مطالعه شمارش افتراقی لکوسیت‌ها در سگ‌های ژرمن شیپرد مبتلا به دیابت تجربی القاء شده با آلوکسان

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 9، دوره 5، 2 (18) تابستان، شهریور 1390، صفحه 1117-1220   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

محمدرضا ولیلو^{* 1}؛ علیرضا لطفی²

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، گروه دامپزشکی، شبستر، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، باشگاه پژوهشگران جوان، شبستر، ایران

چکیده

عارضه دیابت اغلب عملکردهای فیزیولوژیکی شامل خون‌سازی و سیستم ایمنی بدن را درگیر می­کند. در این پژوهش ده قلاده سگ ژرمن شیپرد نر و هم سن انتخاب شده، 5 قلاده به عنوان گروه شاهد و 5 قلاده به عنوان گروه آزمایشی (قبل و بعد از القاء دیابت) تفکیک شد. آزمایش با رعایت اصول حقوق حیوانات انجام گرفت و قبل از شروع آزمایش از سلامت حیوانات و غیردیابتی بودن آنها (با استفاده از تست تحمل گلوکز) اطمینان حاصل شد. آلوکسان مونوهیدرات در غلظت 100 میلی­گرم بر کیلوگرم به صورت درون وریدی تزریق شد. نمونه خون کامل قبل و بعد از القاء دیابت و قبل از اتلاف حیوان اخذ شده و از نظر تعداد لکوسیت­ها (نوتروفیل، لمفوسیت، مونوسیت، ائوزینوفیل و بازوفیل) شمارش شد. طبق یافته­ها، تعداد ائوزینوفیل­ها و بازوفیل­ها در بین گروه­ها اختلاف معنی­داری نداشت. اما تعداد نوتروفیل، لمفوسیت و مونوسیت تفاوت معنی­داری بعد از القاء دیابت داشت به طوری که تعداد نوتروفیل­ها در سگ­های دیابتی 3/82% ( در مقایسه با 38/72% در گروه شاهد و 53/69% در زمان قبل از القای دیابت) بود. لمفوسیت­ها و مونوسیت­ها در گروه دیابتی کمتر از گروه شاهد و زمان پیش-دیابت بود (لمفوسیت: 79/22، 24/26 و 59/14% و مونوسیت: 05/2، 58/2 و 81/1%  به ترتیب برای گروه­های شاهد، پیش- و پس-دیابتی). به نظر می­رسد عامل کاهش تعداد لمفوسیت­ها، اختلال در تکثیر و فعالیت آنها در گروه دیابتی بوده باشد. نتیجه می­گیریم که القاء دیابت در سگ­های ژرمن شیپرد می­تواند سبب کاهش تعداد مونوسیت­ها و لنفوسیت­ها و افزایش تعداد نوتروفیل­ها شود. احتمالاً اختلال در متابولیسم گلوکز و گلوتامین و نیاز بالای نوتروفیل­ها به این منابع موجب تغییر و افزایش تعداد نوتروفیل­ها در شرایط دیابتی شده باشد. به نظر می­رسد مطالعات بیشتر در رابطه با دلایل احتمالی تغییر تعداد لکوسیت­ها در سگ­های دیابتی ضروری باشد. 

کلیدواژه‌ها

دیابت؛ هماتوپویز؛ لکوسیت؛ سگ های ژرمن شیپرد

اصل مقاله

مقدمه

 

    عارضه دیابت یکی از بیماری­های سیستم درون ریز بدن است که صرف­نظر از صدمات متابولیکی، سیستم قلبی- عروقی و گردش خون را نیز درگیر می­کند. در حدود 3/6% جمعیت دنیا مبتلا به دیابت یا اصطلاحاً دیابتی هستند. از علائم وقوع دیابت می­توان پلی اوری، افزایش اشتها، کاهش وزن، مشکلات قلبی- عروقی، نارسایی کلیه، شوک، کتوز، افزایش قند خون و فشار خون و ... را نام برد (8).

بنکداران و همکاران (1) آنمی را یکی از مشکلات عمده افراد دیابتی برشمرده­اند. مطالعات منتشر شده نشانگر وجود ارتباط مثبت بین دیابت تیپ 1 و 2 و سطح پایین اریتروپویتین سرم است (3 و 16). مطالعات پیشنهاد می­کنند علاوه بر اینکه در شرایط نفروپاتی دیابتیک آنمی بروز می­کند، در برخی از موارد دیابتی بدون نفروپاتی نیز وقوع آنمی گزارش شده است (4).  در همین راستا پژوهشگران ایرانی (1) طی بررسی اپیدمیولوژیک بر روی بیماران دیابتی پیشنهاد کردند که عارضه آنمی در بیماران دیابتی تیپ 2 بدون بروز عوارض کلیوی
می­تواند رخ دهد، شدت آنمی با شدت دیابت مرتبط بوده و در موارد نفروپاتی دیابتی، عارضه آنمی نیز با شدت بالایی بروز می­کند.

