مطالعه مقایسه‌ای اثر آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین جی، اکسی تتراسایکلین و انروفلوکساسین بر فعالیت نوتروفیل خون محیطی گوسفند (in vitro)

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 3، دوره 5، 2 (18) تابستان، شهریور 1390، صفحه 1169-1173   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

چکیده

    به منظور تعیین اثر برخی آنتی­بیوتیک­های رایج در درمان عفونت­های میکروبی گوسفند بر فعالیت نوتروفیل­ها، آزمایش حاضر به صورت in vitro طراحی و اجرا شد. در این مطالعه نوتروفیل خالص گوسفند از نمونه خون محیطی جداسازی و با آنتی­بیوتیک­های اکسی­تتراسایکلین و انروفلوکساسین (غلظت­های صفر، 1 ، 10 ، 100 و 200 میکروگرم در میلی­لیتر) و پنی­سیلین G (صفر، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 واحد در میلی­لیتر) به مدت یک­ساعت در دمای آزمایشگاه انکوبه شد. سپس در هر نمونه آزمایش فاگوسیتوز مخمر و آزمایش احیای نیتروبلوتترازولیوم (NBT) انجام شد. از رویه آماری (REML) Mixed model برای تحلیل داده­ها استفاده شد. مقایسه میانگین­ها با روش LSMEAN و سطح معنی­داری 01/0>p در نظر گرفته شد. بر اساس نتایج به­دست آمده، میانگین درصد فاگوسیتوز و درصد NBT غلظت­های مختلف پنی­سیلین G فاقد اختلاف آماری معنی­دار بود. میانگین درصد فاگوسیتوز و NBT در حضور داروی انروفلوکساسین به ترتیب تا غلظت 10 و 200 میکروگرم فاقد اثر معنی­دارنسبت به گروه شاهد ولی درصد فاگوسیتوز از غلظت 100 میکروگرم و بالاتر همچنین NBT در 400 میکروگرم به­طور معنی­داری کاهش یافت (01/0>p). میانگین درصد فاگوسیتوز در حضور
اکسی­تتراسایکلین در غلظت mcg/ml 100 و بالاتر به­طور معنی­دار به شدت کاهش یافت (0001/0>p) ولی در آزمایش NBT اکسی­تتراسایکلین به جز غلظت mcg/ml 1-0، در سایر غلظت­ها میزان احیای نیتروبلوتترازولیوم به­طور ­معنی­دار به شدت کاهش یافته بود (0001/0>p).بنابراین در مطالعه حاضر از لحاظ فقدان آثار منفی آنتی­بیوتیک­های مورد مطالعه بر عملکرد نوتروفیل­ها، در مجموع می­توان گفت: پنی­سیلین G کمترین اثر مهاری را بر فعالیت نوتروفیل­های خون محیطی گوسفند دارد. در حالی که، اکسی­تتراسایکلین فقط در سطح mcg/ml 1> (که شاید از لحاظ بالینی در این غلظت حتی فاقد اثر درمانی باشد) فاقد اثر مهاری بر فعالیت نوتروفیل­ها بود و لذا استفاده از این دارو، نباید در اولویت­ قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

احیای نیتروبلوتترازولیوم؛ اکسی تتراسایکلین؛ انروفلوکساسین؛ فاگوسیتوز؛ فعالیت نوتروفیل؛ پنی سیلین جی

اصل مقاله

مقدمه

 

     امروزه آنتی­بیوتیک­ها کاربرد وسیعی در درمان عفونت­های میکروبی مختلف دارند ولی نباید از نقش سیستم ایمنی ذاتی نیز در مقابله با عفونت­ها غافل شد. برخی مطالعات انجام شده در انسان و گاو حاکی از وجود آثار سوء آنتی­بیوتیک­ها بر فعالیت نوتروفیل­هاست (2، 9 و 10). نوتروفیل­ها اولین خط دفاعی سلولی در سیستم ایمنی ذاتی می­باشند (5). بنابراین آثار سوء آنتی­بیوتیک­ها بر فعالیت و عملکرد نوتروفیل­ها نباید نادیده گرفته شود. بدیهی است آنتی­بیوتیکی که واجد بهترین اثر ضدمیکروبی و همزمان دارای کمترین اثر سوء جانبی بر فعالیت نوتروفیل­ها و
سلول­های دیگر موجود زنده باشد، می­تواند به عنوان
آنتی­بیوتیک انتخابی، پیشنهاد شود. به عبارت دیگر به منظور اخذ راهبرد درمانی مناسب نه تنها به اثر ضدمیکروبی
آنتی­بیوتیک­ها بایستی توجه کرد، بلکه با دیدی جامع همه آثار مثبت و منفی آنتی­بیوتیک مورد استفاده را مد نظر قرار داد و بر اساس تحلیل فایده و زیان، اقدام به پیشنهاد استفاده یا عدم استفاده از یک آنتی­بیوتیک خاص نمود.

