مطالعه اثرات تسکینی، پیش‌بیهوشی و ضداضطرابی عصاره گیاه زیرفون (Tilia platyphyllos scop) در مقایسه با دیازپام در موش صحرایی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 3، دوره 5، 1 (17) بهار، خرداد 1390، صفحه 1051-1058   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

علی رضایی^{* 1}؛ بهبود جعفری²؛ چنگیز احمدی زاده²؛ محمد جلیل زاده هدایتی³؛ زهره استادی⁴؛ امیررضا عبادی⁵؛ رامین شیشه گر⁶

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم درمانگاهی، تبریز، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اهر، گروه میکروبیولوژی، اهر، ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اهر، گروه شیمی، اهر، ایران

⁴دانشگاه علوم پزشکی، تبریز، رزیدنت بیهوشی، تبریز، ایران

⁵دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم وتحقیقات تهران، دانشجوی دکتری تخصصی رشته میکروبیولوژی، تهران، ایران

⁶دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اهر، گروه علوم پایه، اهر، ایران

چکیده

گیاه زیرفون از خانواده Tiliaceae عمدتاً در مناطق شمالی کشور پراکندگی دارد. اثرات فارماکولوژی متعدد آن عبارتند از: اثرات ضداضطرابی، ضد باکتری، ضد تشنج، ضد اسپاسم، آرامبخش و تسکین­دهنده، خواب­آور، شل کنندگی عضلات. به منظور مطالعه اثرات تسکینی، پیش­بیهوشی و ضداضطرابی عصاره زیرفون در مقایسه با دیازپام در گروه­های مختلف موش­های صحرایی ماده نژاد ویستار با شرایط سنی و وزنی برابر، دوزهای mg/kg 150، mg/kg 300 و mg/kg 450 از عصاره گیاهی، mg/kg 2/1 دیازپام و همچنین دی متیل سولفوکساید (DMSO) به­عنوان دارونما با حجم برابر، 30 دقیقه قبل از ارزیابی اثرات تسکینی، پیش بیهوشی (مدت خواب القاء شده با کتامین با دوز mg/kg 40) و ارزیابی اثرات ضد اضطرابی با استفاده از (Elevated plus maze) و (Rotarod test) به صورت داخل صفاقی تزریق شد. نتایج به­دست آمده بیانگر افزایش معنی­دار مدت خواب القاء شده با کتامین و همچنین افزایش معنی­دار مدت زمان سپری شده در بازوهای باز در گروه­های تیمار با دوزهای بالا و پایین عصاره بود (01/0p<). نتایج حاصله نشان داد که عصاره زیرفون در دوز mg/kg 300 دارای اثرات تسکینی، پیش­بیهوشی و ضداضطرابی است.

کلیدواژه‌ها

زیرفون؛ تسکین؛ ضد اضطراب؛ دیازپام؛ ماز صلیبی شکل

اصل مقاله

مقدمه

 

     امروزه گیاهان دارویی بخش مهمی از طب سنتی بسیاری از کشورها را تشکیل می­دهند و در رویکردهای جدید درمانی نیز دارای ارزش و جایگاه ویژه­ای می­باشند. در این مطالعه اقدام به شناخت هر چه بیشتر ترکیبات، اثرات تسکینی، پیش بیهوشی و ضد اضطرابی ناشی از عصاره زیرفون شده است.