آلوکسان ماده­ای است که در مطالعات برای القاء دیابت در مدل­های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می­گیرد. آلوکسان یک عامل اکسیدکننده قوی بوده و اسید دیالوریک متابولیت حاصل از واکنش کاهشی است. آلوکسان و اسید دیالوریک ترکیبی به نام "آلوکسانتین" را تشکیل می­دهند که یک ترکیب دیابتوژنیک قوی می­باشد (9).

صدمات پاتولوژیک دیابت تجربی القاء شده با آلوکسان در مدل سگ در کلیه­ها (13 و 15)، بیضه­ها (11)، شریان­ها (12)، کبد (15) گزارش شده است. در مطالعه اخیر (10)، مشاهده نمودیم که دیابت القاء شده با آلوکسان تأثیر معنی­داری بر فعالیت اریتروپویز (تعداد گویچه­های قرمز، نرخ هماتوکریت، غلظت هموگلوبین و ..) سگ های ژرمن شیپرد دیابتی نداشت. با توجه به یافته­های اخیر (10) و پیشنهاد بنکداران و همکاران (1) هدف از این مطالعه بررسی اثرات دیابت تجربی القاء شده با آلوکسان بر تعداد گلبول­های سفید خون در سگ­های ژرمن شیپرد (به عنوان مدل آزمایشگاهی دیابتی) است.

 

مواد و روش­ها

     در این مطالعه 10 قلاده سگ نر نژاد ژرمن شیپرد شیپرد در سنین 2-5/1 سال انتخاب مورد آزمایش قرار گرفتند. پیش از شروع آزمایش حیوانات معاینه شدند و از نظر سلامتی و عدم وجود عارضه متابولیکی و بیماری خاص اطمینان حاصل شد. سگ­ها به اتاق حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی واحد شبستر منتقل و شماره­گذاری شدند. حیوانات تحت درمان انگلی (تزریق لوامیسول) و تزریق واکسن هاری قرار گرفتند. حیوانات در داخل باکس­ها (با رعایت حقوق حیوانات) و با دسترسی آزاد به آب و سه وعده غذایی قرار داده شدند. گروه­های آزمایشی شامل گروه شاهد (بدون القاء دیابت) و گروه آزمایشی (پیش از القاء و پس از القاء دیابت) و هر یک شامل 5 قلاده بودند. برای عادت پذیری حیوانات به شرایط محیطی و جلوگیری از بروز تنش، القاء دیابت بعد از یک هفته انجام گرفت. بعد از زمان آدابتاسیون، برای اطمینان از عدم وجود دیابت، تست وریدی تحمل گلوکز (IVGTT) صورت گرفت. بعد از 5 روز، به حیوانات گروه دوم، آلوکسان (ساخت سیگما-آلدریچ، ایالات متحده) در غلظت 100 میلی­گرم در کیلوگرم وزن بدن به صورت داخل وریدی تزریق شد. یک هفته بعد، دومین IVGTT انجام گرفت و بروز عارضه دیابت تایید شد. در طول مطالعه، معاینات بالینی (شامل اخذ دمای رکتال، ضربان قلب، نرخ تنفس و ...) برای حیوانات هر دو گروه انجام
می­گرفت.

نمونه کامل خون از سگ­های گروه شاهد و گروه دیابتی (قبل و بعد از القاء دیابت) اخذ شده و در لوله­های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) برای شمارش تفریقی لکوسیت­ها (شامل نوتروفیل، لمفوسیت، مونوسیت، ائوزینوفیل و بازوفیل­ها) با تهیه گسترش و رنگ­آمیزی به آزمایشگاه منتقل شد. اخذ نمونه خون از گروه دیابتی در زمان بروز دیابت حاد انجام گرفت. در این مطالعه هیچ­گونه درمان و تجویز دارو برای حیوانات دیابتی انجام نگرفت.

آنالیز آماری داده­ها

داده­های حاصل از آزمایش خون با استفاده از نرم افزار SAS دامنه­ای داده­های حاصل از گروه­های آزمایشی مورد مقایسه میانگین قرار گرفتند (01/0>p و n:5).

