مطالعه اثرات توأم مونولورین و اسانس‌های پونه (Mentha pulegium L.) و نعناع (Mentha spicata L.) روی باسیلوس سرئوس و اشریشیاکولای O157:H7 در شرایط آزمایشگاهی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 5، دوره 3، 4 (12) زمستان، اسفند 1388، صفحه 657-666   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

مسلم نیریز نقدهی^{* 1}؛ سید مهدی رضوی روحانی²؛ گیتی کریم³؛ ودود رضویلر³؛ امیر زینالی⁴؛ رضا دلشاد⁵

¹دانش‌آموخته بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران

²گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

³گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران

⁴دانشجوی سال پنجم دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه، ارومیه، ایران

⁵کارشناس علوم آزمایشگاهی دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه، ارومیه، ایران

چکیده

مونولورین و اسانس­های نعناع و پونه هر کدام دارای فعالیت­های ضد باکتریایی مختلف روی اجرام میکروبی هستند. تشدید فعالیت ضد باکتریایی روی باسیلوس سرئوس  ATCC11778 و اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ و نیز پی بردن به اثرات توأم آنها از اهداف این تحقیق بودند. مواد و روش به­کار رفته در این تحقیق مشتمل بر تهیه مونولورین، تهیه اسانس گیاهان مورد مطالعه و آنالیز ترکیب شیمیایی آنها با روش GC/MS، تهیه میزان تلقیح باکتریایی، انجام آزمایشات تعیین حساسیت ضد میکروبی به روشBroth micro dilution MIC testing  و بالاخره تحلیل آماری نتایج با نرم افزار SPSS بودند. حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) اسانس پونه، اسانس نعناع، مونولورین، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع روی باسیلوس سرئوس و اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ معنی­دار بودند (p<0.01). MIC ترکیب اسانس پونه با مونولورین و نیز ترکیب اسانس نعناع با مونولورین روی باسیلوس سرئوس در مقایسه با MIC اسانس­های پونه و نعناع به­صورت جداگانه معنی­دار بودند (p<0.01). ترکیب مونولورین با اسانس نعناع اثر مهاری سینرژیستی روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ نشان داد. مؤثرترین عوامل ضد میکروب روی باسیلوس سرئوس، مونولورین، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع، و کم تأثیرترین عامل روی آن، اسانس نعناع بودند. همچنین مؤثرترین عامل ضد میکروب روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ اسانس پونه و کم تأثیرترین عامل روی آن، مونولورین بود. با توجه به این که MIC ترکیب مونولورین با اسانس پونه و نیز ترکیب آن با اسانس نعناع روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ در مقایسه با MIC مونولورین به­صورت جداگانه معنی­دار نبود، لذا برای تأثیر قابل توجه روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ و نیز سایر باکتری­های گرم منفی، ترکیب مونولورین با عوامل شلاته کننده و نیز سایر عوامل ضد میکروب طبیعی پیشنهاد می­گردد.

کلیدواژه‌ها

مونولورین؛ اسانس پونه؛ اسانس نعناع؛ اشریشاکولای O157:H7؛ باسیلوس سرئوس

اصل مقاله

مقدمه

 

