اثر عصاره گیاه خارخاسک بر بافت‌شناسی و اندازه بیضه در موش صحرایی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 2، دوره 5، 1 (17) بهار، خرداد 1390، صفحه 1043-1049   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

رامین کفاشی الهی^{* 1}؛ غفور موسوی¹؛ سجاد حجازی²؛ میرهادی خیاط نوری²؛ سبحان کلانتری³

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم بالینی، تبریز، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم پایه، تبریز، ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش‌آموخته دامپزشکی، تبریز، ایران

چکیده

خارخاسک­(Tribulus tertestris)  گیاه گل­زا است که به طور سنتی به عنوان محرک میل جنسی استفاده می­شود. مطالعات نشان داده­اند که عصاره خارخاسک­ (TTE) غلظت خونی تستسترون را افزوده و آثار افزاینده میل جنسی ایجاد می­نماید. هر چند این عصاره امروزه به­عنوان یکی از­ مهم­ترین اجزای تشکیل دهنده داروهای آفرودیازیک می­­باشد، ولی اطلاعات مشخصی در ارتباط با آثار هیستولوژیک آن بر بیضه در مصرف طولانی مدت وجود ندارد. هدف مطالعه حاضر تعیین اثرات تجویز خوراکی و طولانی مدت دوز معمول (mg/kg 10)و دوز (mg/kg  20) از عصاره خارخاسک­ بر وزن بدن، هیستولوژی و وزن بیضه، در موش­های صحرایی بود تا بتوان آثار احتمالی منفی آن را در موارد مصرف افراطی دارو تخمین زد. بدین منظور 30 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد Sprague Dawley به طور تصادفی انتخاب و به سه گروه تقسیم شدند که به ترتیب، شاهد (گروه C)، دز mg/kg10 عصاره (گروه A ) و دز  mg/kg20 عصاره­ (گروه B)­ را یک بار در روز به مدت 8 هفته دریافت کردند.­ حیوانات در روز اول وزن­کشی شدند و­ در روز آخر نیز
 بی­هوش گردیده و مجددا ًَ وزن کشی شده و بیضه سمت چپ همه گروه­ها به روش جراحی باز برداشته و وزن بیضه به همراه و بدون اپیدیدیم اندازه­گیری شد. مقاطع هیستوپاتولوژی از بافت بیضه­ها به روش­ رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین و تریکروماسون جهت مطالعات ریزبینی آماده شد. در برش­های تهیه شده، قطر لوله­های اسپرم­ساز، ضخامت لایه اپیتلیالی، طول فضای بینابینی و ضخامت کپسول بیضه، مورد بررسی قرار گرفت. همه مراحل تحقیق به­صورت کور انجام گردید. جهت تحلیل داده­ها از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده گردید. مقدار 05/0p< برای تعیین سطح معنی­دار بودن بین گروه­ها در نظر گرفته شد. نتایج حاصله افزایش معنی­داری را در وزن گروه A و کاهش معنی­داری را در وزن موش­های گروه B در مقایسه با گروه C نشان داد. توزین بیضه­ها افزایش وزن معنی­داری را در در گروه A نشان داد ولی تفاوت معنی­داری مابین وزن بیضه گروه C با B برآورد نگردید. بررسی میکروسکوپیک گروه B حضور لوله­های اسپرم­ساز چروکیده و کاهش تعداد سلول­های اسپرماتوگونی را مشخص نمود. اسپرماتوسیت اولیه و اسپرماتوزویید­ها در مقایسه با گروه A و C تعداد کمتری داشتند و تخریب لوله­های اسپرم­ساز در گروه  Bکاملاً واضح بود. عروق زیر کپسولی ضخیم و منتشر بوده و همه پارامترهای مذکور در دو گروه دیگر طبیعی بودند. نتایج نشان می­دهند که مصرف افراطی عصاره خارخاسک به مدت 8 هفته می­تواند به آثار تخریبی در سیستم تناسلی موش­های صحرایی بیانجامد که می­تواند مشکلات باروری برای جنس نر پیش آورد.