اگرچه حیوانات دارای توان فوق­العاده­ای در برخورد مؤثر با هجوم باکتری­ها هستند و در بیشتر موارد عفونت­ها فاقد علایم بالینی است ولی گاه عفونت به حدی شدید است که نیاز به درمان آنتی­بیوتیکی دارد. پنی­سیلین­ها، تتراسایکلین­ها و فلوروکینولون­ها از متداول­ترین داروهای ضدمیکروبی در دامپزشکی هستند. مطالعات حاکی از وجود عوارض گسترده سمی این داروها در بدن میزبان است و مطالعات فراوانی در این خصوص انجام گرفته است (1). ولی اثر آنها بر فعالیت نوتروفیل­های خون محیطی مشخص نیست. در مطالعه حاضر به­صورت in vitro اثر سطوح مختلف
آنتی­بیوتیک­های اکسی­تتراسایکلین، انروفلوکساسین و پنی­سیلین G بر دو فعالیت اصلی نوتروفیل خون محیطی گوسفند (آزمایش فاگوسیتوز مخمر و آزمایش انفجار تنفس سلولی یا احیای نیتروبلوتترازولیوم) به عنوان شاخص­های اصلی فعالیت نوتروفیل­های خون محیطی مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روش­ها

     الف. جداسازی نوتروفیل: جداسازی نوتروفیل­های خون محیطی گوسفند با استفاده از روش (2009) Rezapour & Majidi انجام گرفت (13). به طور خلاصه، ابتدا نمونه خون هپارینه با مقدار هم حجمی از سرم رینگر مخلوط و سپس به آرامی روی محلول گرادیان مگلومین 25% لود شد و به­مدت 15 دقیقه در ´g 1000 سانتریفوژ گردید. رسوب حاصله که  به­صورت پلت سلولی بود، لیز هیپوتونیک شده و شستشوی نهایی
سلول­ها (5 دقیقه در ´g300) انجام شد. مایع رویی دور ریخته شده، سپس با افزودن سرم دکستروز 5% تعلیق سلولی همگن ­گردید (دکستروز به میزانی اضافه می­شود که 107 - 106 سلول نوتروفیل در هر 100 میکرولیتر موجود باشد).

ب. انکوباسیون: یک­صد میکرولیتر تعلیق سلولی در دمای آزمایشگاه درون لوله­های آزمایش به مدت 60 دقیقه با داروهای اشاره شده در ذیل انکوبه شد (با ضافه کردن سرم رینگر حجم نهایی هر لوله به 1 میلی­لیتر رسید):

تیمار شاهد حاوی فقط 100 میکرولیتر PBS

انکوباسیون با غلظت­های صفر، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 واحد در میلی­لیتر پنی­سیلین G

انکوباسیون با غلظت­های صفر، 1، 10، 100 و 200 (mcg/ml) اکسی­تتراسایکلین

انکوباسیون با غلظت­های صفر، 1، 10، 100، 200 و 400 (mcg/ml) انروفلوکساسین

ج. آزمایش فاگوسیتوز: بدین­منظور از نمونه هپارینه ­هر تیمار آزمایش­ و مخمر کاندیدا آلبیکنس (Candida albicans) طبق روش Brousseau و همکاران (1999) وGooi and Chapel  در سال 1990 با اندک تغییرات استفاده ­شد (3 و 8). چرا که روش ذکر شده در این منابع اساساً برای خون تام طراحی شده است ولی در آزمایش حاضر، از نوتروفیل خالص استفاده شده است. روش کار به طور خلاصه، کشت 24 ساعته مخمر کاندیدا آلبیکنس در محیط آبگوشت مالتوز، به­مدت 5 دقیقه در ´g1000 شستشو شده، سپس به منظور اپسونیزاسیون، مخمر 20 دقیقه با پلاسما در دمای اتاق انکوبه می­شود. مقدار هم حجمی از سوسپانسیون مخمری انکوبه شده با پلاسما با تعلیق سلولی تیمارهای مختلف آزمایش بمدت نیم ساعت انکوبه شده و سپس چند گسترش شعله شمعی تهیه و پس از رنگ­آمیزی گیمسا، درصد نوتروفیل­هایی که فاگوسیتوز مخمر انجام داده­اند، مشخص می­شود.