گیاه Tilia platyphyllos scop که نام اروپایی آن Lime tree و Linden tree و نام ایرانی آن زیرفون می­باشد (8). بیشتر در دره بین کدوم و رستم آباد، سفید رود در گیلان، کجور، مینودشت، جنگل گلستان، جنگل­های کوهستانی بین تنکابن و چورته پراکندگی دارد و از گل­های این گیاه برای اثرات مفید آن بهره می­جویند (12). زمان گلدهی و برداشت این گیاه ماه­های خرداد و تیر می­باشد (5). از مواد مؤثره این گیاه می­توان به فلاونوئیدهای مختلف مانند تیلی­روزید، کورستین، ایزوکورستین، هایپروسید، روتین و آمینواسیدهای مختلف شامل آلانین، سیستئین و سیستین اشاره کرد (4، 14 و 30). گل­های زیرفون دارای اسانسی است که بر اثر تقطیر با آب از آن به دست می­آید و دارای ماده­ای به نام فارنسول، تانن، موسیلاژ و قند نیز می­باشد (4). قسمت­های خشک گیاه زیرفون اشتهاآور، آرامبخش و مدر است (5). اثرات آرامبخشی و برطرف کننده اسپاسم نیز برای گیاه زیرفون ذکر شده است (13 و 18). از خواص دیگر گیاه زیرفون مفید بودن آن در درمان Bronchosis ، Insomnia و روماتسیم می­باشد. دم­کرده آن به صورت غرغره و حمام جهت رفع تحریکات مخاط دهان به کار می­رود (16 و 33). از سوی دیگر دیازپام بنزودیازپینی است که به اجزای مولکولی گیرنده گابا ـ A موجود در غشای نورونی سیستم عصبی مرکزی متصل می­شود و منجر به باز شدن کانال کلر می­گردد و به این ترتیب اثر آرام­بخشی و شل­ کنندگی عضلانی خود را ایجاد می­کند. هدف از این تحقیق شناخت هرچه بیشتر اثرات تسکینی و ضد اضطرابی ناشی از اثر عصاره زیرفون و مقایسه آن با دیازپام به عنوان یک داروی آرام­بخش استاندارد می­باشد (19).

مواد و روش­ها

مواد:

ـ دی کلرومتان (کارخانه مرک، آلمان)

ـ اتانول ( کارخانه مرک، آلمان )

ـ کلرید سدیم 9/0 درصد (کارخانه ثامن، ایران)

ـ دیازپام

ـ دی متیل سولفوکساید (کارخانه مرک، آلمان)

ـ کتامین هیدروکلراید

ـ عصاره گیاه زیرفون

در این مطالعه از 36 سر موش صحرایی نژاد ویستار ماده در محدوده وزنی 20±200 گرم استفاده شد. موش­ها در اتاق حیوانات و در شرایط استاندارد با درجه حرارت محیطی
23-21 درجه سانتی­گراد، رطوبت نسبی 70 درصد و چرخه نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی نگه­داری شدند و از پلت­های استاندارد جهت تغذیه موش­ها به روش
ad libitum استفاده گردید و آب به مقدار کافی در اختیار موش­ها قرار داشت. لازم به ذکر است به منظور سازگاری موش­ها با محیط نگه­داری جدید 10 روز قبل از انجام آزمایشات آنها از مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده پزشکی تبریز به محل نگه­داری حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد تبریز انتقال داده شدند.

برای تهیه عصاره از گل و سرشاخه­های گلدار گیاه زیرفون به میزان 1000 گرم از گیاه خشک را به صورت پودر درآورده، درون مخلوط کلروفرم: متانول (70:30) حداقل به مدت 24 ساعت خیس نموده، سپس مخلوط به دست آمده را تحت فشار خلاء درون دستگاه روتاری اوپراتور حلال­زدائی کرده تا عصاره خام به دست آید. عصاره خام حاصله را در کمترین مقدار متانول داغ حل کرده و سپس در درون فریزر به دمای 15- درجه سانتی­گراد رسانده و به سرعت صاف نموده تا عصاره فاقد چربی به دست آید. به منظور آب­زدایی، عصاره
چربی­زدایی شده را در دی کلرومتان حل کرده و با منیزیم سولفات خشک نموده و در دستگاه روتاری اوپراتور تحت خلاء حلال­زدایی می شود تا اینکه عصاره خالص به دست آید. به منظور مطالعه اثرات تسکینی عصاره زیرفون و مقایسه آن با دیازپام، موش­ها به طور تصادفی در 6 گروه 6 سری تقسیم گردید. به گروه اول عصاره با دوز 150 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به­صورت داخل صفاقی، به گروه دوم عصاره با دوز 300 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به­صورت داخل صفاقی، به گروه سوم عصاره با دوز 450 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به­صورت داخل صفاقی، به گروه چهارم دیازپام با دوز mg/kg 2/1 به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به­صورت داخل صفاقی و به گروه پنجم پلاسبو (DMSO) در همان حجم به­صورت داخل صفاقی تجویز شد و به گروه ششم هیچ دارویی تجویز نشد.