کلیدواژه‌ها

خارخاسک؛ بیضه

اصل مقاله

مقدمه

 

     خارخاسک یک گیاه بوته­ای بومی مناطق گرمسیری کویری و حاره است و در ایران به­ویژه در کویر مرکزی و دشت لوط به صورت خودرو وجود دارد. میوه چهار بخشی و نرم با خارهای تیزی که دارد بیشترین قسمت اثر گذار و مورد استفاده دارویی می­باشد(1، 5 و 6). این گیاه و محصولات آن به طور گسترده در طب سنتی چین و هند برای درمان بیماری­های مزمن مختلف از جمله بیماری­های دستگاه ادراری، قلبی- عروقی و اختلالات معده­ای- روده­ای و برای بهبود عملکرد جنسی در مردها بکار برده می­شده است (2). گیاه خارخاسک به­علت داشتن استروئیدهای مختلف باعث تحریک اسپرماتوژنز شده و با تأثیر بر روی سلول­های سرتولی موجب افزایش تولید اسپرم می­گردد (4). امروزه این گیاه بخش اصلی تشکیل دهنده اکثر داروهای آفرودیازیک می­باشد (1). بدین منظور و به دلیل گستردگی استفاده از داروهای آفرودیازیک و متعاقباً افزایش مصرف خارخاسکدر میان جوامع مختلف، اهمیت تأثیر دارو بر بافت­شناسی بیضه به­عنوان یک سوأل اساسی مطرح می­گردد.  همچنین آثار دیگری از جمله ابعاد و وزن بیضه و وضعیت بدنی حیوان نیز از اهداف دیگر مورد بررسی بودند.

مواد و روش­ها

     21 سرموش صحرایی نر 3-4 ماهه با وزن 350-250­ گرم به طور تصادفی انتخاب و پس از بررسی از لحاظ سلامت ظاهری، در داخل سه قفس مجزا در محل مراقبت از حیوانات دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی تبریز نگه­داری شدند تا ابتدا با محیط جدید تطبیق یابند. در طول کل دوره تحقیق همه موش­ها تحت 12 ساعت نور­دهی و 12 ساعت تاریکی و دمای محیط 22 تا 27 درجه سانتی­گراد و دسترسی آزاد به آب نگه­داری شدند. تغذیه موش­ها در کل دوره تحقیق به شکل پلیت­های آماده که به طور تمام وقت در اختیار آنها قرار داشت انجام گرفت. پس از سپری­شدن دورۀ دو­هفتگی تطبیق با محیط، عصاره تریبولوس ترتستریس خوراکی گیاهی تهیه شده از محل دانشکده داروسازی دانشگاه تبریز را با دوز mg/kg10 (گروه A ) وmg/kg 20 (گروه B) یک­بار در روز برای هر موش تجویز گردید (10). به دلیل تلخ مزگی، دارو با مقداری شکر مخلوط شد و توسط سرنگ به موش­های دو گروه تیمار گاواژ گردید. لازم به ذکر است گروه شاهد (گروه C)  نیز آب مقطر و شکر دریافت نمودند. در روز آخر ابتدا موش­ها توسط رامپون و کتامین به ترتیب با دوز mg/kg10 وmg/kg 60 به صورت تزریق داخل صفاقی بی­هوش گردیدند (10 و 11). سپس
آماده­سازی جراحی در ناحیه اسکروتوم انجام­ گرفته، ضد­عفونی و شان­گذاری شده و بیضه­ها به همراه اپیدیدیم به روش
اخته­کردن بسته خارج گشتند. بیضه­ها را به همراه اپیدیدم از سایر بافت­هایی که متصل به آنها بودند جدا و یک بار همراه با اپیدیدیم و بار دیگر اپیدیدیم جدا گردیده و بیضه به تنهایی توسط ترازوی دیجیتال اندازه­گیری شد. سپس ابعاد بیضه یعنی قطر طولی و قطر عرضی آن توسط کولیس دیجیتال اندازه­گیری و ثبت شد. بیضه جدا شده از اپیدیدیم پس از اندازه­گیری ابعاد آن به درون فر مالین 10% انتقال سپس نمونه­ها برای تهیه مقاطع میکروسکوپی و رنگ­آمیزی اختصاصی هماتوکسیلین- ائوزین و تریکروماسون و ارزیابی تغییرات بافت­شناسی بیضه به آزمایشگاه بافت­شناسی ارسال گردیدند.

