطوبت؛ 3- درصد نمک

بحث و نتیجه­گیری

   در مطالعات مختلف برای ردیابی مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس از ژن­های متعددی نظیر loci251 و loci255، IS900، hspX وF57 استفاده می‌شود. ژنوم مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس به دلیل دارا بودن 14 تا 20 کپی از ژن IS900 برای ردیابی با حساسیت بالای این باکتری مناسب می­باشد (Grant and Rees, 2010). اما با توجه به حضور توالی­های مشابه IS900 در گونه­هایی نظیر مایکوباکتریوم پورسینوم (M. porcinum)، مایکوباکتریوم اویوم (M. avium) جداسازی شده از بیماران مبتلا به ایدز، مایکوباکتریوم اسکروفولاسئوم (M. scrofulaceum) و مایکوباکتریوم کوکی (M. cookie) ویژگی این ژن بسیار کم است. هم­چنین با توجه به مشخص نبودن تعداد دقیق کپی­های IS900 در ژنوم مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس امکان تخمین دقیق تعداد این باکتری با روش qPCR وجود ندارد (Grant and Rees, 2010; Hanifian et al., 2013). اما در مقابل ژن F57 مختص گونه پاراتوبرکلوزیس است و به تعداد یک کپی در ژنوم این باکتری وجود دارد. لذا ردیابی این ژن نه تنها ویژگی بالایی خواهد داشت، بلکه امکان تخمین دقیق تعداد آن را فراهم می‌آورد (Slana et al., 2008; Grant and Rees, 2010). بر همین اساس، در این مطالعه از ژن F57 برای شمارش قطعی (Absolute quantification) تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس استفاده گردید.

   برای پایش تغییرات مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس علاوه بر روش F57-qPCR از روش کشت نیز استفاده گردید. مقایسه داده­های حاصل نشانگر پایین بودن برآورد تعداد باکتری هنگام استفاده از روش کشت بود. در مطالعات متعدد دلیل این تفاوت را حساسیت کمتر روش کشت در ردیابی مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس مطرح نموده­اند (Anzabi and Hanifian, 2012; Okura et al., 2012; Hanifian et al., 2013). وجود تعداد کم باکتری در نمونه­های مورد آزمایش (کمتر از  Log cfu/g2) و هم­چنین اثر منفی عوامل آسیب­رسان موجب عدم رشد باکتری­­ها و در نتیجه عدم موفقیت در حصول کلونی مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس می­گردد. عقیده بر این است مواد شیمیایی مورد استفاده برای آلودگی­زادیی نمونه­ها می‌تواند تعدادی از سلول­های مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس را غیرفعال نماید و در نتیجه حساسیت روش کشت را کاهش دهد (Dundee et al., 2001). از سوی دیگر طولانی بودن دوره گرمخانه‌گذاری تحت شرایط هوازی باعث تبخیر آب و خشک شدن محیط کشت می­گردد که پیامد آن عدم موفقیت در جداسازی باکتری است. در این مطالعه برای جلوگیری از اثرات منفی عوامل فوق، اولاً تمامی نمونه­ها با محلول 75/0 درصد هگزادسیل­پریدینیوم کلراید به مدت 5 ساعت آلودگی­زدایی شد. طبق بررسی­های­ انجام یافته، استفاده از هگزادسیل‌پریدینیوم کلراید مطلوب­ترین روش آلودگی­زدایی محسوب می‌گردد (Dundee et al., 2001). ثانیاً، محیط­ کشت در فلاسک­های کشت بافت (Tissue culture flask) توزیع و در شرایط اتمسفری اشباع شده با بخار آب گرمخانه‌گذاری گردید تا خشک شدن محیط کشت به حداقل برسد. با این حال نتایج حاصل از روش کشت حتی در زمان تلقیح باکتری تفاوت زیادی با نتایج F57-qPCR نشان داد. به همین دلیل، در این مطالعه از نتایج کشت صرفاً جهت تأیید زنده بودن مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس استفاده گردید و تحلیل­های آماری بر اساس روش F57-qPCR صورت پذیرفت.