مطالعه در دو بخش انجام گرفت. در بخش نخست که هدف ارزیابی اثرات تسکینی و پیش بیهوشی دارو بود. برای این منظور 30 دقیقه بعد از تجویز داروهای فوق، کتامین با دوز 40 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به­صورت داخل صفاقی در هر شش گروه تزریق شد. بلافاصله بعد از تجویز کتامین مدت زمانی که حیوان رفلکس تصحیح کننده را از دست
می­دهد (Induction time) و مدت زمانی که حیوان بعد از القای بیهوشی دوباره رفلکس تصحیح کننده را باز می­یابد (Sleeping time) بر حسب ثانیه با کورنومتر محاسبه شد. در بخش دوم مطالعه که هدف ارزیابی اثرات ضد اضطرابی دارو می­باشد از آزمون­های زیر استفاده شد:

الف) آزمون ماز صلیبی شکل (Elevated plus maze): این دستگاه شامل دو بازوی باز روبه­روی هم به اندازه­های (10×50 سانتی­متر) و دو بازوی بسته روبه­روی هم به اندازه­های (40×10×50 سانتی­متر) می­باشد که به­وسیله یک صفحه مرکزی (10´10سانتی­متر) با هم در ارتباط هستند (32) که در یک اتاق نیمه تاریک و ساکت و به فاصله 50 سانتی­متر از زمین قرار داده می­شود. در هنگام آزمایش، موش به آرامی و با احتیاط روی بخش مرکزی دستگاه به طوری که سر موش به طرف بازوی باز باشد قرار داده و به مدت 5 دقیقه تعداد رفت و برگشت­ها به داخل بازوها ثبت و پس از هر بار استفاده دستگاه با پارچه آغشته به الکل تمیز شد (21).

لذا از عصاره گیاهی زیرفون با دوزهای mg/kg 450، 300 و 150 و داروی دیازپام با دوز mg/kg 2/1 و DMSO به عنوان پلاسبو به صورت داخل صفاقی استفاده گردید و 30 دقیقه بعد از تجویز داروهای فوق، موش­ها به­صورت انفرادی در مرکز ماز قرار داده شدند و مدت زمانی که موش­ها در هر یک از بازوهای ماز سپری کردند برحسب ثانیه با کورنومتر ثبت شد. مدت زمان حضور موش­ها در مرکز ماز و بازوهای باز
 به­عنوان یک مارکر عدم اضطراب و مدت زمان حضور موش­ها بر روی بازوهای بسته به عنوان یک مارکر اضطراب است که هر چقدر این مدت زمان مربوط به بازوهای باز بیشتر باشد نشان دهنده اثرات ضد اضطرابی قوی­تر داروی مورد نظر
می­باشد.

ب) آزمون میله چرخان شتابدار (Rotarod test): این آزمون برای بررسی تعادل حرکتی و شلی عضلانی استفاده شد چنانچه دارویی اثرات شل­کنندگی داشته باشد یا باعث کاهش تعادل حرکتی شود، این اثرات در نتایج آزمون اضطراب اختلال ایجاد می­کند. این دستگاه یک میله افقی به قطر 7 سانتی­متر دارد که با سرعت اولیه 10 دور بر دقیقه می­چرخد، پس از 20 ثانیه سرعت چرخش میله به 20 دور در دقیقه افزایش می­یابد. 24 ساعت قبل از شروع آزمون موش­ها آموزش دیدند. موش­هایی که توانایی قرار گرفتن بر روی میله چرخان را به مدت 30 ثانیه نداشتند از آزمون حذف شدند. روز بعد به حیوانات تحت آزمایش از عصاره گیاهی زیرفون با دوزهای mg/kg 450، 300 و 150 و داروی دیازپام با دوز mg/kg 2/1 و DMSO به­عنوان پلاسبو به­صورت داخل صفاقی تزریق شد و در
زمان­های 30 و 60 دقیقه پس از تزریق داروهای فوق، هر یک از موش­ها به تنهایی و سه بار متوالی روی میله قرار داده شد که در پایان هر سه بار آزمایش تعداد کل دفعات سقوط و زمان باقی ماندن موش­ها روی میله محاسبه و نتایج آن از طریق نرم افزار ثبت شد. حداکثر زمان مورد بررسی برای هر حیوان در این آزمون 300  ثانیه در نظر گرفته شد (22).