یافته­ها

    نتایج حاصل از اندازه­گیری­های ابعاد و وزن نشان داد که وزن حیوان و همچنین وزن بیضه با یا بدون اپیدیدیم و ابعاد آن در دوز نرمال نسبت به دو گروه دیگر افزایش داشته است (جدول 1) .

 

 

 

 

جدول 1- مقایسه وزن حیوان، وزن بیضه با یا بدون اپیدیدیم و ابعاد آن در گروه­های مورد مطالعه

 

پارامترها گروه	وزن حیوان (گرم)	وزن بیضه با اپیدیدیم (گرم)	وزن بیضه بدون اپیدیدیم (گرم)	قطر عرضی بیضه (میلی­متر)	قطر طولی بیضه  (میلی­متر)
c	23/47±02/293	219 /0±032/1	2/0±68/0	79/0±80/9	08/0±90/16
A	7/21±24/306	091/0±33/1	07/0±98/0	25/0±03/11	63/0±36/18
B	82/4±94/247	115 /0±12/1	1/0±71/0	83/0±82/9	02/1±92/16
مقدار  p در آزمون ANOVA	025/0	185/0	059/0	197/0	262/0

نتایج بافت شناسی

در مشاهدات ریز­بینی انجام شده، ساختار بافتی بیضه گروه A در مقایسه با ساختار بافتی گروه شاهد تغییرات مورفولوژیک چشم­گیری نداشت. در این بررسی، مقاطع عرضی و طولی لوله­های منی­ساز، تراکم سلولی سلول­های رده جنسی و فاصله فضای بینابینی به حالت طبیعی مشاهده شدند.

 

 

 

نگاره 1- نمای میکروسکوپی از بافت بیضه گروه کنترل. به ضخامت کپسول بیضه و تراکم درون توبولی را توجه کنید (رنگ­آمیزی H&E بزرگنمایی × 4) (1)-
نمای میکروسکوپی از بافت بیضه گروه  A(رنگ­آمیزی H&E بزرگنمایی × 4) (2)-نمای میکروسکوپی لوله­های منی­ساز، فضای بینابینی از بافت بیضه گروه C (رنگ­آمیزی H&E بزرگنمایی×  10)(3)- نمای میکروسکوپی لوله­های منی­ساز، فضای بینابینی از بافت بیضه گروه A (رنگ­آمیزی H&E بزرگنمایی× 10)(4).

 

در مشاهدات ساختار بافتی گروه B، لوله­های منی­ساز به اشکال نامنظم و چروک خورده دیده شده و سلول­های اسپرماتوگونی با تراکم کم دیده شدند. سلول­های رده جنسی اسپرماتوسیت اولیه، ثانویه و اسپرماتوزویید در مقایسه با گروه A و C در حد پایینی دیده شدند. به دنبال تخریب و تخلیه اپی­تلیوم
لوله­های منی­ساز در گروه B، افزایش چشم­گیر فضای بینابینی و همچنین پراکندگی سلول­های لایدیک در آن فضا وجود داشت.

 

 

 

نگاره 2- نمای میکروسکوپی لوله­های منی­ساز و فضای بینابینی از بافت بیضه گروه B (رنگ­آمیزی H&E بزرگنمایی× 10)(5)- نمای میکروسکوپی لوله­های منی­ساز از بافت بیضه گروه B (رنگ­آمیزی H&E  بزرگنمایی 10×)(6)- در مطالعه روی کپسول بیضه که با رنگ­آمیزی اختصاصی تری کروم ماسون تهیه شده بود تراکم و حضور رشته­های کلاژن تیپ 1 در وضعیت مشابهی با گروه C دیده شده. در این نمونه­ها کپسول بیضه به رنگ آبی قابل تفکیک از ساختار بافت بیضه می­باشد (7 و 8).

وضعیت کپسول بافت بیضه در گروه B نشان از القاء روند فیبروزی داشت سلول­های فیبروبلاستی در این گروه رشته­های کلاژنی تیپ 1 بیشتر ساخته شده و در نتیجه قطر کپسول در این گروه در مقایسه با دو گروه قبلی بیشتر از چند برابر دیده شد. ضخامت کپسول بیضه در رنگ­آمیزی اختصاصی­
تر­یکروماسون از سایر ساختارهای بافت به­خوبی قابل تفکیک بود. از تغییرات دیگر در گروه B، گسترش و قطور شدن عروق مجاور زیر کپسول بیضه بود که در مقایسه با گروه­های C و A چشم­گیر بود. که درحین ایجاد روند فیبروزی تظاهر کرده بود.