د. آزمایش احیاء نیتروبلوتترازولیوم (NBT): روش کار بر اساس منابع (4 و 8) به­صورت خلاصه عبارت است از: ابتدا l 100 از سوسپانسیون سلولی انکوبه شده با ترکیبات مختلف (انواع آنتی­بیوتیک در سطوح مختلف) با  l 100 محلول NBT (محلول بافر فسفات + NBT + فوربول12- میریستات 13- استات (PMA)  که هر کدام به نسبت یکسان مخلوط شده­اند) و محلول شاهد (محلولNBT فاقد PMA) به­مدت 30 دقیقه در  oC37 انکوبه شد. پس از سانتریفوژ (5 دقیقه در ´g300)، از رسوب حاصل گسترش سلولی تهیه و به روش گیمسا
رنگ­آمیزی شد. سپس  شمارش نوتروفیل­هایی که احیا‌ء NBT در آنها صورت گرفته است با مشاهده دانه­های سیاه در نوتروفیل­ها انجام و به­صورت درصد گزارش شد.

ه. آنالیز آماری داده­ها: پس از آزمون نرمالیته و یکنواختی واریانس داده­ها، از نرم­افزار (2002)  SAS و رویه (REML) Mixed Model  استفاده شد. در مدل مورد استفاده علاوه بر میانگین و خطا که به ترتیب عوامل ثابت و تصادفی بودند، غلظت­ آنتی­بیوتیک­ها به عنوان اثر ثابت و روزهای مختلف انجام آزمایش به عنوان اثر تصادفی در نظر گرفته شد. برای مقایسه سطوح تیمار از میانگین حداقل مربعات (دستور pdiff) در سطح احتمال 1% استفاده شد. برای هر یک از غلظت­های آنتی­بیوتیک در هر یک از آزمایش­های فاگوسیتوز و NBT تعداد 8 تکرار در نظر گرفته شد.

یافته­ها

     نتایج آزمایش­های فاگوسیتوز و احیای نیتروبلوتترازولیوم (NBT) در غلظت­های مختلف هر آنتی­بیوتیک و مقایسه میانگین­ها در جداول 1 تا 3 ذکر شده است.

 

 

جدول 1- مقدار LSMEAN آزمایش­های فاگوسیتوز (1183/5=خطا)

و NBT (1981/4=خطا) در غلظت­های مختلف پنی­سیلین G (01/0>p).

غلظت / آزمایش	فاگوسیتوز %	% NBT
صفر	a833/80	a375/86
250 IU/ml	a167/87	a250/86
500 IU/ml	a917/83	a750/86
1000 IU/ml	a000/81	a500/85
2000 IU/ml	a417/77	a000/85
4000 IU/ml	a833/80	a800/82

اعداد همنام بیانگر فقدان تفاوت آماری معنی­دار است (01/0<p).

 

جدول 2- مقدار LSMEAN آزمایش­های فاگوسیتوز (7975/5=خطا)

و NBT (4877/3=خطا) در غلظت­های مختلف انروفلوکساسین (p<0.01)

غلظت / آزمایش	فاگوسیتوز %	% NBT
صفر	a00/83	a500/83
1 mcg/ml	a50/80	a375/80
10 mcg/ml	a50/79	a250/81
100 mcg/ml	b00/67	a750/80
200 mcg/ml	bc50/57	ab125/78
400 mcg/ml	c00/51	b875/75

اعداد غیرهمنام بیانگر تفاوت آماری معنی­دار است (01/0>p).

 

جدول 3- مقدار LSMEAN آزمایشهای فاگوسیتوز (560/4=خطا)

و NBT (0698/3=خطا) در غلظت­های مختلف اکسی­تتراسایکلین (01/0>p).

غلظت / آزمایش	فاگوسیتوز %	% NBT
صفر	a80/72	a750/86
1 mcg/ml	a80/72	a375/82
10 mcg/ml	a20/79	b063/79
100 mcg/ml	b50/2	b438/77
200 mcg/ml	b15-10×76/1	b250/74

اعداد غیرهمنام بیانگر تفاوت آماری معنی­دار است (01/0>p).