آنالیز آماری داده­ها:

داده­ها به صورت میانگین ± خطای معیار گزارش شد. پس از انجام آزمون ANOVA و در صورت معنی­دار بودن آن با استفاده از آزمون تعقیبی توکی مورد تجزیه وتحلیل قرار گرفت. نتایج با 05/0p< به عنوان معنی­دار در نظر گرفته شد.

یافته­ها

        

نمودار 1- میانگین داده­های Induction time در گروه­های مورد مطالعه

 

با توجه به نمودار فوق دوز mg/kg 300 عصاره گیاه زیرفون از Induction time کمتری نسبت به دیازپام برخوردار است و اختلافات همه از نظر آماری معنی دار بوده و 01/0p<
می­باشد.

 

 

نمودار 2- میانگین داده­های Sleeping time در گروه­های مورد مطالعه

 

با توجه به نمودار فوق دوز mg/kg 300 عصاره گیاه زیرفون از Sleeping time بیشتری نسبت به دیازپام  برخوردار است و اختلافات همه از نظر آماری معنی­دار بوده و 01/0p<
می­باشد.

 

 

نمودار 3- میانگین داده­های Maze در گروه­های مورد مطالعه

 

با توجه به نمودار فوق دوز mg/kg 300 عصاره گیاه زیرفون در Maze بیشترین اثر را به­عنوان یک شاخص ضد اضطرابی دارد و اختلافات همه از نظر آماری معنی­دار بوده و 01/0p<
می­باشد.

 

 

 

نمودار 4- میانگین داده­های Rotarod test در گروه­های مورد مطالعه، تزریق داروها 30 دقیقه قبل از آزمون

 

با توجه به نمودار فوق عصاره گیاه زیرفون در دوزهای mg/kg 450 و 300 سبب کاهش مدت زمان باقی ماندن حیوان بر روی میله چرخان شتاب دار به­صورت وابسته به دوز شد و همچنین عصاره زیرفون در دوزهای فوق از نظر آماری اختلاف معنی­داری را نسبت به دیازپام نشان داد (01/0p<).

 

 

نمودار 5- میانگین داده­های Rotarod test در گروه­های مورد مطالعه، تزریق داروها 60 دقیقه قبل از آزمون

 

با توجه به نمودار فوق عصاره گیاه زیرفون در دوزهای mg/kg 450 و 300 به­طور معنی­دار در مقایسه با دیازپام سبب کاهش مدت زمان باقی ماندن حیوان بر میله چرخان شتابدار شد (01/0p<).

