مطالعه هیستوپاتولوژی تاثیر عصاره الکلی ریشه شلغم بر آسیب ایسکمی- باز خونرسانی کلیه در موش صحرایی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 4، دوره 6، 2 (22) تابستان، شهریور 1391، صفحه 1549-1559   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

داریوش مهاجری^{* 1}؛ غفور موسوی²؛ پدرام محمدی³

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم درمانگاهی، تبریز، ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش آموخته دامپزشکی، تبریز، ایران

چکیده

آسیب ایسکمی – باز خونرسانی کلیه یکی از مهمترین عوامل نارسایی حاد کلیه به شمار می­رود که در بسیاری از موارد بالینی با آن برخورد می­شود. این مطالعه به منظور ارزیابی اثرات پیش درمانی با عصاره الکلی ریشه گیاه شلغم بر هیستوپاتولوژی کلیه و شاخص­های سرمی آسیب آن در آسیب ناشی از ایسکمی – باز خونرسانی کلیه در موش صحرایی طراحی گردید. در مجموع 80 موش صحرایی نر نژاد ویستار به طور تصادفی در 4 گروه: شاهد جراحی، مدل ایسکمی – باز خونرسانی و 2 گروه ایسکمی – باز خونرسانی + تیمار با عصاره الکلی ریشه شلغم ( 1٪ و 2٪ ) با 20 سر موش صحرایی در هر گروه تقسیم گردید. موش­های گروه ایسکمی – باز خونرسانی به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد در معرض ایسکمی و به مدت 30 دقیقه در معرض باز خونرسانی قرار گرفتند. 24 ساعت پس از دوره باز خونرسانی موش­ها آسان کشی شدند. آزمون­های عملکرد کلیه و آسیب شناسی بافتی کلیه در مورد گروه­های مورد آزمایش انجام گردید. نتایج به­دست آمده با گروه شاهد جراحی مورد مقایسه قرار گرفت. افزایش کراتینین سرم، اوره خون و اسید اوریک در موش­های گروه ایسکمی – باز خونرسانی در مقایسه با گروه شاهد جراحی مشاهده شد. پیش تیماری عصاره الکلی شلغم به مدت 30 روز قبل از القاء ایسکمی – باز خونرسانی عملکرد کلیه را بهبود بخشیده و آسیب ناشی از آماس و استرس اکسیداتیو را کاهش داد. نتایج به­دست آمده از مطالعه حاضر نشان داد که عصاره الکلی ریشه شلغم به­طور معنی­داری از آسیب عملکردی و بافتی کلیه در اثر ایسکمی – باز خونرسانی جلوگیری کرد.

کلیدواژه‌ها

عصاره الکلی ریشه شلغم؛ ایسکمی – باز خونرسانی؛ کلیه؛ موش صحرایی

اصل مقاله

مقدمه

 

    مسیرهای پاتولوژیک مختلفی برای آسیب بافت­های بدن در روند ایسکمی-بازخونرسانی، معرفی شده است. در اکثر بافت­ها آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی، عمدتاً توسط رادیکال­های آزاد اتفاق می­افتد. با تولید
رادیکال­های آزاد بسیار فعال اکسیژن یعنی سوپر اکسید و رادیکال هیدروکسیل طی روند ایسکمی- بازخونرسانی، بافت­ها متحمل آسیب­های ساختاری و عملکردی متعددی می­گردند به طوری که آسیب­های پاتولوژیکِ شدیدتر در فاز بازخونرسانی اتفاق می­افتد (22). آسیب ایسکمی‌ زمانی اتفاق می‌افتد که جریان خون به یک بافت قطع شود، اما به صورت متناقض آسیب بافتی بیشتر موقعی روی می‌دهد که جریان خون دوباره در طی رپرفیوژن برقرار شود (18). کلیه یکی از ارگان­هایی است که از این سندروم بالینی (آسیب ایسکمی- رپرفیوژن) آسیب می‌بیند. مثلاً در پی کاهش جریان خون به کلیه به دلیل خونریزی، شوک، اعمال جراحی بزرگ و یا قطع کامل جریان خون به این ارگان در حین انتقال از دهنده به گیرنده در طی پیوند کلیه این وضعیت اتفاق می‌افتد. علت اصلی عملکرد تأخیری بافت پیوندی آسیب ایسکمی- رپرفیوژن (I/R) می‌باشد. هرچه قدر شدت آسیب اولیه ناشی از I/R بیشتر باشد، موارد رد پیوند یا اختلال عملکردی آن افزایش می‌یابد. بنابراین، کاهش در آسیب I/R اولیه منجر به نتیجه بهتر برای بقا آلوگرافت در کوتاه مدت و دراز مدت ‌می‌شود (16). پاسخ التهابی کوتاه مدت آغاز شده به دلیل I/R ، توسط القاء آبشار سیتوکاین‌های پیش التهابی، بیان ملکول­های اتصالی و ارتشاح سلولی مشخص می‌شود. IL-1 و - TNF به­عنوان سیتوکاین‌های پیش التهابی هستند که نقش مهمی را در آسیب I/R بعد از پیوند ارگان دارند (16).