با توجه به نتایج نمودار (1) تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس طی دوره رسیدن (از زمان تلقیح تا روز 1) تغییر محسوسی نداشت. اما در روز 10 نگه‌داری میانگین تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در تمامی تیمارها به میزان Log cfu/g 12/0 افزایش یافت. با توجه به این که رشد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس وابسته به مایکوباکتین (عامل شلاته کننده آهن) می‌باشد، امکان رشد آن در خارج از سلول­ میزبان (شرایط in vitro) وجود ندارد (Spahr and Schafroth, 2001)، لذا افزایش مختصر تعداد آن در طی دوره رسیدن می‌تواند در نتیجه خروج آب از بافت پنیر (Syneresis) و اثر تغلیظی آن بر جمعیت باکتریایی باشد. کاهش 1 درصدی رطوبت در نمونه­های پنیر طی همین دوره (نمودار 3-2) مؤید این فرضیه می‌باشد.

   طبق یافته­های این مطالعه، میانگین تعداد باکتری­های کشت آغازگر در پایان دوره رسیدن (روز 1) به حدود Log cfu/g 17/9 (نمودار 2) و میانگین میزان pH به 73/4 رسید (نمودار 3-1). در برخی از مطالعات انجام یافته نتایج مشابهی به دست آمده است که پیامد آن کاهش قابل ملاحظه تعداد باکتری­های بیماری­زای تلقیح شده متعاقب دوره رسیدن پنیر بود (Mohammadi et al., 2011; Hanifian and Khani, 2012,). در اغلب این مطالعات، افت شدید pH، رقابت برای به دست آوردن مواد مغذی و هم­چنین تولید متابولیت­هایی با اثر آنتاگونیستی توسط باکتری­های لاکتیکی، عامل اصلی کاهش جمعیت میکروب­های بیماری‌زا نظیر اشریشیا کولای O157: H7 و یرسینیا انتروکولیتیکا معرفی شده است (Mohammadi et al., 2011; Hanifian and Khani, 2012,). اما بر خلاف این نتایج، در مطالعه اخیر تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در پایان دوره رسیدن کاهش پیدا نکرد (نمودار 1). به نظر می­رسد مقاومت زیاد مایکوباکتریوم­هادر قیاس با سایر جنس‌های باکتریایی نسبت به شرایط نامساعد محیطی مهمترین عامل مقاومت مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در طی دوره رسیدن باشد.

   نتایج مطالعه نشان داد، با گذشت زمان نگه‌داری تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس کاهش می­یابد. این روند کاهش در مراحل انتهایی دوره (روز 40 تا روز 60) چشمگیرتر است (نمودار 1). احتمالاً قرارگیری طولانی مدت باکتری در معرض عوامل نامساعد نظیر pH اسیدی، ترکیبات ضدمیکروبی تولید شده توسط کشت آغازگر و حضور نمک موجب از بین رفتن سلول­های حساس میکروبی گردیده است. نتایج مطالعات مشابه نیز حاکی از مقاومت بالای مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و کاهش آرام و تدریجی این باکتری در طی دوره رسیدن و نگه‌داری پنیر سخت و نیمه‌سخت سوئیسی (Spahr and Schafroth, 2001) و پنیر چدار (Donaghy et al., 2004) می­باشد.

   با مقایسه تعداد مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در نمونه­های تهیه شده با درصدهای مختلف نمک مشخص گردید در نمونه­هایی دارای 4 درصد نمک روند کاهش باکتری نسبت به نمونه­های 2 و 3 درصد نمک معنی‌دار (01/0>p) بود (نمودار 3-3). در مطالعه مشابهی استفاده از غلظت­های بالاتر نمک موجب تسریع غیرفعال شدن یرسینیا انتروکولیتیکا در پنیر سفید ایرانی گردید. هر چند استفاده از درصدهای بالاتر نمک موجب حذف کامل باکتری از پنیر نشد (Hanifian and Karim, 2006). تفاوت رفتار مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس و بسیاری از باکتری­های بیماری­زا نسبت به شرایط نامساعد ایجاد شده در نتیجه افزودن نمک را می­توان به مقاومت و دوام بالای مایکوباکتریوم‌ها و از آن جمله مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس نسبت داد (Sung and Collins, 2000).