یافته­ها

    مطابق نتایج حاصل جدول 1 تعداد ائوزینوفیل­ها و
بازوفیل­ها بین گروه­های آزمایشی (قبل و بعد از القای دیابت) تفاوت معنی­داری نداشتند. تعداد نوتروفیل­ها، لمفوسیت­ها و مونوسیت­ها تغییر معنی­داری بعد از القای دیابت نشان دادند به طوری که نوتروفیل­ها در گروه دیابتی به 3/82% افزایش یافت (در مقایسه با 38/72% در گروه شاهد و 53/69% در شرایط پیش از القای دیابت) و لمفوسیت­ها و مونوسیت­ها کاهش معنی­داری در گروه دیابتی در مقایسه با گروه شاهد و قبل از القای دیابت داشتند (لمفوسیت­ها: 79/22%، 24/26% و 59/14%، مونوسیت­ها: 05/2%، 58/2% و 81/1% به ترتیب برای گروه­های شاهد، پیش و پس از القای دیابت).

 

جدول1- شمارش افتراقی لکوسیت­ها شامل نوتروفیل، لمفوسیت، مونوسیت، ائوزینوفیل و بازوفیل­ها در سگ­های ژرمن شیپرد گروه شاهد، پیش و پس از القای دیابت تجربی

لکوسیت­ها (درصد از کل)	گروه شاهد (غیردیابتی)	قبل از تزریق آلوکسان  (غیردیابتی)	بعد از تزریق آلوکسان (دیابتی)	ارزش p	SEM
نوتروفیل	b38/72	c53/69	a 13/82	** 0001/0<	842/0
لمفوسیت	b 79/22	a24/26	c 59/14	** 0001/0<	659/0
مونوسیت	b05/2	a58/2	b 81/1	** 0046/0	130/0
ائوزینوفیل	59/2	31/2	46/1	ns 059/0	295/0
بازوفیل	11/0	04/0	01/0	ns 258/0	037/0

**: اختلاف معنی­دار در سطح 1%، ns: اختلاف غیرمعنی­دار

 

بحث و نتیجه‌گیری

 Vozarova و همکاران (14) طی بررسی­هایی که بر روی تحمل گلوکزی، ویژگی­های آزادسازی انسولین و تعداد لکوسیت­های 352 الگوی غیردیابتی داشتند پیشنهاد کردند که نرخ بالای تعداد لکوسیت­ها می­تواند پیشگوی وقوع عارضه دیابت بوده و احتمالاً نشانه­ای از اختلال در فعالیت انسولین و توسعه دیابت تیپ 2 باشد.   Gkrania-Klotsasو همکاران (6) نیز پیشنهاد کردند که تعداد لکوسیت­ها به ویژه لمفوسیت (و نه مونوسیت) دارای همبستگی مثبت با ریسک وقوع دیابت تیپ 2 است. در مطالعه آنها الگوهای بررسی شده از نظر سن، جنسیت، مصرف دخانیات و شاخص جرم بدنی تصحیح شده بودند. Azeez و همکاران (2) گزارش کردند که تعداد لمفوسیت­ها و نوتروفیل­ها بعد از القای دیابت (تا زمان اتلاف حیوانات دیابتی) تغییر قابل ملاحظه­ای نداشته­اند. همچنین در مطالعه Erkin و همکاران (5) نیز کاهش قابل ملاحظه­ای در تعداد لکوسیت­های بیماران مبتلا به رتینوپاتی دیابتی در مقایسه با الگوهای سالم (شاهد) نداشتند. اما در مطالعه حاضر این دو فراسنجه (لمفوسیت و نوتروفیل) تغییر معنی­داری را در گروه دیابتی داشتند، در حالی که ائوزینوفیل­ها و بازوفیل­ها اختلاف معنی­داری (در مقایسه با گروه شاهد و قبل از القای دیابت) نداشتند (جدول 1). یافته­های مطالعه حاضر (افزایش معنی­دار تعداد  نوتروفیل­ها و کاهش تعداد مونوسیت­ها) با یافته­های Vozarova و همکاران (14)، Gkrania-Klotsas و همکاران (6) همخوانی داشته ولی مخالف یافته­های Azeez و همکاران (2) می­باشند. از طرفی، بروز افزایش در تعداد نوتروفیل­ها و کاهش در تعداد مونوسیت­ها (در نتیجه افزایش نسبت نوتروفیل به مونوسیت) به مفهوم یک زیست-نشانگر مهم برای شرایط تحریک ایمنی بدن (مانند شرایط بروز التهاب) مورد قبول قرار گرفته است (6 و 7). به نظر می­رسد فعالیت نسبی سیستم ایمنی در مطالعه حاضر پیرو القای دیابت، ناشی از آسیب­زا (پاتوژنز) بودن عارضه دیابت باشد که در مطالعه Vozarova و همکاران (14) نیز مشاهده شده است.