بروز ایسکمی- بازخونرسانی در کلیه نیز با تولید رادیکال­های آزاد باعث پراکسیداسیون لیپیدی شده که منجر به نارسایی حاد کلیوی می­شود (13 و 24). استفاده از گیاهان دارویی جهت درمان طیف وسیعی از بیماری­ها، به سرعت در حال توسعه بوده و توجه ویژه­ای به اثرات محافظتی آنتی اکسیدان­های با منشاء طبیعی در برابر بیماری­ها شده است (12). گیاهان دارویی فراوانی با خواص آنتی‌اکسیدانی وجود دارند، که گمان می­رود در پیشگیری از آسیب ایسکمی- بازخونرسانی بافت­ها موثر باشند. از جمله گیاهانی که ترکیبات آن دارای خواص قوی آنتی‌اکسیدانی است گیاه شلغم می‌باشد (5).

شرایط پاتولوژیک نظیر سرطان­ها، پیری، بیماری­های قلبی-عروقی، ایسکمی و آماس در تولید و تجمع گونه­های فعال اکسیژن دخیل هستند (1 و 9). بنابراین، از بین بردن گونه­های رادیکال اکسیژن یک راهکار تدافعی موثری در برابر بیماری­های مختلف قلمداد می­شود. آنتی‌اکسیدان‌ها موادی هستند که در صورت وجود در غذا‌ها و بدن، حتی در مقادیر ناچیز، می‌توانند بدن را در مقابل انواع مختلف آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن محافظت کنند (28). گیاهان دارویی به علت سهولت دسترسی، کاهش عوارض جانبی و صرفه اقتصادی، به عنوان جایگزین‌های شایسته دارو‌های صناعی، همواره مورد توجه بوده و از چند دهه اخیر به‌طور خاص مورد توجه محققین قرار گرفته است. مواد بیولوژیک با منشأ گیاهی شاخه‌ای از فارماکوتراپی مدرن بیماری‌ها را تشکیل می‌دهند. اگر چه عوامل دارویی متنوعی برای درمان انواع بیماری‌ها وجود دارد، لکن اغلب بیماران قادر به تحمل اثرات جانبی داروهای شیمیایی نیستند و از سوی دیگر اکثر گیاهان اثرات جانبی بسیار اندکی در روی بیماران به جای می‌گذارند. با انجام این مطالعه خاصیت دارویی عصاره شلغم در محافظت از بافت کلیه در شرایط ایسکمی-بازخونرسانی برای اولین بار از طریق آسیب شناسی مورد ارزیابی قرار می‌گیرد که در صورت تایید می‌تواند به عنوان یک منبع قابل دسترس با خاصیت آنتی‌اکسیدانی  مورد استفاده قرار گیرد. بدیهی است قبل از آن­که دارویی جدید وارد عرصه طب شود، لازم است مطالعات متعددی در چندین مرحله روی دارو انجام شود. در اولین مرحله، دارو در محیط­های بی­جان (in vitro) و نیز روی حیوانات زنده (in vivo) بررسی می­شود که در این مرحله ویژگی­های کلی را روی مورد مطالعه (Pharmacological profile) مورد بررسی قرار می­دهند. بعد از این مرحله است که دارو روی انسان آزمایش می­شود.

با توجه به اینکه شلغم دارای اثرات آنتی­ اکسیدانی می­باشد انتظار می­رود که مصرف این گیاه بتواند از آسیب ایسکمی- بازخونرسانی جلوگیری نماید. با عنایت به اینکه اثر گیاه مذکور بر آسیب ایسکمی- بازخونرسانی با جنبه هیستوپاتولوژیک مورد مطالعه قرار نگرفته است، هدف از مطالعه حاضر، بررسی اثرات محافظتی عصاره الکلی شلغم بر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کلیه با جنبه آسیب‌شناسی در موش‌های صحرایی می‌باشد.

مواد و روش­ها

    مطالعه حاضر از نوع تجربی مداخله‌گر آزمایشگاهی می‌باشد. برای انجام این مطالعه، از تعداد 80 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با وزن تقریبی 20200 گرم و در محدوده سنی 9 هفته استفاده شد. شرایط تغذیه و نگه­داری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 221 درجه سانتی‌گراد بود. جیره غذایی یکسان و آب نیز به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفته و پس از یک هفته عادت به شرایط جدید، آزمایش شروع شد. موش‌ها به‌طور تصادفی به 4  گروه مساوی شامل:  1- گروه شاهد (Sam I/R) 2- گروه ایسکمی-بازخونرسانی (I/R) 3- گروه ایسکمی-بازخونرسانی+ تیمار با دز پایین عصاره (low dose extract+ I/R) 4- گروه ایسکمی-بازخونرسانی + تیمار با دز بالای عصاره (high dose extract + I/R) تقسیم شد.

