تولید تخم مرغ ایمن سازی شده علیه E. coli K99 و Salmonella enteritidis

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 7، دوره 4، 1 (13) بهار، خرداد 1389، صفحه 759-764   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

محمد ملکان^{* 1}؛ فرهاد موسی خانی²؛ هادی پورتقی²؛ علی رضا باهنر³؛ مهیار ملکان⁴

¹دانشجوی دوره دکتری و عضو باشگاه پژوهشگران جوان دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، کرج، ایران

²گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، کرج، ایران

³گروه بهداشت و کنترل مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران

⁴دانش آموخته دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرمسار، گرمسار، ایران

چکیده

باکتری­های E.coli K99 و Salmonella enteritidis از عوامل اصلی اسهال گوساله­ها می­باشند. جهت پیشگیری از وقوع بیماری­های ناشی از این عوامل از روش­های زیادی از جمله واکسیناسیون و انتقال ایمنی غیر فعال ( passive ) می­توان استفاده نمود. به­همین منظور در سال­های اخیر بحث استفاده از تخم مرغ ایمن سازی شده در جیره غذایی گوساله­های حساس مطرح شده است. به­منظور تهیه آنتی ژن، باکتری­های  E.coli K99 وSalmonella enteritidis پس از کشت 24 ساعته در محیط کشت نوترینت براث شرکت مرک، با اضافه کردن محلول فرمالین 1% غیر فعال شدند. آنتی ژن به­دست آمده پس از سه بار شستشو توسط PBS، تصفیه شده و آماده استفاده گردیدند. میزان آنتی ژن در هر دز براساس μg/ml 200 پروتئین و CFU/ml 10⁹×1تنظیم شدند. مرغ­ها 4 تزریق به فاصله 2 هفته یکبار همراه با ادجوانت کامل فروند شرکت سیگما (تزریق اول) و ادجوانت ناقص فروند شرکت سیگما (3 تزریق بعدی) به­صورت زیر جلدی دریافت کردند. نمونه­گیری­های مختلف هم به­فاصله دو هفته یک بار صورت گرفت. سپس تیتر آنتی بادی در نمونه­های سرم و تخم­مرغ با روش آگلوتیناسیون اندازه­گیری شدند. نتایج به­دست آمده از لحاظ آنالیز آماری مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج بررسی حاضر نشان داد که شده تخم مرغ­های ایمن سازی شده، هایپرایمیون بوده و می­تواند برای تحریک سیستم ایمنی گوساله­های یک روزه قابل استفاده باشد.

کلیدواژه‌ها

تخم مرغ ایمن‌سازی شده؛ سالمونلا انتریتیدیس؛ اشریشیا کولای K99

اصل مقاله

مقدمه

 

    در سال­های اخیر استفاده از تخم مرغ­های ایمن سازی شده رواج چشمگیری پیدا کرده است. تاکنون تخم مرغ­های ایمن سازی شده بر علیه E.coli عامل اسهال در خوک­ها، روتا ویروس ایجاد کننده اسهال در نوزاد انسان ، هلیکوباکتر پایلوری در انسان ، پاستورلا مولتی سیدا و ... تولید شده است (8، 13، 15، 17، 18 و 19).

از جمله عوامل اصلی اسهال و مرگ و میر گوساله­ها در
هفته­های اول زندگی می­توان به E.coli K99 و Salmonella enteritidis اشاره نمود (3 و 7). باکتری سالمونلا قادر به ایجاد بیماری­های زیادی در گونه­های مختلف حیوانات و انسان است. به دلیل علاقه این باکتری به دستگاه گوارش، از جمله بیماری­های مهم ایجاد شده توسط آن اسهال می­باشد. به­طوری­که در موارد اسهال حاد، حیوان در اثر توکسمی و از دست دادن آب بدن در عرض 2 تا 5 روز تلف می­شود (1). باکتری E.coli K99 نیز تروپیسم زیادی به دستگاه گوارش داشته و یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده اسهال سفید در هفته اول زندگی گوساله­ها می­باشد (1 ، 2 و 3). این باکتری باعث اختلال در عملکرد آنتروسیت­ها شده و نهایتاً درصورت عدم درمان دام در اثر اسهال ظرف چند روز تلف می­شود (2).