از یافته­های مطالعه حاضر می­توان نتیجه گرفت که القای دیابت در سگ­های ژرمن شیپرد می­تواند موجب کاهش مونوسیت و لنفوسیت و افزایش تعداد نوتروفیل­ها باشد. چنان­که در مطالعه بنکداران و همکاران (1) در الگوهای دیابتی نیز پیشنهاد شده است، اختلال در متابولیسم گلوکز و گلوتامین به عنوان مواد مغذی لازم برای تکثیر این دسته از لکوسیت­ها ممکن است باعث افزایش نوتروفیل­ها در سگ­های دیابتی شده باشد. انجام مطالعات بیشتر در راستای مشخص شدن دلایل و مکانیسم­های تغییر تعداد لکوسیت­ها در الگوهای دیابتی ضروری به نظر
می­رسد. 

مراجع

1. بنکداران، ش.، قره باغی، م. و واحدیان، م. 1388. کم‌خونی در بیماران دیابتی نوع 2 و رابطه‌ آن با درجه‌های مختلف درگیری کلیوی. مجله غدد درون ریز و متابولیسم ایران، دوره یازدهم، شماره 2، صفحات: 134-127.

1.  Azeez OI, Oyagbemi AA, OyeyemiMO, Odetola AA 2010. Ameliorative effects of Cnidoscolus aconitifolius on alloxan toxicity in Wistar rats. African Health Sci., 10 (3): 283- 291.

3. Bosman DR, Winkler AS, Marsden JT, Macdougall IC, Watkins PJ. 2001. Anemia with erythropoietin deficiency occurs early in diabetic nephropathy. Diabet. Care, 24:495-9.
4. Deray G, Heurtier A, Grimaldi A. 2004. Anemia and diabetes. Am. J. Nephrol., 24: 522-526.
5. Erkin EF, Guler C, Kayikcioglu O, Pirildar T, Ozdemir E. 2001. Diabetik retinopati ile hematolojik parametrelerin iliskisi. Ret-Vit., 9: 45-49. [in Turkish]
6. Gkrania-Klotsas E, Ye Z, Cooper AJ, Sharp SJ, Luben R, Biggs ML. 2010. Differential white blood cell count and type2 diabetes: systematic review and meta-analysis of cross-sectional and prospective studies. Plos One, 18: e13405.
7. Kučer, N., Matijatko, V., Kiš, I., Grden, D., Brkljačić, M., Foršek J., Žvorc Z., Rafaj RB. 2008. White blood cell count and neutrophil to lymphocyte ratio in uncomplicated and complicated canine babesiosis caused by Babesia canis canis. Vet. Arhiv., 78: 321-330.
8. Nelson, RW. 1995. Diabetes mellitus .In Text book of veterinary internal Medicine. Diseases of the dog and cat، 4th ed. edited by SJ. Ettinger and E. C. Feldman. Philadelphia، PA ، W. B. Saunders Co. P: 1510.
9. Santilli F, Cipollone F, Mezzetti A, Chiarelli F.  2004. The role of nitric oxide in the development of diabetic angiopathy. Hormone. Metabol. Res., 36: 319- 335.
10. Valilou M, Shayegh J, Eshratkhah B, Lotfi, AR. 2011. Hematopoietic measures in german shepherd dogs following Alloxan induced diabetes mellitus. Adv. Environ. Biol., 5: 1177-1180.
11. Valilou MR, Lotfi AR. 2010a. Investigation of Ultra structural changes in testicles of German shepherd dogs following alloxan induced diabetes mellitus. Global Veterinaria, 4 (1): 86-89.
12. Valilou MR, Lotfi AR 2010b. Investigation of ultrastructural and histopathological changes in coronary arteries of German shepherd dogs following Alloxan induced diabetes mellitus. African J. Biotechnol., 9 (41): 6932-6936.
13. Valilou MR, Sohrabi HR, Mohammadnejad D, Soleimani RJ. 2007. histopathological and ultra-structural lesions study of kidney of Alloxan induced diabetes mellitus in German shepherd dogs. J. Anim. Vet. Adv., 6 (8): 1012-1016.
14. Vozarova B, Weyer C, Lindsay RS, Pratley RE, Bogardus C, Tataranni PA. 2002. High white blood cell count is associated with a worsening of insulin sensitivity and predicts the development of type 2 diabetes. Diabetes, 51: 455-461.
15. Watanabe, D.,  Nakara H,  Yamaguchi Y,  Akagi K, Hoshiya T, Nagashima Y,  Okaniwa A, Yoshikawa H 2004. The Pathological Features of Alloxan Diabetes in Beagle Dogs. J. Toxicol. Pathol., 17 (3):187- 195.
16. Winkler, AS., Marsden, J., Chaudhuri, KR., Hambley,, H., Watkins, PJ. 1999. Erythropoietin depletion and anemia in diabetes mellitus. Diabet. Med., 16: 813-819.