ریشه شلغم مورد استفاده در این بررسی پس از تهیه، توسط دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز تأیید شد. ریشه­های تازه با آب تمیز به‌طور کامل شستشو شده و پس از برش، سه بار توسط اتانول عصاره­گیری شد. محلول عصاره صاف گردیده و توسط دستگاه روتاری اواپوراتور تحت خلأ کاملاًَ خشک شد. عصاره‌ خشک شده تا زمان استفاده در یخچال و تحت شراط انجماد نگه­داری شد. در این مطالعه، تیمار با عصاره ریشه گیاه شلغم به مدت 30 روز طول کشید. از زمان شروع، در گرو­های 1 (Sam I/R) و 2 (I/R) صرفاً از جیره پایه و در گروه­های 3 (سالم تیمار با low dose green tea+ I/R) و 4 (high dose green tea+ I/R) به ترتیب از جیره حاوی عصاره بر اساس میزان مصرف 1% و 2% ریشه خام در جیره پایه (به ترتیب 2 و 5 گرم ماده خام ریشه گیاه شلغم در 100گرم جیره پایه)، استفاده شد. شرایط نگه­داری در سایر موارد برای تمامی گروه­ها یکسان در نظر گرفته شد. پس از 30 روز، برای ایجاد ایسکمی و برقراری مجدد خونرسانی، همه گروه­ها توسط تزریق داخل صفاقی پنتوباربیتال سدیم (mg/kg 50) بیهوش گردیده و رهیافت تهیگاه به طور دو طرفی برش داده شد. در گروه شاهد (Sam I/R) فقط به دستکاری سرخرگ کلیوی اکتفا کرده (از گیره استفاده شد) و در سایر گروه­ها سرخرگ­های کلیوی به مدت 60 دقیقه به­وسیله گیره­­های نان­تروماتیک عروقی مسدود شد. پس از برداشتن گیره و رفع انسداد، حفره شکمی بخیه زده شده و حیوانات به
قفس­های خود باز گردانده شد.

پس از 24 ساعت بازخونرسانی، جهت اندازه‌گیری برخی فاکتور‌های بیوشیمیایی شامل اوره (11)، اسید اوریک (4) و کراتینین (29)، نمونه‌ خون نیز از سینوس پشت کره چشم (retro-orbital plexus) اخذ گردید. سرم نمونه‌های خون توسط سانتریفیوژ با سرعت 2500 دور در دقیقه و به مدت 15 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد جدا شد. هم‌زمان همه موش‌‌ها با ایجاد دررفتگی در مهره‌های گردن  (‍Cervical dislocation) به راحتی کشته شدند.  کلیه موش‌ها متعاقب پرفوزیون کلیوی از طریق سرخرگ کلیه توسط سرم فیزیولوژی سرد، سریعاً خارج و در فرمالین بافری 10 درصد پایدار شد. از نمونه‌های فوق با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و با روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین تهیه شد (20). مقاطع بافتی کلیه، تهیه شده از گروه­های مختلف آزمایشی به­شکل دو سو بی­خبر از لحاظ تغییرات پاتولوژیک از جمله: تورم حاد سلولی بافت پوششی توبول­ها، پرخونی و خونریزی، اتساع توبولی و نکروز سلول­های پوششی توبول­ها مورد مطالعه قرار گرفت و از لحاظ شدت آسیب بر اساس روش Bhalodia و همکاران در سال 2009 به صورت آسیب ملایم (+1)، آسیب متوسط (+2)، آسیب شدید (+3) رتبه بندی شد (3).

     

تحلیل آماری

داده‌های به‌دست آمده کمی، به صورت mean±S.E.M ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون ANOVA و آزمون تعقیبی Tukey در سطح معنی‌داری 05/0p<  توسط نرم‌افزار آماری SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