 

 

 

 

نگاره 3- نمای میکروسکوپی از کپسول بیضه گروه A (رنگ­آمیزی تری کروم ماسون1- بزرگنمایی × 10 راست و بزرگنمایی × 40 ، چپ)(9 و 10)-  نمای میکروسکپی از کپسول بیضه گروه B  (رنگ­آمیزی تری کروم ماسون 1-بزرگنمایی× 10 )(11)- نمای میکروسکپی از کپسول بیضه گروه B، گسترش گروه خونی در کپسول بیضه در روند القاء فیبروزی (رنگ­آمیزی تری کروم ماسون  بزگنمایی×40)(12).

 

نتایج به­دست­آمده از بیومتری پارامتر­های کمی نشان داد که اندازه لوله منی­ساز و ارتفاع اپی­تلیوم لوله منی­ساز در گروه B به طور معنی­دار نسبت به گروه A و C کاهش داشت (001/0p<) همچنین فاکتورهای فوق در گروه A نسبت به گروه C تفاوت معنی­داری نداشت. فاصله فضای بینابینی و ضخامت کپسول بیضه گروه B در مقایسه با گروه A به طور معنی­داری افزایش داشت (001/0p<). فاکتور­های فوق در گروه A نسبت به گروه C تفاوت معنی­داری نداشت.

 

                          

جدول2- جدول میانگین پارامترهای بافت بیضه بر حسب میکرومتر، هر پارامتر به صورت mean±SEM ارائه شده است (n=7)

 

تعداد	اندازه قطر لوله منی­ساز	ارتفاع لوله اپی­تلیوم	فاصله فضایی بینابینی	ضخامت کپسول بیضه
گروه B	1±2/96	0/48±8/3	8/57±16/8	0/65±24/4
گروه  A	0/02±4/1	0/56±18/5	0/53±8/75	0/35±8/8
گروه C	0/03±3/9	0/5±19	0/08±8/59	0/9±8/9

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

    ضعف قوای جسمی و متعاقباً جنسی در کهنسالان، شرایط سخت زندگی و استرس روانی و عدم وجود تجربه رفتار جنسی در حیوانات و حتی انسانها به شرایط خاصی منجر
می­شود که در طی آن، فرد تمایل به انجام رفتار تولیدمثلی نداشته و گاهاً تداوم نسل به خطر می­افتد. چراکه در حیواناتی که به­طور فصلی تولید­مثل می­نمایند به­ویژه حیواناتی همچون سگ که سالی یک یا حداکثر دوبار قابلیت تولید مثل دارند وجود لیبیدو یا میل جنسی کافی،  جهت شروع، ادامه و خاتمه روند تولیدمثلی ضرورت دارد. از آنجایی­که همیشه در مدیریت تولیدمثلی حیوانات تمامی شرایط مناسب و صحیح وجود نداشته و گاهاً ندانسته رعایت نمی­شوند لذا ضرورت می­یابد تا به طریقی میل جنسی را در انسان یا حیوان به حد نرمال بازگرداند تا این روند به درستی انجام پذیرد. از گیاهان آفرودیازیک چهار مورد مهم عبارتند از خارخاسک، زنجبیل، زعفران و دارچین که مورد ابتدایی از همه معروف­تر و مؤثر­تر بوده و در ترکیب اکثر داروهای آفرودیازیک جزو مهم­ترین و پرغلظت­ترین قسمت دارو محسوب می­شود (1 و 2).