با توجه به اهمیت بیماری­های ایجاد شده توسط  باکتری­های  E.coli K99  و Salmonella enteritidis، در این تحقیق سعی بر آن شده که با تحریک سیستم ایمنی مرغ­ها، تخم
مرغ­هایی به­دست آیند که دارای تیتر بالای آنتی بادی علیه عوامل یاد شده باشند. این محصولات در نهایت قابل استفاده برای گوساله­ها به­منظور ایجاد ایمنی مضاعف علیه، باکتری­های  E.coli K99  و Salmonella enteritidis می­باشند.

مواد و روش‌ها

تهیه آنتی ژن:

    باکتری سالمونلا انتریتیدیس مورد استفاده در این تحقیق از بخش بیوتکنولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه تربیت مدرس تهیه گردید. باکتری E.coli K99 استفاده شده نیز توسط کیت       Capture ELISA شرکت Biox مورد شناسایی قرار گرفته و سپس کشت و جداسازی شد. هویت باکتری­ها مجدداً توسط تست­های بیوشیمیایی و رنگ آمیزی مورد تأیید قرار گرفت. برای تهیه آنتی ژن، باکتری­های  E.coli K99و Salmonella enteritidisدر محیط کشت نوترینت براث شرکت مرک برای مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه  سانتی­گراد پاساژ داده شدند. سپس به آنها فرمالین 1% اضافه شد و برای مدت 24 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند (6). آنتی ژن­های تهیه شده هم به­منظور ایمن سازی مرغ­ها و هم تست اندازه­گیری میزان آنتی بادی­ها به­کار گرفته شدند. به منظور تأیید مرگ باکتری­ها، به­صورت تصادفی نمونه­هایی روی محیط مکانکی آگار شرکت مرک کشت داده شدند که پس از 24 ساعت هیچ  باکتری در آن  رشد نکرد. قبل از کشتن باکتری­ها برای نمونه­هایی از آنها به­طور تصادفی  surface plate count صورت گرفت  تا میزان تقریبی باکتری­ها در مخازن به­دست آیند. این میزان در 5 میلی­لیتر محیط کشت، برای باکتری E.coli K99،  CFU (colony forming unit) 10⁸×2 و برای باکتری سالمونلا انتریتیدیس CFU 10⁹×8 بود. به­منظور شستشو و تهیه آنتی ژن­های خالص از PBS (Phosphate buffer saline)  استریل استفاده شد. پس از 3 بار شستشو، آنتی ژن­ها در PBS هم حجم محیط کشت اولیه حل شده و آماده دزاج نمودن شدند. با استفاده روش پروتئین سنجی لوری در کنار شمارش­های صورت گرفته، میزان آنتی ژن بر پایه μg/ml 200 پروتئین و 10⁹×1 CFU/ml تعیین دوز گردیدند (12، 16 و 18). آنتی ژن­های دزاج شده در میکرو تیوب­های استریل تا زمان تزریق در فریزر 20- درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند.

ایمن سازی مرغ­ها:

در این تحقیق از 28 مرغ لگهورن سفید که از سن 90 روزگی به محل تحقیق انتقال پیدا کرده بودند، استفاده شد. این پولت­ها پس از به تخم آمدن در سن 150 روزگی برای آزمایش استفاده شدند. شرایط نگه­داری از جمله تغذیه، شرایط محیطی و ... برای هر دو گروه آزمایش و شاهد یکسان و در حد مطلوب در نظر گرفته شد. به مرغ­های هر دو گروه شاهد و آزمایش
به­فواصل دو هفته، 4 تزریق به دوصورت زیر جلدی و داخل عضلانی صورت گرفت (6). 14 قطعه مرغ از گروه آزمایش تزریق اول را همراه با ادجوانت کامل فروند (با اضافه کردن میکروب کشته شده سل به روغن معدنی سبک و آب و یک ماده امولسیون کننده مثل مونولئات مانید ادجوانت کامل فروند به­وجود می­آید که با تحریک ماکروفاژها و سلول­های کمکی T واکنش ایمنی را تشدید می­کند.) شرکت سیگما و تزریقات بعدی را همراه ادجوانت ناقص (روغن معدنی سبک و آب و یک ماده امولسیون کننده مثل مونولئات مانید است که با ایجاد التهاب موضعی موجب آزادسازی کند پادگن گردیده و تا حدود زیادی به بروز پاسخ ایمنی مناسب کمک می­کند.) فروند شرکت سیگما دریافت کردند (4 و 6). مرغ­های گروه شاهد نیز آب مقطر استریل دریافت کردند.