یافته­ها

   یافته­های آسیب­شناسی

     تغییرات هیستوپاتولوژی گروه­های مختلف آزمایشی شامل: شم، ایسکمی-بازخونرسانی، ایسکمی-بازخونرسانی+ عصاره الکی شلغم (1%) و ایسکمی-بازخونرسانی+ عصاره الکی شلغم (2%) در نگاره­های 1 تا 8 نشان داده شده و شدت تغییرات در جدول 1 ارائه گردیده است. در گروه شم، ساختار بافت کلیه طبیعی بوده و تغییر پاتولوژیک خاصی در آن مشاهده نگردید. در گروه ایسکمی-بازخونرسانی تغییرات دژنراتیو سلول­های توبولی، نکروز حاد توبول­ها، ادم، پرخونی و خونریزی شدید بینابینی مشاهده گردید. پرخونی و خونریزی شدید گلومرولی بسیار واضح بود. در گروه ایسکمی-بازخونرسانی+ عصاره الکی شلغم (1%)، پیش­تیماری توسط عصاره الکی شلغم به میزان 1% بهبود قابل توجهی در بروز تغییرات پاتولوژیک مشاهده گردید. تغییرات پاتولوژیک مشاهده شده در این گروه شامل ادم، پرخونی و خونریزی متوسط در گلومرول­ و بافت بینابینی کلیه و همچنین تغییرات ملایم دژنراتیو همراه با نکروز خفیف سلول­های اپیتلیال توبولی در مناطق قشری و مرکزی  کلیه بود. مقاطع تهیه شده از کلیه گروه ایسکمی-بازخونرسانی+ عصاره الکی شلغم (2%)، بهبود قابل توجهی را در بروز تغییرات پاتولوژیک نشان داد. تنها تغییر پاتولوژیک مشاهده شده در این گروه شامل واکوئولاسیون خفیف سلول­های توبولی و پرخونی جزئی بود.

 

 

 

جدول 1- آسیب کلیه در موش­های صحرایی

گروه­ها	تورم حاد سلولی	پرخونی و خونریزی	اتساع توبولی	نکروز سلول­های پوششی توبول­ها
شم	-	-	-	-
ایسکمی- بازخونرسانی	+++	+++	+++	+++
ایسکمی- بازخونرسانی + عصاره الکی شلغم (1%)	+++	++	++	++
ایسکمی- بازخونرسانی + عصاره الکی شلغم (2%)	++	+	+	+

علامت منفی نشان­دهنده عدم مشاهده تغییر پاتولوژیک و علامت مثبت نشان­دهنده تغییرات پاتولوژیک می­باشد.

 

 

نگاره 1- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه کنترل جراحی (شم). ساختار بافت کلیه در کورتکس و مدولا سالم بوده و تغییر پاتولوژیک خاصی در آن مشاهده نمی­شود (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 40×).

 

 

نگاره 2- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه کنترل جراحی (شم). ساختار بافت کلیه در منطقه قشر سالم بوده و تغییر پاتولوژیک قابل توجهی در آن مشاهده نمی­شود (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×).

 

 

 

نگاره 3- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه تحت ایسکمی/ بازخونرسانی. به پرخونی و خونریزی شدید در گلومرول­ و بافت بینابینی کلیه و همچنین تغییرات شدید دژنراتیو همراه با نکروز سلول­های اپیتلیال توبولی در منطقه قشری کلیه توجه نمائید (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×).

 

 

 

نگاره 4- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه تحت ایسکمی/ بازخونرسانی. پرخونی و خونریزی شدید در بافت بینابینی کلیه و همچنین تغییرات شدید دژنراتیو همراه با نکروز سلول­های اپیتلیال توبول­ها در قسمت مرکزی کلیه قابل توجه می­باشد (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×)

 

 

نگاره 5- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه تحت ایسکمی/ بازخونرسانی به­علاوه تیمار با دز پائین (1%) عصاره الکلی ریشه شلغم. به پرخونی و خونریزی متوسط در گلومرول­ و بافت بینابینی کلیه و همچنین تغییرات ملایم دژنراتیو همراه با نکروز خفیف سلول­های اپیتلیال توبولی در منطقه قشری کلیه توجه نمائید (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×).

 

نگاره 6- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه تحت ایسکمی/ بازخونرسانی به­علاوه تیمار با دز پائین (1%) عصاره الکلی ریشه شلغم. پرخونی و خونریزی ملایم تا متوسط در بافت بینابینی کلیه و همچنین تغییرات ملایم دژنراتیو همراه با نکروز خفیف سلول­های اپیتلیال توبول­ها در قسمت مرکزی کلیه قابل توجه می­باشد (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×).

 

 

نگاره 7- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه تحت ایسکمی/ بازخونرسانی به­علاوه تیمار با دز بالای (2%) عصاره الکلی ریشه شلغم. پرخونی ملایم در بافت بینابینی کلیه و همچنین تغییرات ملایم دژنراتیو همراه با نکروز جزئی سلول­های اپیتلیال توبولی در منطقه قشری کلیه قابل مشاهده می­باشد (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×).

 

نگاره 8- نمای ریزبینی از بافت کلیه موش صحرائی گروه تحت ایسکمی/ بازخونرسانی به­علاوه تیمار با دز بالای (2%) عصاره الکلی ریشه شلغم. تغییرات ملایم دژنراتیو همراه با نکروز خفیف سلول­های اپیتلیال توبول­ها در قسمت مرکزی کلیه قابل مشاهده می­باشد (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 250×).