  Walidو همکاران تأثیر تریبولوس آلتوس را به عنوان گونه دیگری از تریبولوس­ها بر­ روی میزان تستوسترون خون موش صحرایی نر آزمایش کردند. در این بررسی مخلوتی از اندام­های ریشه­ای، هوایی، گل و میوه گیاه به­صورت پودر و در متانول 70 درصد خیسانده و عمل­آوری و تهیه شدند. عصاره مذکور با دوز50 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در یک دوز واحد گاواژ گردید و نتایجی که به­دست آمد حاکی از افزایش میزان تستوسترون خون بوده است (19). Kalamegam و همکاران نیز نشان دادند که خارخاسک در موش­های اخته شده نیز می­تواند میزان تستوسترون خون را افرایش دهد که قرابت عینی با نتایج حاصل از تحقیق حاضر دارد، چرا که رشد و نمو بافت بیضه که در گروهA  مشاهده شد می­تواند ناشی از افزایش میزان تستوسترون باشد (3، 8 و11).  Giorgiaو همکاران در یک بررسی دیگر اثر عصاره خارخاسک را در خروس بر روی کیفیت اسپرم مورد مطالعه قرار دادند (12). در این راستابه میزان mg/kg 10 به مدت 4 هفته به آب آشامیدنی حیوانات اضافه شد. در پایان دوره به طریقه ماساژ به
جمع­آوری اسپرم پرداختند و در این میان حجم اسپرم به­طور بارز و برجسته­ای (29 درصد) افزایش یافته بود و با انجام تست تغییر رنگ متیلن بلو مشخص گردید که  تحرک اسپرم نیز  افزایش یافته است، باز این نتیجه نیز نشانی مستقیم و عمده بر افزایش تستوسترون در طول دوره تحقیق داشته است چرا که برای افزایش تعداد اسپرم ضرورتاً به مقادیر بالا و پایای تستوسترون نیاز است (13).  Tomovaو همکاران نیز دریافتند که خارخاسک در تسریع اسپرماتوژنز قوچ­ها اثرات مثبتی داشته است که باز با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد. در این تحقیق نیز افزایش اندازه استرومای بیضه به همراه لومن­های پر از اسپرم می­تواند گوا­هی بر افزایش میزان تستوسترون بوده باشد (16). Antonio و همکاران وAdimoelja  و همکاران اثرات افزاینده قوه جنسی توسط خارخاسک را به­طور قطع از لحاظ افزایش میزان تستوسترون و فرکانس جفت­گیری و افزایش غلظت اسپرم مورد ارزیابی قرار دادند. قابل ذکر اینکه در تحقیق ایشان رفتار موش­های نر در مقایسه با گروه کنترل، تهاجمی تر شده بود و رفتارهای مکرر تولید مثلی و نزاع در میانشان مشاهده می­شد­ (17 و 18).  Jin-wen huangو همکاران پس از مطالعه و بررسی بر روی ترکیب شیمیایی این گیاه موادی همچونterrestrinins D-glucopyranosyl  furostanol, را یافتنند (7). مشخص گردیده است furostanol  بخشی از ترکیب این گیاه به عنوان ماده­ای با اثرات مشابه با تستوسترون عمل می­نماید و در بافت­های محیطی بدن به تستوسترون تبدیل می­گردد. Neychev و همکاران تأثیر معنی­داری بر تولید تستوسترون در­ جوانان در حال بلوغ با تجویز خوراکی خارخاسک مشاهده ننمودند. که با نتیجه تحقیق حاضر همخوانی ندارد. شاید دلیل عدم همخوانی، بالا بودن مقادیر تستوسترون درونزاد در این سنین و عدم پاسخگویی بیشتر به افزایش تستوسترون باشد (18). Gauthaman  و همکاران دریافتند که در اثر مصرف خوراکی خارخاسک با دوز  mg/Kg5، یک بار در روز، فشار خون کاورنوزی پنیس در موش­های رت اخته شده در مقایسه با گروهی که تحت تجویز زیر جلدی تستوسترون با دوز mg/Kg10 دوبار در هفته قرار گرفته بودند افزایش­ یافته، فرکانس جفت­گیری افزایش یافته و فاصله میان هر جفت­گیری کم­تر شده است (10). با توجه به بررسی­های انجام شده و تجویز خوراکی محلول تریبولوس ترتستریس و مشاهده اثرات این دارو در موش­های نر بالغ، مصرف این دارو تا مشخص شدن نتایج کامل در مطالعات بعدی از لحاظ میزان باروری توصیه نمی­شود و توصیه می­گردد مصرف دارو در انسان­هایی که صاحب فرزند نشده­اند منع گردد لکن برای افرادی که قصد داشتن فرزند ندارند بلامانع می­باشد. البته مصرف بلامانع، در استفاده از دوز توصیه شده درمانی می­باشد.