اندازه­گیری تیتر آنتی بادی­ها:

نمونه­های خون و تخم مرغ اخذ شده به ترتیب شامل روز صفر، هفته دوم، هفته چهارم، هفته ششم، هفته هشتم و هفته دهم می­باشند. به منظور اندازه­گیری تیتر آنتی بادی در سرم و تخم مرغ از روش آگلوتیناسیون استفاده شد (4). در روز صفر علاوه بر اندازه­گیری تیتر آنتی بادی بر علیه باکتری­های  E.coli K99 و Salmonella enteritidis  در تخم مرغ­ها و سرم، از تخم مرغ­ها نیز بر روی محیط مکانکی آگار شرکت مرک کشت تهیه شد که پس از 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد هیچ باکتریی روی محیط ظاهر نگردید. برای جداسازی و آماده سازی زرده تخم مرغ­ها  برای آزمایش آگلوتیناسیون از روش رقیق کردن با PBS استفاده شد (10). در این روش از فاز مایع سطحی که حاوی ایمونوگلوبولین­های محلول بود برای آزمایش آگلوتیناسیون استفاده شد.

برای هر یک از مرغ­های گروه آزمایش و شاهد یک نمونه سرم  و یک نمونه تخم مرغ در روزهای یاد شده اخذ شدند. برای سنجش میزان آنتی بادی تولید شده بر علیه باکتری­های E.coli K99 و سالمونلا انتریتیدیس در سرم و زرده تخم مرغ­ها از روش آگلوتیناسیون استفاده شد. برای این منظور از دو سری لوله 10 تایی برای هر نمونه سرم و دو سری لوله 10 تایی دیگر برای هر نمونه تخم مرغ استفاده شد. و در کنار هر نمونه 3 لوله شاهد نیز در نظر گرفته شد تا از خطاهای احتمالی جلوگیری شود.

برای انجام آزمایش آگلوتیناسیون ابتدا از سرم و یا فاز مایع ایجاد شده در زرده تخم مرغ­ها رقت­های متوالی تهیه شد. به منظور تهیه رقت­های متوالی ابتدا 9/0 میلی­لیتر PBS در لوله ابتدایی ریخته و به آن 1/0 میلی­لیتر سرم یا فاز مایع ایجاد شده در زرده تخم مرغ­ها اضافه شدند. پس از هموژن سازی میزان 5/0 میلی­لیتر از لوله اول به لوله دوم که حاوی 5/0 میلی­لیتر PBS بود اضافه گردید و این کار تا لوله دهم ادامه پیدا کرد و در انتها 5/0 میلی­لیتر از مایع هموژن لوله دهم دور ریخته شد. سپس به تمامی رقتها مقدار 5/0 میلی­لیتر آنتی ژن هموژن شده، اضافه شده و برای مدت 24 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شد (4). بعد از سپری شدن مدت مذکور، تمامی لوله­ها از نظر ایجاد آگلوتیناسیون مورد بررسی قرار گرفتند و به­منظور تأیید تشخیص لوله­های مشکوک، ازآنها لام تهیه و در زیر میکروسکوپ نوری بررسی شدند.

نتایج حاصل از این بررسی توسط نرم افزار spss مورد آنالیز قرار گرفت.