   بررسی­های میکروسکوپیکی نشان داده است، مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس تشکیل توده‌هایی (Clump) متشکل از ده‌ها سلول میکروبی را می­دهند که به صورت دوره­ای از مدفوع دام­های مبتلا به یون دفع می‌شوند (Lund et al, 2002). مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در آرایش توده­­ای در مقایسه با سلول‌های منفرد این باکتری پایداری بیشتری در مقابل عوامل نامساعد و از آن جمله تیمارهای حرارتی دارد (Rowe et al., 2000). از آن جایی که بخش عمده آلودگی در شیر خام به صورت ثانویه و از طریق آلودگی مدفوعی است، لذا حضور فرم­های توده­ای مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در شیر خام به ویژه زمانی که شیردوشی به صورت دستی انجام می­پذیرد، بسیار محتمل است (Hanifian et al., 2013). وجود اشکال توده­ای مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در شیر خام امکان بقای آن را پس از پاستوریزاسیون افزایش می­دهد (Rowe et al., 2000). هر چند احتمال آلودگی ثانویه متعاقب پاستوریزاسیون و در نتیجه تماس با سطوح آلوده محل بسته‌بندی نیز وجود دارد (Lund et al., 2002).

   در مطالعه اخیر، بقای مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در تمامی نمونه­های پنیر با درصدهای متفاوت نمک تا پایان دوره نگه‌داری حفظ گردید. احتمالاً به­کارگیری غلطت­های بالاتر نمک بتواند اثر مهاری بیشتری اعمال نماید. اما استفاده از غلظت­های زیادتر نمک علاوه بر اثرات منفی بر کیفیت حسی (Organoleptic) محصول، از سوی ارگان­های بهداشتی محدود شده است. هم‌چنین، با عنایت به این که حداکثر زمان نگه‌داری پنیر سفید فراپالایشی 60 تا 75 روز می­باشد، لذا امکان نگه‌داری طولانی­تر آن با هدف غیرفعال نمودن تعداد بیشتر مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس منتفی است. بنابراین تنها راه عملی برای مواجهه با مخاطره مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس در پنیر سفید فراپالایشی انتخاب شیرهای غیرآلوده برای تولید پنیر و هم‌چنین اعمال تیمارهای حرارتی موثرتر از تیمارهای فعلی (72 درجه سلسیوس و 15 ثانیه) و جلوگیری از آلودگی ثانویه می‌باشد. به علاوه، می­توان برای تهیه پنیر سفید فراپالایشی از کشت­های آغازگر با قابلیت تولید باکتریوسین­ها جهت کمک به سایر عوامل ضدمیکروبی موجود در پنیر و تسریع روند غیرفعال شدن باکتری­های بیماری­زا استفاده نمود.

مراجع

• حنیفیان، شهرام و کریم، گیتی (1385). مطالعه اثر متقابل لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس بر بقای یرسینیا انتروکولیتیکا در طی تهیه و رسیدن پنیر سفید ایرانی. مجله علوم دامپزشکی ایران، شماره 3، صفحه 492-485.
• ·    محمدی، خسرو.، کریم، گیتی.، حنیفیان، شهرام.، تاری­نژاد، علی‌رضا و قاسم­نژاد.، رضا (1390). مطالعه تأثیر اسانس گیاه آویشن شیرازی بر باکتری Escherichia coli O157:H7 در پنیر سفید آب­نمکی طی فرآیند تولید و نگه‌داری. مجله بهداشت مواد غذایی، شماره 2، صفحه 79-69.

 