بحث و نتیجه­گیری

    در جدول 1، میانگین درصد فاگوسیتوز و درصد احیاء نیتروبلوتترازولیوم اختلاف آماری معنی­دار در حد 1% بین غلظت­های مختلف پنی­سیلین G وجود نداشت. در حالی که حتی غلظت­های بالا (IU/ml 4000) نیز بررسی گردید ولی همچنان تفاوت آماری غیرمعنی­دار بود. بررسی­های به عمل آمده در مورد داروی هم­خانواده پنی­سیلین نظیر آمپی­سیلین، نشان می­دهد که نسبت آمپی­سیلین کپسوله شده در نوتروفیل­ها به آمپی­سیلین آزاد، 4/5 – 4/1 برابر به یک است و این موضوع ثابت کننده اهمیت این دارو در درمان عفونت­های میکروبی درون سلولی است (16). مطالعات Hoeben و همکاران (1998) نیز در مورد اثر آمپی­سیلین بر کمیلومینسانس نوتروفیل­ها نشان داد که فقط حداکثر دوز مورد مطالعه (M 3-10×2) توانست موجب کاهش کمیلومینسانس نوتروفیل­ها گردد و در سایر غلظت­ها اثر معنی­داری حتی در حد 05/0>pیافت نشد (10).

میانگین درصد فاگوسیتوز و درصد احیاء نیتروبلوتترازولیوم در حضور داروی انروفلوکساسین به ترتیب تا غلظت 10 و 200 میکروگرم اثر معنی­داری (01/0<p) بر فعالیت نوتروفیل­ها نسبت به گروه شاهد ندارد (جدول 2). اگرچه درصد فاگوسیتوز از غلظت 100 میکروگرم و بالاتر، همچنین درصد احیاء نیتروبلوتترازولیوم در 400 میکروگرم بطور معنی­داری کاهش یافته است (01/0>p) ولی از دیدگاه کاربردی نمی­تواند فاکتور منفی برای استفاده از این آنتی­بیوتیک تلقی گردد. چرا که به صورت in vivo هیچگاه دارو در چنین غلظتی استفاده
نمی­شود و مشاهده این کاهش فقط در مطالعات in vitro امکان­پذیر است. این نتایج مطابق با یافته­های Schoevers و همکاران (1999) (15) ولی در رد نتایج Paape و همکاران (1991) است (12). براساس مطالعه Paape و همکاران (1991)، انروفلوکساسین اثری بر فعالیت فاگوسیتوزی گرانولوسیت­های گاو ندارد ولی نتایج این مطالعه که به­صورت in vitro و در طیف وسیعی از غلظت­های 1 تا 400 میکروگرم و در گوسفند انجام شد، خلاف نظر ایشان می­باشد (البته تفاوت گونه­ دام مورد مطالعه نیز نباید نادیده گرفته شود). بر اساس یافته­های  Mukherjee (2006) انروفلوکساسین اگرچه نفوذپذیری سلول نوتروفیل و آزاد سازی آنزیم­های مرتبط با انفجار تنفسی را افزایش می­دهد ولی بر تولید آنیون سوپراکسید تأثیری ندارد. در مطالعه حاضر، فقط در غلظت اغراق آمیز (از دید بالینی) کاهش معنی­دار در احیاء نیتروبلوتترازولیوم ملاحظه شد (11). با توجه به یافته­های حاضر و خاصیت تغلیظ انروفلوکساسین در نوتروفیل (15) که موجب تقویت اثر میکروب کشی نوتروفیل­ها خواهد شد، استفاده از این آنتی­بیوتیک در درمان عفونت­ها پیشنهاد می­شود.

میانگین درصد فاگوسیتوز در حضور اکسی­تتراسایکلین در غلظت mcg/ml 100 و بالاتر به­طور خیلی معنی­دار کاهش یافت (0001/0>p). از سویی درصد احیاء نیتروبلوتترازولیوم نیز به جز غلظت صفر و یک میکروگرم در میلی­لیتر، در سایر غلظت­ها به­طور خیلی­معنی­دار کاهش یافت (0001/0>p). تحقیقات Glette و همکاران (1984) نشان داد در غلظت کمتر از mcg/ml 100 تتراسایکلین اثری بر مهاجرت تصادفی نوتروفیل­ها، کمیلومینسانس و اکسیداسیون گلوکز ندارد. در این مطالعه، اثر مهاری تتراسایکلین به شلاته­شدن کاتیون­های دو ظرفیتی توسط تتراسایکلین و در نتیجه کاهش فعالیت سلولی نسبت داده شده ­است (7).