یافته­ها

   تغییرات مربوط به آنتی بادی در سرم و تخم مرغ برای باکتری­های  E.coli K99 و Salmonella enteritidis در جدول 1 آورده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1-  میانگین­های حسابی (ح) و هندسی (ﻫ) لوله­های مورد آزمایش برای باکتری­های مختلف در سرم و تخم مرغ در طول مطالعه

		سرم				تخم مرغ
باکتری		E.coli		Sal. ent.		E.coli		Sal.ent.
هفته         گروه		آزمایش	شاهد	آزمایش	شاهد	آزمایش	شاهد	آزمایش	شاهد
هفته صفر	ح	85/0	1	0	0	71/0	69/0	0	0
	ﻫ	0	0	0	0	0	0	0	0
هفته 2	ح	14/2	1	5/1	0	2	92/0	42/1	0
	ﻫ	22/1	0	14/1	0	20/1	0	30/1	0
هفته 4	ح	71/4	07/1	57/3	0	07/4	1	35/3	0
	ﻫ	131/1	0	59/1	0	84/1	0	51/1	0
هفته 6	ح	57/5	07/1	5/4	0	42/5	92/0	28/4	0
	ﻫ	237/1	0	113/1	0	215/1	0	97/1	0
هفته 8	ح	85/6	1	71/5	0	64/6	92/0	64/5	0
	ﻫ	579/1	0	262/1	0	499/1	0	250/1	0
هفته 10	ح	35/7	1	42/6	0	07/7	92/0	35/6	0
	ﻫ	819/1	0	430/1	0	672/1	0	409/1	0

 

 

میانگین مقادیر تیتر آنتی بادی در  سرم و تخم مرغ علیه  باکتری E.coli K99براساس شماره لوله­های ثبت شده در هفته­های تحت بررسی،  به­طور جداگانه با آزمون آماری من ویتنی در دو گروه آزمایش و شاهد مورد مقایسه قرار گرفت و به­جز روز صفر که میانگین فاقد اختلاف معنی­دار بود (سرم 61% و تخم مرغ 94%) در بقیه هفته­ها، تیتر گروه آزمایش به طور معنی­داری بیش از گروه شاهد بود. (005/0=p). میانگین مقادیر تیتر آنتی بادی در سرم و تخم مرغ علیه باکتری سالمونلا اینتریتیدیس براساس شماره لوله های ثبت شده در هفته های تحت بررسی به­طور جداگانه با آزمون من ویتنی در دو گروه آزمایش و شاهد مورد مقایسه قرار گرفت و به­جز روز صفر که میانگین فاقد اختلاف معنی­دار بود، در بقیه هفته­ها، تیتر گروه آزمایش به­طور معنی­داری بیش از گروه شاهد بود
(0005/0=p). همچنین تغییرات در طول زمان تیتر آنتی بادی علیه باکتری­های E.coli K99و سالمونلا انتریتیدیس در دو گروه آزمایش و شاهد  با روش آنالیز واریانس با اندازه­گیری مکرر (Repeated Measure ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و مشخص گردید تغییرات در دو گروه شاهد معنی­دار نبوده ولی در گروه آزمایش هم در مورد سرم و هم تخم مرغ به­طور معنی­داری افزایش یافته است (001/0p<).

 

 

 

بحث و نتیجه­گیری

 