 

یافته­های بیوشیمیایی

تغییرات بیوشیمیایی سرم و مقایسه آماری گروه­های مختلف آزمایشی شامل: شم، ایسکمی-بازخونرسانی، ایسکمی-بازخونرسانی+شلغم (1%) و ایسکمی-بازخونرسانی+شلغم (2%) در جدول 2 ارائه گردیده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2- تاثیر پیش درمانی شلغم بر پارامترهای سرمی کراتینین، اوره و اسیداوریک

گروه	سرم کراتینین (میلی­گرم بر دسی­لیتر)	ازت اوره خون (میلی­گرم بر دسی­لیتر)	اسید اوریک (میلی­گرم بر دسی­لیتر)
شاهد	09/0 ± 55/1	8/5 ±32/61	11/0 ± 79/0
ایسکمی-بازخونرسانی	a 21/0± 23/4	a 75/12± 95/142	a18/0± 82/1
ایسکمی- بازخونرسانی+ شلغم (1%)	b11/0± 62/2	b 32/7± 95/103	b 12/0± 30/1
ایسکمی- بازخونرسانی+ شلغم (2%)	c08/0± 80/1	c 3/4± 35/71	c 15/0± 88/0

 

a:001/0 p< در مقایسه با گروه شم، b: 05/0 p< و c: 01/0 p< در مقایسه با گروه ایسکمی-بازخونرسانی

 

بحث و نتیجه­گیری

    مصرف گیاهان جنس شلغم با سلامت انسان در ارتباط بوده و باعث کاهش خطر ابتلا به برخی از بیماری­های مزمن نظیر اختلالات قلبی­عروقی (5) و سرطان (30) می­گردد. در مطالعات انجام شده توسط Kim و همکارانش در سال 2006 اثرات محافظتی عصاره ریشه گیاه شلغم در برابر سمیت کلیوی سیسپلاتین به اثبات رسیده است (19). مطالعات انجام شده توسط Rafatullah و همکارانش در سال 2006 نشان داده است که تیمار با عصاره شلغم مانع از بروز آسیب سلول­های کبدی توسط تتراکلرید کربن (CCl4) می­شود. طبق نظر ایشان اثر محافظتی عصاره شلغم احتمالاً به دلیل خواص آنتی­اکسیدانی آن بوده است (25). در مطالعه­ای که توسط Choi و همکارانش در سال 2006 انجام شده، اثرات آنتی­اکسیدانی و هپاتوپروتکتیو عصاره اتانولی شلغم در هر دو شرایط in vivo و in vitro مورد مطالعه قرار گرفته است. در مطالعه ایشان تجویز خوراکی عصاره اتانولی شلغم به موش­های صحرایی که کبد آنها توسط d-Galactosamine آسیب دیده بود، منجر به بهبود وضعیت کبد گردیده است (7).  Jung و همکارانش با تحقیق در مورد موش­های دیابتیک نشان داده­اند که عصاره ریشه گیاه شلغم با افزایش متابولیسم گلوکز و چربی دارای اثرات ضد دیابتی در دیابت نوع 2 می­باشد (17). تحقیقات نشان داده است که ایزوتیوسیانات­ها(Isothiocyanates) و متابولیت­های ایندول گلوکوزینولات (indole glucosinolate metabolites) دو گروه عمده از مشتقات گلوکوزینولات­ها هستند که هر دوی آنها دارای اثرات ضد سرطانی در برابر طیف وسیعی از کانسرها چه در شراط درون­تنی (in vivo) و چه در شرایط برون تنی (in vitro) می­باشند (23 و 32).    

این اثرات اغلب به گیاشیمی این گیاه به­خصوص گلوکوزینولات­ها (glucosinolates) (23 و 26) و ترکیبات فنولیک (phenolic compounds) (10 و 15) آن، نسبت داده می­شود که تنوعی از اعمال فیزیولوژیک شامل فعالیت­های آنتی­اکسیدانی، تنظیم و کنترل آنزیم­ها و کنترل و مهار آپوپتوز و چرخه سلول را القاء می­کنند. ترکیبات فنولیک، گروه بزرگی از متابولیت­های ثانویه این سلسله گیاهی به­شمار می­روند. این ترکیبات بر اساس ساختار مولکولی خود و تعداد و موقعیت گروه­های هیدروکسیل و سایر گروه­های استخلافی به گروه­ها و تحت گروه­هایی طبقه­بندی می­گردند. گسترده­ترین و متنوع­ترین گروه از پلی­فنول­ها، فلاوونوئیدها می­باشند. فلاوونوئیدها (Flavonoids) و مشتقات هیدروکسی سینامیک اسید (hydroxycinnamic acid derivatives) به­وفور در این گیاهان وجود داشته و از ترکیبات فعال بیولوژیکی مهم رژیم غذایی انسان به­شمار می­روند (6، 21 و 31). این ترکیبات دارای اثرات مستقیم آنتی­اکسیدانی و فعالیت­های زدایندگی رادیکال آزاد هستند و همچنین می­توانند باعث بیان تنوعی از ژن­های دخیل در کدگذاری (encoding) آنزیم­های متابولیکی مؤثر در کاهش خطر ابتلا به گروهی از بیماری­ها و اختلالات، گردند  (2). 