بنابراین بر اساس یافته­های این مطالعه، از لحاظ دارا بودن کمترین میزان اثر مهاری در آنتی­بیوتیک­های مورد مطالعه بر فعالیت یا عملکرد نوتروفیل خون محیطی گوسفند، در مجموع می­توان اولویت نخست استفاده را به پنی­سیلین G داد. انروفلوکساسین نیز در غلظت کمتر از mcg/ml 100 فاقد اثر منفی بر عملکرد نوتروفیل­هاست. در حالی­که اکسی­تتراسایکلین تنها در غلظت کم (که شاید در این سطح حتی فاقد اثر درمانی نیز باشد) اثر معنی­دار بر فعالیت نوتروفیل­ها ندارد و لذا پیشنهاد می­شود استفاده از این دارو در اولویت درمان قرار نگیرد.

مراجع

1. Adams, H.R. 2001. Veterinary pharmacology and therapeutics. 8th edition. Iowa state university press/Ames. pp 765-766.
2. Braga, P.C., Dal Sasso, M., Bovio, C., Zavaroni, E. and Fonti, E. 2002. Effects of gatifloxacin on phagocytosis, intracellular killing and oxidant radical production by human polymorphonuclear neutrophils. International Journal of Antimicrobial Agents. 19:183-187.
3. Brousseau, P., Payette, Y. and Tryphonas, H. 1999. Manual of Immunological Methods. 1st edition. CRC Press. pp:20-45.
4. Chanarian, I. 1989. Laboratory haematology (an account of laboratory techniques). 1st edition. Churchill Livingstone. pp: 177-178.
5. Farinacci, M., Colitti, M., Sgorlon, S. and Stefanon, B. 2008. Immunomodulatory activity of plant residues on ovine neutrophils. Immunology and Immunopathology. 126:54-63.
6. Glette, J., Sandberg, S., Hopen, G. and Solberg, C. 1984. Influence of Tetracyclines on Human Polymorphonuclear Leukocyte Function. Antimicrobial agents and chemotherapy. pp 354-357.
7. Glette J., Sandberg S., Hopen G. and Solberg C. 1984. Influence of tetracyclines on human polymorphonuclear leukocyte function. Antimicrobial agents and chemotherapy, pp 354-357.
8. Gooi H.G. and Chapel H. 1990. Clinical immunology (a practical approach). 1st edition. OxfordUniversity Press, pp 51-80.
9. Gorrini, M., Lupi, A., Viglio, S., Pamparana, F., Cetta, G., Iadarola, P., Powers, J.C.  and Luisetti, M. 2001. Inhibition of human neutrophil elastase by erythromycin and flurythromycin, two macrolide antibiotics. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25:492-499.
10. Hoeben, D., Burvenich, C. and Heyneman, R. 1998. Antibiotics commonly used to treat mastitis and respiratory burst of bovine polymorphonuclear leukocytes. J Dairy Sci. 81:403-410.
11. Mukherjee, R. 2006. Assessment of reactive oxygen species and phagocytosis of milk leukocytes by alfa-tocopherol and enrofloxacin in bovine mastitis. Veterinarski arhiv. 76:1-9.
12. Paape, M.J., Miller, R.H. and Zive J. 1991. Pharmacological enhancement or separation of phagocytosis by bovine neutrophils. Am. J. Vet. Res. 52:363-366.
13. Rezapour, A. and Majidi, J. 2009. An improved method of neutrophil isolation in peripheral blood of sheep. Journal of Animal and Veterinary Advances. 8(1):11-15.
14. SAS Institute 2002. SAS® User’s Guide: Statistics. Version 9 Edition. SAS Institute Inc., Cary, NC.
15. Schoevers, E.J., Van Leengoed, L.A.M., Verheijden, J.H.M. and Niewold T.A. 1999. Effects of enrofloxacin on porcine phagocytic function. Antimicrobial agents and chemotherapy. pp 2138-2143.
16. Yazar, E., Bas, A.L., Brande, Y.O., Yapar, K., Elmas, L. and Tras B. 2006. Determination of intracellular (neutrophil and monocyte) concentrations of free and liposome encapsulated ampicillin in sheep. Veterinarni Medicina. 51(2): 51-54.