بحث و نتیجه­گیری

    هدف از این تحقیق مطالعه اثرات تسکینی، پیش بیهوشی و ضد اضطرابی عصاره گیاه زیرفون در مقایسه با دیازپام در موش صحرایی بود. ترکیبات مختلفی در گیاه زیرفون شناسایی شده است. از جمله آلونین، آلفاپینن، اوژنول، موسیلاژ، اسیدفنلیک، پروآنتوسیانیدین، ترکیبات فنلی، الکل­های آروماتیک، آمینواسیدهایی مانند تیروزین و گلایسین، ترپینئول، توکوفرول را می­توان نام برد (1 و 23). از این گیاه به عنوان شل­کننده و ترمیم کننده عروق خونی، جلوگیری کننده از تصلب شرایین، کاهش­دهنده تنش عصبی استفاده می­گردد (2 و 25). این گیاه در طب سنتی برزیل به عنوان ضدتشنج، ضد اضطراب و خواب­آور به کار گرفته شده است (15). گیاه زیرفون دارای اثرات آرامبخش و ضدتشنج و ضد اسپاسم می­باشد و از
زمان­های دور در طب سنتی ایران به عنوان آرامبخش و ضد اسپاسم استفاده می­شده است (3 و 29). اثرات خواب آور و ضد اضطراب واریته­ای از زیرفون مورد بررسی قرار گرفته و در بعضی منابع نیز برای گیاه زیرفون خاصیت مدر، معرق، آرام کننده و ضد تشنج ذکر شده است (11، 20 و 27). امروزه این گیاه برای کاربردهای تجاری در فلوریدای آمریکا، مکزیک، ایتالیا و جزایر غربی کارائیب کشت می­شود. زیرفون سده­هاست که در گیاه پزشکی مورد استفاده است و بسیاری از خواص لیمو را دارد. روغن پایه زیرفون از پوست آن و به روش
 افشره­گیری به دست می­آید که به رنگ زرد و یا سبز است و رایحه­ای بسیار قوی، خنک و مانند مرکبات دارد. روغن زیرفون به دلیل داشتن خواص ضدعفونی کننده و منقبض کننده در رفع چربی و لک پوست مورد استفاده قرار می­گیرد خواص ضد باکتری روغن نیز آن را برای درمان عفونت­های پوستی مانند جوش و دمل مناسب ساخته است. در درمان بیماری­های تنفسی مانند سرماخوردگی، گلودرد، سرفه­های زکامی و برونشیت از این روغن استفاده می­شود (6). گل­ها به دلیل داشتن بیوفلاونید باعث کاهش فشار خون می­شوند و گفته
می­شود تصلب شرایین را درمان می­کند. پودر زغال گیاه نیز برای درمان مشکلات گوارشی و التیام سوختگی و زخم­های موضعی مفید است (7). دیازپام از یک سو به­عنوان یک داروی بنزودیازپینی دارای اثرات تسکینی اثبات شده­ای روی سیستم عصبی مرکزی است و از سوی دیگر به عنوان داروی ضد اضطرابی مطرح می­باشد. دیازپام از طریق تعامل با گیرنده­های گابا موجود در مغز به­ویژه در تشکیلات مشبک مغز میانی موجب بروز اثرات تسکینی و ضد اضطرابی می­شود (9). در بخشی از مطالعه اثرات تسکینی و پیش بیهوشی عصاره زیرفون که در طب سنتی به عنوان آرام بخش و خواب­آور و ضد تشنج بکار می­رود در مقایسه با دیازپام مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داده که طی پروسه تسکین در بین روزهای به­کار رفته دوز mg/kg 300 پاسخ­های معنی دارتری نسبت به سایر دوزهای عصاره در مقایسه با دیازپام به همراه داشت
(01/0p<). در این تحقیق برای به دست آوردن دوز مناسب
به­صورت پایلوت کار شد و از دوزهای (mg/kg 450، 300 و 150) استفاده گردید که در این روش 30 دقیقه بعد از تزریق دوزهای فوق از عصاره گیاهی (به­عنوان داروی پیش بیهوشی) از داروی کتامین به عنوان داروی بیهوشی اصلی با دوز mg/kg 40 به شکل داخل صفاقی در موش­های ماده استفاده گردید و جهت مقایسه با اثرات تسکینی و پیش بیهوشی دیازپام 30 دقیقه بعد از تزریق داروی دیازپام به عنوان داروی پیش بیهوشی و با دوز mg/kg 2/1 به­صورت داخل صفاقی از داروی کتامین که یک داروی بیهوش کننده عمومی تزریقی غیر باربیتوراتی و انفکاکی است (24). به عنوان داروی بیهوشی اصلی با دوز mg/kg 40 به شکل داخل صفاقی در موش­های ماده استفاده گردید که بر اساس نتایج به­دست آمده دوز mg/kg 300 از عصاره گیاهی زیرفون اثرات تسکینی بیشتری و بهتری را نسبت به داروی دیازپام نشان داد. بدین­ترتیب که عصاره گیاهی زیرفون با دوز mg/kg 300 در مقایسه با دیازپام با دوز mg/kg 2/1، Induction time کمتر و Sleeping time بیشتری را ایجاد نمود. در بخش دیگری از مطالعه اثرات ضد اضطرابی عصاره گیاهی زیرفون در مقایسه با دیازپام مورد بررسی قرار گرفت. بر طبق نتایج به­دست آمده عصاره گیاهی زیرفون با دوز mg/kg 300 اثرات ضداضطرابی قوی­تری نسبت به دیازپام با دوز mg/kg 2/1 در موش­های ماده ایجاد کرد. همچنین عصاره زیرفون در دوزهای mg/kg 450 و 300 سبب کاهش تعادل حرکتی و کاهش مدت زمان باقی­ماندن حیوان بر میله چرخان شتاب­دار گردید.