یکی از مسائل بسیار مهم در ایسکمی-بازخونرسانی آسیب سلولی می‌باشد، برقراری مجدد جریان خون به شکل متناقضی باعث تشدید آسیب سلولی در بافت می‌گردد، بنابراین علاوه بر سلول­هایی که تا انتهای دوره ایسکمی دچار آسیب غیرقابل برگشت شده بودند، سلول‌های دیگری نیز در بافت از می‌روند (8). نتایج حاصل از مطالعه ما نشان می­دهد پیش درمانی با شلغم اثرات پیشگیرانه محافظتی و درمانی در برابر آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کلیوی دارد که این موضوع را با ازمایشات بیوشیمیایی و پاتولوژیکی ثابت کردیم.

در آزمایشات ما حیواناتی که دچار اسیب ایسکمی-بازخونرسانی شده بودند آسیب­های کلیوی را نشان دادند که شامل کاهش عملکرد کلیه به صورت افزایش سطح اوره، اسید اوریک و کراتینین سرم بود.

تغییرات حاصل از ایسکمی-بازخونرسانی آسیب­های گسترده هیستوپاتولوژیکی را مانند واکوئله شدن سلول­ها، ادم بینابینی، پرخونی، خونریزی، نکروز توبولی و تغییرات گلومرولی را نشان می­دهد.

با استفاده ازشلغم به عنوان پیش درمان در حیواناتی که دچار آسیب ایسکمی باز خونرسانی شدند تغییرات و آسیب­های بیوشیمیایی و هیستوپاتولوژیکی کاهش چشمگیری پیدا کرد. مقدار سرم کراتینین، ازت اوره خون و اسیداوریک نشان دهنده میزان فیلتراسیون گلومرولی هستند.

در این مطالعه میزان سرم کراتینین، ازت اوره خون و اسیداوریک در گروه ایسکمی-بازخونرسانی به طور معنی­داری بیشتر از گروه شاهد بودند. نتایج حاصل از آزمایشات ما نشان می­دهد که پیش درمانی با شلغم افزایش ازت اوره خون، سرم کراتینین و اسیداوریک را که حاصل اسیب ایسکمی-بازخونرسانی است را به طور چشمگیری کاهش می­دهد همچنین ما به این نتیجه رسیدیم که اثر پیش درمانی شلغم در جلوگیری از اختلال عملکردی حاصل از ایسکمی-بازخونرسانی وابسته به دوز مصرفی شلغم می­باشد.

نارسایی حاد کلیوی ایجاد شده توسط آسیب ایسکمی-بازخونرسانی با نشانه­های هیستوپاتولوژیکی که از بافت کلیه به­دست آمد آسیب گسترده توبول کلیوی، نکروز سلول­های توبولی،آسیب گلومرولی، انسداد توبول کلیوی با لاشه­های سلولی را برای ما نشان داد. بخش عمده­ای از این اختلالات توبولی و گلومرولی در طول دوره برقراری مجدد جریان خون به دنبال انفجار اکسیداتیو رخ می دهد و مقدار زیادی گونه‌های فعال اکسیژن تولید می‌شود که یکی از عوامل مهم آسیب رسانی در آسیب ایسکمی-باز خونرسانی می‌باشند. گونه­های فعال اکسیژن مسئول پراکسیداسیون لیپیدی غشاهای بیولوژیکی هستند که در نهایت منجر به مرگ سلولی می­شوند. حفاظت ایجاد شده توسط زدآینده­های رادیکال­های آزاد در مقابل گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده در طی آسیب ایسکمی-بازخونرسانی نشان می­دهد که گونه­های رادیکال آزاد در پاتوژنز سلول­های دچار ایسکمی بازخونرسانی دخیل می­باشند.

در مجموع مکانیسم اثر حافظتی شلغم در آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کلیوی را می­توان با فعالیت آنتی اکسیدانی آن توجیه کرد (5). سیستم رنین- آنژیوتانسین یک نقش محوری را در تنظیم فشار خون ایفا می‌کند. رنین در تبدیل آنژیوتانسین به آنژیوتنسین I و آنژیوتنسین I به آنژیوتنسین II با کمک آنزیم مبدل آنژیوتانسین نقش دارد. شواهد جمع­آوری شده نشان
می­دهد آنژیوتنسینII در تحریک تولید فرم­های داخل سلولی گونه­های فعال اکسیژن مانند آنیون سوپراکسید و هیدروژن پر اکسید که منجر به آسیب کلیوی می­شود نقش دارد (14). مدت زمان تشکیل فرم­های فعال اکسیژن یکی از عوامل مهم در ایجاد و کمک به به آسیب بازخونرسانی می­باشد.