     استفاده از تخم مرغ به عنوان حامل فاکتورهای بیولوژیک مختلف در چند دهه اخیر مورد توجه قرار گرفته و از آنجائی­که تخم مرغ در سبد غذایی انسانی به­صورت معمول مصرف
می­شود، تحقیقات در مورد این نوع تخم مرغ­ها جهت درمان بیماری­های مختلف و همچنین کاهش میزان مصرف داروها
به­صورت وسیع در حال انجام است. در سال 2006 Li و همکاران با تولید ایمونوگلوبولین در زرده بر علیه آئروموناس هیدروفیلا، از آن جهت ایمن سازی گونه­هایی از ماهی استفاده نمودند و طی آن، هم در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و هم در شرایط درون تنی (in vivo) نتایج معنی­دار و قابل قبولی کسب نمودند بدین معنی که توانستند با استفاده از زرده­های هایپرایمن ایمنی پاسیو را به ماهی­های مورد آزمایش منتقل نمایند. در سال 2002 Shin و همکاران با تهیه تخم مرغ ایمن سازی شده بر علیه هلیکوباکتر پایلوری، از آن به­عنوان روش کمکی در درمان زخم معده انسان استفاده نمودند (18). Chang و همکاران در سال 1999 با تولید تخم مرغ ایمن سازی شده بر علیه سروتیپ C استرپتوکوکوس موتانس توانستند از آن در جهت جلوگیری از رشد باکتری مذکور در محوطه دهانی انسان استفاده کرده و نتایج معنی­داری به­دست آورند (6). در سال 1991 نیز Wiedemann و همکاران تخم مرغ ایمن سازی شده­ای علیهE.coli  عامل اسهال در خوک­ها تولید نمودند (20). در سال 1994 Kuroki  و همکاران توانستند با تولید تخم مرغ ایمن سازی شده بر علیه روتا ویروس عامل اسهال گوساله­ها و مصرف آن در حیوانات زنده تیتر بالایی از آنتی بادی را علیه این عامل به آنها منتقل نمایند (11). در سال 1998 Ling و همکاران نیز توانستند با واکسیناسیون طیور علیه پاستورلا مولتو سیدا به تیتر حداکثری در تخم مرغ دست پیدا کنند (13). در سال 1992 Farrelly و همکاران توانستند بعد از تولید تخم مرغ ایمن سازی شده علیه یکی از سویه انتروتوکسیژنیک E.coli  و مصرف خوراکی آن در خرگوش­ها به نتایج خیلی خوبی دست پیدا کنند (9). در سال 2008 Chalghoumi و همکاران موفق به تولید تخم مرغ ایمن سازی شده بر علیه سالمونلا تایفی موریوم و سالمونلا انتریتیدیس شدند (5). با توجه به نتایج به­دست آمده توسط محقیقین مختلف، تولید تخم مرغ ایمن سازی شده
به­منظور استفاده در صنعت دامپروری و به­ویژه کنترل اسهال گوساله­ها در دامپروری­ها امری دور از ذهن نبوده و کاربردی خواهد بود.  هدف اصلی این تحقیق با به­دست آوردن حداکثر تیتر آنتی بادی مورد نیاز در زرده تخم مرغ­ها برعلیه باکتری­های E.coli K99 و سالمونلا انتریتیدیس تأمین گردید. زرده تخم مرغ­های ایمن سازی به­دست آمده، هایپر- ایمیون بوده و به منظور کمکی برای سیستم ایمنی گوساله­های یک روزه قابل استفاده می­باشد.

مراجع

1. حسنی طباطبایی، ع. و فیروزی، ر. 1384. بیماری­های باکتریای دام. چاپ دوم، انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 219-218 و 245.
2. ذوقی، ا.، وند یوسفی، ج. و حاجی خانی، ر. 1383. پاتوژنز عفونت­های باکتریای. (ترجمه)، تالیف: گیز، ک.، توئن، چ.، چاپ اول، انتشارات دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، صفحات: 303-266.

 

3. سیفی، ح.، رئوفی، ا.، گرجی دوز، م. و مخبر دزفولی، م. 1379. طب داخلی دام بزرگ. (ترجمه)، تالیف: اسمیت، پی. چاپ اول، جلد دوم، انتشارات نوربخش، صفحات: 235-236.
4. شیمی ، ا.  1380. ایمنی شناسی دامپزشکی. (ترجمه)، تالیف: تیزارد، ا. چاپ اول، انتشارات نوربخش، صفحات: 278-277 و 329-327.

5.       Chalghoumi, R., Théwis, A., Portetelle, D. and Beckers, Y. 2008. Production of hen egg yolk immunoglobulins simultaneously directed against Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium in the same egg yolk. Poultry Science. 87(1):32-40.