نتیجه گرفته می­شود که تزریق عصاره گیاهی زیرفون با دوز mg/kg 300 به­صورت داخل صفاقی به­عنوان داروی پیش بیهوشی قبل از کتامین (به­عنوان داروی بیهوشی) در مقایسه با دیازپام از نظر اثرات تسکینی و پیش بیهوشی اختلاف
معنی­داری را نشان داد و هم چنین تزریق عصاره این گیاه با دوز mg/kg 300 به شکل داخل صفاقی جهت ایجاد اثرات ضد اضطرابی در مقایسه با دیازپام اثرات بهتری را ایجاد کرد و در مقایسه دوز mg/kg 450 از عصاره زیرفون با دوزmg/kg  2/1 دیازپام، Induction time کمتر و Sleeping time بیشتری نسبت به دیازپام دارد ولی مؤثرترین دوز در بین دوزهای عصاره، دوز mg/kg 300 می­باشد. مواد اصلی در گیاه فلاونوئیدهای مختلف Kaempferol، کورستین، هایپروسید و روتین و گلی­کوزیدها (مانند آستراگالین)، کامفرول و آمینواسیدهای مختلف شامل آلانین، سیستئین و سیستین
می­باشد (10، 14 و 30). گزارشاتی درخصوص وجود مواد موثره در گونه­ای از Tilia که بر روی گیرنده­های بنزودیازپینی اثر می­گذارند (31). همچنین گزارشاتی در خصوص
واسطه­گری گیرنده­های بنزودیازپینی در اثرات ضد اضطرابی فلاونوئیدها وجود دارد (17، 26 و 28). لذا با توجه به ماده مؤثره موجود در گیاه زیرفون احتمال دخالت فلاونوئیدها که تمایل زیادی به گیرنده­های بنزودیازپینی متصل به گیرنده گابا-A دارند در اثرات آرامبخشی و ضد اضطرابی گیاه زیرفون وجود دارد با این حال مشخص نیست که آیا ماده مؤثره موجود در گیاه زیرفون از طریق گیرنده­های گابا- A عمل می­کند یا گیرنده­های NMDA و اثبات این امر نیازمند جدا نمودن این ترکیبات از گیاه و تحقیق اختصاصی بر روی هر یک از مواد موثره می­باشد که مستلزم صرف وقت و هزینه­های بیشتر
می­باشد. از آنجا که گیاه زیرفون به عنوان آرامبخش و ضد تشنج در طب سنتی ایران مورد استفاده قرار می­گیرد همچنین گیاهی است که در مناطق جنوبی و شمالی ایران به وفور یافت
می­شود (8). اهمیت این تحقیق در زمینه آنالیزهای فیتوشیمیایی و مطالعات دقیق­تر و گسترده­تر فارماکولوژیک آشکارتر می­شود. 