• Anzabi, Y. and Hanifian, S. (2012). Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in pasteurized milk by IS900 PCR and culture method. African Journal Microbiology Research, 6: 1453–1456.
• Botsaris, G., Slana, I., Liapi, M., Dodd, C., Economides, C., Rees, C. and Pavlik, I. (2010). Rapid detection methods for viable Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in milk and cheese. International Journal of Food Microbiology, 141: S87–S90.
• Bylund, G. (1995). Dairy processing handbook. Tetra Pak processing systems AB. Sweden: Lund, pp. 320–328.
• Domig, K.J., Mayer, H.K. and Kneifel, W. (2003). Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp.: 1. Media for isolation and enumeration. International Journal of Food Microbiology, 88: 147–164.
• Donaghy, J.A., Totton, N.L. and Rowe, M.T. (2004). Persistence of Mycobacterium paratuberculosis during manufacture and ripening of cheddar cheese. Applied and Environmental Microbiology, 70: 4899–4905.
• Dundee, L., Grant, I.R., Ball, H.J. and Rowe, M.T. (2001). Comparative evaluation of four decontamination protocols for the isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from milk. Letters in Applied Microbiology, 33: 173–177.
• Eltholth, M.M., Marsh, V.R., Van Winden, S. and Guitian, F.J. (2009). Contamination of food products with Mycobacterium avium paratuberculosis: a systematic review. Applied and Environmental Microbiology, 107: 1061–1071.
• Fathi, R., Sarkarati, F., Eslami, M., Rezavand, B. and Nourizadeh, A. (2011). Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cow milk using culture and PCR methods. Archives of Razi Institute, 66: 95–100.
• Gardiner, G., Ross, R.P., Collins, J.K., Fitzgerald, G. and Stanton, C. (1998). Development of a probiotic cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains. Applied and Environmental Microbiology, 64: 2192–2199.
• Grant, I.R. and Rees, C.E.D. (2010). Mycobacterium. In: Liu, D., (Ed.), Molecular detection of foodborne pathogens. CRC Press, New South Wales, pp. 229–243.
• Hanifian, S. and Karim, G. (2006). A study on the effect of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus on survival of Yersinia enterocolitica during manufacture and storage of Iranian white cheese. Iranian Journal of Veterinary Sciences, 3: 485–492 [In Farsi].
• Hanifian, S. and Khani, S. (2012). Fate of Yersinia enterocolitica during manufacture, ripening and storage of Lighvan cheese. International Journal of Food Microbiology, 156: 141–146.
• Hanifian, S., Khani, S., Barzegari, A. and Shayegh, J. (2013). Quantitative real-time PCR and culture examination of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis at farm level. Veterinary Microbiology, 162: 160–165.
• Harris, N.B. and Barletta, R.G. (2001). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in veterinary medicine. Clinical Microbiology Reviews, 14: 489–512.
• Karami, M., Ehsani, M.R., Mousavi, S.M., Rezaei, K. and Safari, M. (2009). Changes in the rheological properties of Iranian UF-Feta cheese during ripening. Food Chemistry, 112: 539–544.
• Klanicova, B., Slana, I., Roubal, P., Pavlik, I. and Kralik, P. (2012). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis survival during fermentation of soured milk products detected by culture and quantitative real time PCR methods. International Journal of Food Microbiology, 157: 150–155.
• Lund, B.M., Gould, G.W. and Rampling, A.M. (2002). Pasteurization of milk and the heat resistance of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: a critical review of the data. International Journal of Food Microbiology, 77: 135–145.
• Mohammadi, Kh., Karim, G., Hanifian, Sh., Tarinejad, A. and Gasemnezhad, R. (2011). Antimicrobial effect of Zataria multiflora Boiss. essential oil on Escherichia coli O157:H7 during manufacture and ripening of white brined cheese. Journal of Food Hygiene, 2: 69–79 [In Farsi].
• Okura, H., Toft, N. and Nielsen, S.S. (2012). Occurrence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk at dairy cattle farms: A systematic review and meta-analysis. Veterinary Microbiology, 157: 253–263.
• Østlie, H.M, Eliassen, L., Florvaag, A. and Skeie, S. (2004). Phenotypic and PCR-based characterization of the microflora in Norvegia cheese during ripening. International Journal of Food Microbiology, 94: 287–299.  
• Rajković, M.B., Sredović, I.D. and Miloradović, Z.N. (2010). Comparison of different methods for determination of sodium chloride in cheese. Journal of Agricultural Sciences, 55: 65–77.
• Rodrίguez-Lazaro, D., D’Agostino, M., Herrewegh, A., Pla, M., Cook, N. and Ikonomopoulos, J. (2005). Real-time PCR-based methods for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in water and milk. International Journal of Food Microbiology, 101: 93–104.
• Rowe, M.T., Grant, I.R., Dundee, L. and Ball H.J. (2000). Heat resistance of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk. Irish Journal of Agriculture and Food Research, 39: 203–208.
• Slana, I., Kralik, P., Kralova, A. and Pavlik, I. (2008). On-farm spread of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in raw milk studied by IS900 and F57 competitive real time quantitative PCR and culture examination. International Journal of Food Microbiology, 128: 250–257.
• Spahr, U. and Schafroth, K. (2001). Fate of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Swiss hard and semihard cheese manufactured from raw milk. Applied and Environmental Microbiology, 67: 4199–4205.
• Sung, N. and Collins, M.T. (2000). Effect of three factors in cheese production (pH, salt, and heat) on Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis viability. Applied and Environmental Microbiology, 66: 1334–1339.
• Whittington, R.J., Marsh, I., McAllister, S., Turner, M.J., Marshall, D.J. and Fraser, C.A. (1999). Evaluation of modified BACTEC 12B radiometric medium and solid media for culture of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from sheep. Journal of Clinical Microbiology, 37: 1077–1083.