استرس­های اکسیداتیو می­تواند منجر به افزایش تولید فرم­های فعال اکسیژن یا کاهش توانایی مهار فرم­های فعال اکسیژن گردد، بنابراین فرم­های فعال اکسیژن متصل شده به اسیدهای چرب غیر اشباع در غشای لیپیدی ممکن است در نتیجه پراکسیداسیون منجر به هم ریختگی ساختاری و عملکردی سلولی شود. پس از بازخونرسانی و باز اکسیژن رسانی عدم تعادل باز اکسیژن رسانی و عملکرد تنفسی در میتوکندری منجر به تولید نسل عظیمی آنیون سوپراکسید در میتوکندری می‌شود (27).

تحت این شرایط سیستم دفاعی آنتی اکسیدان و آنزیم­های آنتی اکسیدان راتشخیص می­دهد اما نمی­تواند از فرار گونه­های فعال اکسیژن جلوگیری کند به خصوص در میتوکندری  و همین­طور نمی­تواند از اثرات آنها در فضاهای داخل سلولی دیگر جلوگیری کند. بنابراین این آبشار حوادث به عنوان سیستم آسیب باز خونرسانی شناخته می­شود.

این نظرات و آزمایشات نشان می­دهد پیش درمانی با شلغم کلیه­هایی که دچار ایسکمی-بازخونرسانی شده بودند را در برابر پراکسیداسیون لیپیدی محافظت می­کند و کلیه­ها را از افزایش شدید فرم­های فعال اکسیژن و تخلیه سوپراکسید دسموتاز و کاتالاز وگلوتاتیون پراکسیداز محافظت کرده و میزان گلوتاتیون را در موش­هایی که  کلیه­هایشان در معرض ایسکمی-بازخونرسانی قرار دارد کاهش می­دهد.

به هرحال، نتایج این مطالعه نشان داد که پیش درمانی با عصاره الکلی شلغم به میزان قابل توجهی از آسیب ایسکمی-بازخونرسانی کلیوی در موش­های صحرایی کاهش داده و نقش محافظتی را انجام می­دهد. در این مطالعه ما مشاهده کردیم که عصاره الکلی شلغم می­تواند وضعیت شاخص­های عملکردی آسیب کلیه و نیز خصوصیات بافتی و ساختاری این اندام را در موش­های صحرایی که تحت آسیب ایسکمی-باز خونرسانی قرار گرفته­اند، بهبود بخشد. لکن، شناخت دقیق ماده یا مواد موثر اصلی این محصول گیاهی، تعیین دقیق مکان و مکانیسم یا مکانیسم‌های مؤثر در عملکرد فارماکولوژیکی آن در این مورد نیاز به مطالعات آتی دارد.