6. Chang, H., Yang, R.F., Chen, Y.T. and Chen, C.C. 1999. Productivity and some properties of immunoglubin specific against Streptococcus mutans serotype C in chicken egg yolk. Journal of Agriculture and Food Chemistry.  47:61-66.
7. Divers, T.J. and Peek, S. 2008. Rebhun's Disease of Dairy Cattle. Saunders, Philadelphia, p: 200-205&219-225.
8. Ebina, T., Tsukada, K., Umezu, K., Nose, M.,  Tsuda, K., Hatta, H., et al. 1990. Gastroenteritis in suckling mice caused by human rotavirus can be prevented with egg yolk immunoglobulin (IgY) and treated with a protein-bound polysaccharide preparation (PSK). Microbiol Immunolog. 34(7):617-629.
9. Farrelly, C., Branton, D. and Wanke, C.A. 1992. Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhea in rabbits challenged with the same strain. Infection and Immunity. 60(7): 2593-2597.
10. Fulton, R.M. Nersessian, B.N. and Reed, W.M. 2002.  Prevention of Salmonella enteritidis infection in commercial duckling by oral chicken egg derived antibody alone or in combination with probiotics. Poultry Science. 81:34-40.
11. Kuroki, M., Ohta, M., Ikemori, Y., Peralta, R.C., Yokoyama, H. and Kodama, Y. 1994.  Passive protection against bovine rotavirus in calves by specific immunoglobulins from chicken egg yolk, Arch Virology. 138(1-2):143-148.
12. Li, X.L., Shuai. J.B. and Fang, W.H. 2006. Protection of Carassus auratus  gibelio against infection by Aeromonas hyedrophila using specific immunoglobulins from hen egg yolk. Journal of ZhejiangUniversity. 7(11):922-928.
13. Ling, Y.S., Guo, Y.J., Li, J.D., Yang, L.K., Luo, Y.X., Yu, S.X., et al. 1998. Serum and egg yolk IgG antibody titers from laying chickens vaccinated with Pasteurella multocida. Avian Disease. 42(1):186-189
14. Marquardt, R.R., Jin, L.Z., Kim, J.W., Fang, L., Frohlich, A.A. and Baidoo, S.K. 1999. Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli K88+ infection in neonatal and early-weaned piglets. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 23(4):283-288.
15. Owusu-Asiedu, A., Nyachoti, C.M. and Marquardt, R.R. 2003.  Response of early-weaned pigs to an enterotoxigenic Escherichia coli (K88) challenge when fed diets containing spray-dried porcine plasma or pea protein isolate plus egg yolk antibody, zinc oxide, fumaric acid, or antibiotic. Journal of animal science. 81(7):1790-1798.
16. Salerno, R., Odell, C., Cyanovich, N., Bubnis, B., Morges, W. and Gray, A. 1985. Lowry protein determination by automated flow injection analysis for bovine serum albumin and hepatitis B surface antigen. Analytical Biochemistry. 151:309-314.
17. Sarker, S.A. , Casswall, T.H. , Juneja, L.R. , Hoq, E., Hossain, I., Fuchs, G.J., et al. 2001. Randomized, placebo-controlled, clinical trial of hyperimmunized chicken egg yolk immunoglobulin in children with rotavirus diarrhea. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition.  32(1):19-25.
18. Shin, J.H., Yang, M., Nam, S.W., Kim, J.T., Myung, N.H., Bang, W.G.  et al. 2002. Use of yolk derived immunoglobulin as an alternative to antibiotic treatment for control of helicobacter pylori infection. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9(5):1061-1066.
19. Shin, J.H., Nam, S.W., Kim, J.T., Yoon, J.B., Bang, W.G. and Roe, I.H. 2003. Identification of immunodominant Helicobacter pylori proteins with reactivity to H. pylori-specific egg-yolk immunoglobulin. Journal of Medical Microbiology. 52(Pt 3):217-222.
20. Wiedemann, V., Linckh, E., Kühlmann, R., Schmidt, P. and Lösch, U. 1991. Chicken egg antibodies for prophylaxis and therapy of infectious intestinal diseases. V. In vivo studies on protective effects against Escherichia coli diarrhea in pigs. Journal of Veterinary Medicine, Series B. 38(4):283-291.