مراجع

1. زرگری، علی. گیاهان داروئی، انتشارات دانشگاه تهران، 3 جلد، تهران 1352-1345.
2. بهزاد، محمود: گیاه شناسی، ترجمه، انتشارات انجمن ملی حفاظت منابع طبیعی و محیط انسانی، تهران 1355.

3. Adaikan,G.P. et al 2000. Proerectile  Pharmacological Effects Of  Tr.Terrestris Extract On The Rabbit. Ann Acad Med Singapore. 2000 Jan; 29(1):22-6
4. Adimoelja A. and Adaikan PG. 1997. Protodioscin from herbal plant Tribulus terrestris improves male sexual functions possibly via DHEA. International Journal of Impotence Research 1997; 9(1):S64.
5. Hosseinzadeh.H. et al 2005. Protective effect of aqueous saffron extract (Crocus sativus L.) and crocin, its active constituent, on renal ischemia-reperfusion-induced oxidative damage in ratsJ Pharm Pharmaceut Sci (www.cspscanada.org) 8(3):387-393, 2005
6. J.Conrad et al .2004. A novel furostanol saponin from Tribulus terrestris ofBulgarianorigin, Fitoterapia75(2004) 117–122
7. Jin-wen hung2003. terrestrinins A and  B, two new sterod saponins  from tribulus terrestris , Journal of Asian Natural Products Research, 2003 Vol. 5 (4), pp. 285–290
8. Kalamegam et al.2008, The hormonal effects of Tribulus terrestris and its role in the management of male erectile dysfunction – an evaluation using primates, rabbit and rat. Phytomedicine,Volume 15, Issues 1-2, 25 January 2008, Pages 44-54
9. Kamath JV, et al.2003. Effect of Cinnamomum zeylanicum bark. Phytother Res. 2003 Sep;17(8):970-2.
10. K.Gauthaman and P.G. Adaikan 2002. Aphrodisiac properties of Tribulus Terrestris extract (Protodioscin) in normal and castrated rats, Life Sciences 71 (2002) 1385-1396
11. Morakinyo A. et al .2008. Effects of Zingiber Officinale on Reproductive Functions in the Male Rat, African Journal of Biomedical Research, Vol. 11 (2008); 329-334
12. Grigorova,S et al.2008. Effect of tribulus terrestris extract onsemen qualiry and serum total cholesterol content in white Plymouth rock –mini cocks, biotechnology in animal huysbandry 24(3-4),p 139-146,2008
13. rogerson,­S et al.2006. The effects of tribulus tertestris extract on plasma steroid hormone concentrations and the urinary testosterone.australian sport drug testing laboratory.
14. grigorova,s and  kashamov,­b.2008. Effect of tribulus terrestris extract on semen quality and serum total cholesterol content in white plymouth rock-mini cocksbiotechnology in animal husbandry 24 (3-4), p 139-146
15. Tomova,­M and Gyulemetova­,R.­1981. Steroidal saponins from Tribulus  terrestris L. with a stimulating action on the sexual functions. First Intern. Conf. Chem. Biotechnolog. Biol. Active Nat. Prod., Proceeding, Varna,  September 3: 289-291.
16. Tomova ,M and Gjulemetova ,R. 1981. Steroidal saponins from Tribulus terrestris L. with a stimulating action on the sexual functions. International Conference of Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products, Varna, Bulgaria, September 21 – 26, vol. 3. 1981. p: 298-302.
17. Viktorov,I and Bozadjieva, E.1994. Pharmacological, pharmacokinetic, toxicological and clinical studies on protodioscin. IIMS  Therapeutic Focus, 213-223.
18. Neychev, V.K and Mitev, V.I. 2005. The aphrodisiac herb Tribulus terrestris does not influence the androgen production in young men, Journal of Ethnopharmacology 101 (2005) 319-323.
19. Walid El-Tantawy and Abeer Temraz.2007. Free serum testosterone level in male rats treated with tribulus alatus extracts,intermational braz  j urol vol.33 (4);554-559, July-august.