مراجع

1. Barber, DA. and Harris, SR.  (1994) Oxygen free radicals and antioxidants: a review. Am. Pharm. NS34, pp. 26–35.
2. Bennett, R.N., Rosa, E.A.S. Mellon, F.A. and Kroon, P.A. (2006) Ontogenic profiling of glucosinolates, flavonoids, and other secondary metabolites in Eruca sativa (salad rocket), Diplotaxis erucoides (wall rocket), Diplotaxis tenuifolia (wild rocket), and Bunias orientalis (Turkish rocket). J Agric Food Chem. 54(11):4005-4015.
3. Bhalodia, Y., Kanzariya, N., Patel, R., Patel, N., Vaghasiya, J., Jivani, N. and Raval, H. (2009) Renoprotective Activity of Benincasa Cerifera Fruit Extract on Ischemia/Reperfusion-Induced Renal Damage in Rat. IJKD.  3(2): 80-85.
4. Caraway, WT. (1955) Determination of uric acid in serum by carbonate method, Am. J. Clin. Pathol; 25: 840–845.
5. Cartea M.E. and Velasco, P. (2008) Glucosinolates in Brassica foods: bioavability in food and significance for human health.Phytochem. Rev. 7: 213-229.
6. Cermak, R., Landgraf, S. and Wolffram, S. (2003) The bioavailability of quercetin in pigs depends on the glycoside moiety and on dietary factors. J Nutr. 133(9):2802-2807.
7. Choi HJ, Han MJ, Baek NI, Kim DH, Jung HG, Kim NJ. (2006) Hepatoprotective effects of Brassica rapa (Turnip) on d-Galactosamine induced liver injured rats. Kor J Pharmacogn. 37(4):258-65.
8. Cotran, SR., Kumar, V. and  Robbins, LS. (1989) Robbins Pathologic Basis of Disease, W.B. Saunders Company, USA, 4th ed., pp:1-50.
9. Das, DK. and Maulik, N. (1994) Antioxidant effectiveness in ischemia–reperfusion tissue injury. Methods Enzymol. 233, pp. 601–610.
10. Duthie, G.G., Duthie, S.J. and Kyle, J.A.M. Plant polyphenols in cancer and heart disease: implications as nutritional antioxidants'. Nutrition Research Reviews, vol 13, no. 1, pp. 79-106.
11. Fawcett, JK. and Scott, JE. (1960) A rapid and precise method for the determination of urea, J. Clin. Pathol 1960; 13: 156–159.
12. Frei, B. and Higdon, J. (2003) Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo: evidence from animal studies, J Nutr 133:3275-3284.
13. Garcia-Criado, FJ., Eleno, N., Santos-Benito, F., Valdunciel, JJ., Reverte, M., Lozano-Sanchez, FS., Ludena, MP., Gomez-Alonso, A. and Lopez-Novoa, JM. (1998) Protective effect of exogenous nitric oxide on the renal function and inflammatory response in a model of ischemia–reperfusion. Transplantation 66, pp. 982–990.     
14. Gavras, HP, Salerno, CM. (1996) The angiotensin II type 1 receptor blocker losartan in clinical practice: a review. Clin Ther. 18:1058-67.
15. Hertog, M.G.L. (1996) Epidemiological evidence on potential health properties of flavonoids. Proc Nutr Soc. 55: 385-397.
16. Hidehisa, K. and et al. (2002) Attenuation of renal ischemical reperfusion junury by FR167653 in dogs. Surgery; 131: 654-62.
17. Jung UJ, Baek NI, Chung HG, Bang MH, Jeong TS, Lee KT, Kang YJ, Lee MK, Kim HJ, Yeo J and Choi MS.  (2008) Effects of the ethanol extract of the roots of Brassica rapa on glucose and lipid metabolism in C57BL/KsJ-db/db mice. Clinical Nutrition. 27(1):158-167.
18. Kapil, A. and Sharma, S (1995) Effect of oleanolic Acid on complement in Adjuvant and Carrageenan-induced Inflammation in Rats, J. Pharm. Pharmacol, 47, pp:585-587.
19. Kim YH, Kim YW, Oh YJ, Back NI, Chung SA, Chung HG, Jeong TS, Choi MS, Lee KT. (2006) Protective effect of the ethanol extract of the roots of Brassica rapa on cisplatin-induced nephrotoxicity in LLC-PK1 cells and rats. Biol Pharm Bull. 29(12):2436-41.
20. Lee, G. and Luna, HT. (1988) Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. Third Edition. The Blakiston Division Mc Graw. Hill Book Company, pp: 32- 107.
21. Llorach, R., Gil-Izquierdo, A., Ferreres, F. and Tomas-Barberan, F.A. (2003) HPLC-DAD-MS/MS ESI characterization of unusual highly glycosylated acylated flavonoids from cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) agroindustrial byproducts. J Agric Food Chem. 51(13):3895-3899.
22. McCord, JM. (1985) Mechanisms of disease: oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury. New Engl. J. Med. 312, pp. 159–163.
23. Mithen R, Faulkner K, Magrath R, Rose P, Williamson G, Marquez J. (2003) Development of isothiocyanate enriched broccoli, and its enhanced ability to induce phase 2 detoxification enzymes in mammalian cells. Theor. Appl. Genet. 106:727. 106:727–734.
24. Paller, MS., Hoidal, JR. and Ferris, TF. (1984) Oxygen free radicals in ischemia acute renal failure in the rat. J. Clin. Invest. 74, pp. 1156–1164.
25. Rafatullah S, Al-Yahya M, Mossa J, Galal A, El-Tahir K. Preliminary Phytochemical and Hepatoprotective Studies on Turnip Brassica rapa L. International Journal of Pharmacology. 2(6): 670-73.
26. Rosa, E.A.S., Heaney, R.K., Fenwick G.R. and Portas, C.A.M. (2006) Glucosinolates in crop plants. Horticult. Rev. 19: 99-215.
27. Sachse A, Wolf G. (2007) Angiotensin II-induced reactive oxygen species and the kidney. J Am Soc Nephrol.18:2439- 46.
28. Sanchez-Moreno, C., Larrauri, JA. and Saura-Calixto, F. (1999) Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines, grape juices and related polyphenolic constituents. Food Res. Int., 32: 407-412.
29. Teitz, NW.  (1987) Fundamentals of Clinical Chemistry. Philadelphia: NB Saunders Company. pp: 638.
30. Traka, M. and Mithen, R. (2008) Glucosinolates, isothiocyanates and human health. Phytochem. Rev. 8: 293.
31. Vallejo, F.A., Tomás-Barberán, F.A. and Ferreres, F. (2004) Characterisation of flavonols in broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) by liquid chromatography-UV diode-array detection-electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. 1054, 181–193.
32. Zhang Y, Kensler T W, Cho C G, Posner G H, and Talalay P. (1994) Anticarcinogenic activities of sulforaphane and structurally related synthetic norbornyl isothiocyanates. 91(8): 3147–3150.