مراجع

1. پورنوایی، م.د. و سفید کن ، ف. 1386. معرفی گیاهان دارویی ضدسرطان ایران. چاپ اول، انتشارات موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور، صفحات: 211-210.
2. حاجی آخوندی، ع. و بلیغ، ن. 1381. راهنمای کاربردی گیاهان دارویی. صفحه: 168.
3. رجحان، م.ص. 1379. شفا با داروهای گیاهی. چاپ چهارم، تهران، انتشارات دانشگاه تهران، صفحه: 86.
4. زرگری، ع. 1368. گیاهان دارویی ایران. جلد اول، چاپ ششم، انتشارات دانشگاه تهران، صفحه: 399.
5. زمان، س. 1997. گیاهان دارویی، (ترجمه)، تألیف: استودولا، ژ.ل. چاپ پنجم، تهران، انتشارات ققنوس، صفحه: 323-322.
6. شیرازیان، ب. 1386. رایحه درمانی و ماساژدرمانی. چاپ اول ، تهران، انتشارات فردوس، صفحات: 142-141.
7. شیرازیان، ب. 1386. گیاهان دارویی. چاپ اول، تهران، انتشارات فردوس، صفحات: 299-298.
8. مظفریان، و. 1375. فرهنگ نام­های گیاهان ایران، فرهنگ معاصر، صفحات: 586-549.
9. میرزایی، م. و رضوی، ا. 1998. فارماکولوژی، (ترجمه)، تألیف: کاتزونگ، ت. چاپ دوم، تهران، انتشارات سما، صفحات: 210- 199.
10. Aeinechi, Y. 1991. Medicinal Plants. Tehran, Tehran university publications, First Edition. p: 1024.
11. Aguirre, H., Ndez, E. Martmez, A.L., Gonzalez-Trujano, M.E. Morenoa, J. and Soto, H. 2007. Pharmacological evaluation of the anxiolytic and sedative effects of Tilia americana L. Var. mexicana in mice. J Ethnopharmacol. 109(1):1450-1445.
12. Andrew, C. 1996. The encyclopedia of medicinal plants. p: 275.
13. Bremness, L. 1994. Herbs. London. Dorling Kindersly Book. Second Edition. p: 88.
14. Brickman, G. 2000. Herbal Medicine. London, Integrative Medicine Communication. First Edition. p: 240-242.
15. Bladon, C. 2001. Pharmaceutical Chemistry. John Wiley & Sons, New York. 123(7):327-332.
16. Duke, J.A. 2002. Handbook of Medicinal Herbs. Bocan Raton CRC Press, First Edition. p: 462-468.
17. Duxm, N.Y., Takizawa, N., Guo,Y.T. and Shoyama, Y. 2002. Sedative and anticonvulsant activities of goodyerin, a flavonol glycoside from goodyera schlechtendaliana. Phytother Res. 16(3):261-263.
18. Fluke, H. 2000. Medicinal Plants. Tehran. Roozbahan Publication, First Edition. p: 97.
19. Gudmundson, C. and Lidgren, L. 1973. Dose diphenylhdention accelerate healing of fractures in mice. Acta Orthop Scand. 44(2):640-649.
20. Herrera, R., Ramos, R., Zamipa, A., Tortoriello, J. and Jimenez, J.E. 2008. Flavonoids from Tilia americana with anxiolytic activity in plus-maze test. J Ethnopharmacol. 118(2):312-317.
21. Holmes, A. Parmigiani, P.F., Ferrari, P.F., Palanza, P. and Rodgers, R.J. 2000. Behavioral profile of wild mice in the elevated plus maze test for anxiety. Physiology Behavior. 71:509-516.
22. Hosseinzadeh, H. and Nassin, M.A. 2003. Anticonvulsant sedative and muscle relaxant effects of carbonoxlone in mice, BMC Pharmacol. 3: 1.
23. Jean, B. 1995. Pharmacognosy phytochemistry plants. 103-104.
24. Katzung, B. 2004. Basic and clinical pharmacology. McGraw Hill, Co. 641-682.
25. Langman, M. Gilman, E.A. and Lancoshire, R. 2004. Effect of anti-inflammatoty drugs on over all risk of cancer, case- control study in general practice research data base. Br Med. 1642-1666.
26. Medina, J.H., Viola, H. and Wolfman, C. 1997. Over view-flavonoids a new family of benzodiazepine receptor ligands. Neurochem Res. 22(4):419-425.
27. Perez-ortegaa, G. and Vezd, M. 2008. Sedative and anxiolytic efficacy of Tilia americana Var, mexicana inflorescences used traditionally by. Communities of state of Michoacan Mexico. J Ethnopharmacol. 116(3):461-468.
28. Salgueiro, J.B. Ardenghi, P., Dias, M., Ferreira, M.B. and Medina, J.H. 1997. Anxiolytic natural and synthetic flavonoid Ligands of the central benzodiazepine receptor has no effect on memory tasks in rats. Pharmacol Biochem Behav. 58(4):887-891.
29. Silver, D.B. 2000. Healing Plants. London. McGraw Hill Co. Second Edition.160-161.
30. Toker, G., Aslan, M., Yesilada, M.E. and Memisoglu, M. 2001. Comparative evaluation of the flavonoid content if officinal Tilia Flos and Turkish Lime species for quality assessment. J pharm Biomed Anal. 26(1):111-21.
31. Viola, H. Wolfman, C. and Levi, M. 1994. Isolation of pharmacologically active benzodiazepine receptor ligands from Tilia  tomentosa (Tiliaceae). J Ethnopharmacol. 44(1):47-53.
32. Wilson, J., Watson, W.P. and Little, H.J. 1998. CCKB antagonists protected against anxiety- related behavior produced by ethanol withdrawal measured using the elevated plus maze. Psychopharmacol. 137:120-31.
33. Zeppa, S. Vallorani, L. and Pitenza, L. 2000. Estimation of fungal biomass and transcript Levels in Tilia platyphyllos tuber borchii ectomy corrhizae. FEMS Microbial Lett. 188(2):119-124.