    باسیلوس سرئوس در خاک و گیاهان گسترده بوده و بیش از 40 سال است که به­عنوان یکی از عوامل شناخته شده بیماری­های حاصل از مواد غذایی محسوب می­شود. باسیلوس سرئوس دو نوع مسمومیت یکی با علامت استفراغ و دیگری با نشانه اسهال ایجاد می­کند که توسط دو نوع آنتروتوکسین تولید شده توسط این باکتری حاصل می­شود (1). اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ از سروتیپ­های معروف گروه EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) بوده که عامل دو نوع بیماری کولیت خونریزی دهنده و سندرم HUS (Haemolytic Uraemic Syndrome) در انسان می­باشد. حیوانات از جمله گاو و شاید طیور، گوسفند و خوک به­عنوان مخزن اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ مطرح هستند (1). همچنین باسیلوس سرئوس و اشریشیاکولای علاوه بر بیماری­زایی برای انسان، به­عنوان عوامل فساد در شیر و فرآورده­های آن نیز مطرح هستند (17). مونولورین یک مونواستر متشکل از اسید لوریک بوده که دارای اثرات ضد ویروس و ضد باکتریائی می­باشد (10). علاوه بر این، گزارش شده است که تعدادی از قارچ­ها، مخمرها و انگل­های پروتوزوآیی نیز به­وسیله مونولورین غیرفعال می­گردند (10). روغن نارگیل و برخی از محصولات نارگیل حاوی تقریبا 50 درصد اسیدلوریک و تقریبا 7-6 درصد اسید کاپریک هستند (10). اطلاعات واضح و مشخصی در ارتباط با اینکه واقعاً چه مقدار مونولورین در صورت مصرف اسیدلوریک در بدن انسان تولید می­شود، وجود ندارد. با این وجود، مدارکی نیز موجود است که بیانگر تولید مقداری از آن در بدن انسان هستند (10). اسید لوریک (C₁₂) در مقایسه با سایر اسیدهای چرب با زنجیره متوسط از جمله اسید کاپریلیک (C₈)، اسید کاپریک (C₁₀) یا اسید میریستیک (C₁₄) دارای اثرات ضد ویروس و ضد باکتری بیشتری
می­باشد (10). از نظر بیولوژیکی، مونولورین در از بین بردن ویروس­ها و باکتری­ها چند برابر بیشتر از اسید لوریک فعال می­باشد (10). در حالت کلی، مونولورین بر علیه باکتری­های گرم مثبت از جمله استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه، استرپتوکوکوس های گروه A ،B ،F و G و لیستریا مونوسایتوجنز بسیار مؤثر بوده و در میان باکتری­های گرم منفی، هلیکوباکتر پیلوری و هموفیلوس آنفولانزا به­وسیله مونولورین غیرفعال شده و روی سایر باکتری­های گرم منفی در صورت توأم شدن با عوامل شلاته کننده (Chelator) مؤثر می­باشد (10). مونولورین اثرات ویروس­کشی و باکتری­کشی خود را از طریق حل نمودن لیپیدها و فسفولیپیدهای موجود در پوشش پاتوژن­ها اعمال می­کند که در نهایت موجب گسیختگی پوشش آنها می­گردد (10). اسانس­ها یا روغن­های اساسی یا EOs (Essential oils) که روغن­های اتری یا فرار هم نامیده می­شوند، در واقع مایعات روغنی آروماتیک هستند که از گیاهان به­دست می­آیند. بیشترین مصرف EOs در اتحادیه اروپا در غذاها (به­عنوان طعم دهنده)، عطرها و داروها می­باشد. ترکیبات فنلی عمدتاً عامل خصوصیات ضدباکتریایی اسانس­ها محسوب می­گردند. تعدادی از ترکیبات EOs از جمله کارواکرول، تیمول، اوژنول، پریل آلدهید، سینام آلدهید و اسید سینامیک به­عنوان ضد باکتری­های مؤثر شناسایی شده­اند (4). مطالعات در شرایط آزمایشگاهی اثرات ضدباکتریایی اسانس­ها را در برابر لیستریا مونوسایتوجنز، سالمونلا تایفی موریوم، اشریشیاکولای  O₁₅₇:H₇، شیگلا دیزانتریه، باسیلوس سرئوس و استافیلوکوکوس آرئوس اثبات نموده است (4). همچنین باکتری­های گرم منفی اندکی کمتر از باکتری­های گرم مثبت نسبت به اسانس­ها حساس هستند (4). یکی از معیارهایی که به­وسیله بیشتر محققین جهت اندازه­گیری فعالیت ضد باکتریایی عوامل ضد میکروب استفاده می­گردد، اندازه­گیری حداقل غلظت مهارکنندگی رشد یا  MIC (Minimum inhibitory concentration) می­باشد (8). مطالعات متعددی در ارتباط با تعیین MIC عوامل ضد میکروب طبیعی از جمله نایسین، لیزوزیم، مونولورین، لاکتوفرین و اسانس گیاهان متعدد روی اجرام میکروبی انجام شده است. با توجه به این که عوامل ضد میکروب هر کدام دارای اثرات متفاوت روی میکروارگانیسم­ها می­باشند، لذا برای تشدید فعالیت، توأم نمودن این عوامل با یکدیگر و نیز پی­بردن به اثرات توأم آنها مدنظر محققین قرار گرفته است. تحقیق حاضر نیز با این هدف و برای اولین بار جهت پی بردن به اثرات توأم مونولورین و اسانس­های پونه و نعناع در شرایط آزمایشگاهی انجام شد. 

مواد و روش‌کار  

2-1- تعیین میزان تلقیح باکتریایی:

ابتدا باکتری­های مورد مطالعه که شامل اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ (اهدائی دکتر داریوش خاشابی، مؤسسه سلامت و ایمنی غذا، اتریش) و باسیلوس سرئوس ATCC 11778 بودند، از بخش میکروب­شناسی مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران تهیه شدند. باکتری­ها در آبگوشت مغذی خوندار و در شرایط یخچال نگهداری شده و در فواصل زمانی سه الی چهار هفته، برای حفظ فعالیت، تجدید کشت می­شدند. برای بدست آوردن پرگنه­های تک از سوسپانسیون باکتری­ها، در محیط آگار مغذی کشت خطی داده شدند. در مرحله بعد، سه پرگنه تک، از هر کدام از باکتری­ها برداشت نموده و در لوله­های آزمایش محتوی 5 میلی­لیتر آبگوشت مغذی کشت داده شدند. پس از 18 ساعت گرمخانه­گذاری در 35 درجه سانتی­گراد، جذب نوری (Optical density) کشت­های باکتری­ها، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Apel PD-303S در طول موج 600 نانومتر تعیین شدند. هم­زمان جهت به­دست آوردن تعداد تقریبی باکتری­ها در
کشت­های 18 ساعته، رقت­های 10 برابر تا ^7-10 تهیه و به مقدار 1/0 میلی­لیتر از رقت­های ^5-10 ، ^6-10 و ^7-10  به روش سطحی کشت داده شدند. پلیت­ها در 35 درجه سانتی­گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه­گذاری شدند. سپس پلیت­هایی که دارای 250-25 CFU (Colony forming units) بودند، جهت شمارش انتخاب شدند. تعداد تقریبی باکتری­های باسیلوس سرئوس و اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ در آبگوشت 18 ساعته به ترتیب 10⁷ و CFU/ml 10⁹ تعیین شدند. در مرحله بعد، از کشت­های 18 ساعته باکتری­ها، مقادیر مختلفی به کووت­های (Cuvette) حاوی یک میلی­لیتر آبگوشت مغذی منتقل و با خواندن جذب نوری و انجام شمارش باکتریایی، کووت­های حاوی CFU/ml  10⁶ جهت تلقیح به چاهک­ها انتخاب شدند.

2-2- آماده سازی مونولورین:

مونولورین از شرکت Med-Chem Laboratories آمریکا تهیه شد. برای تهیه محلول ذخیره مونولورین، 5/0 گرم از پلت­های مونولورین به لوله آزمایش محتوی 5 میلی­لیتر اتانول 96 درجه افزوده و با شیکر لوله به­ هم زده شد تا به­طور کامل حل شود. سپس محلول مونولورین، با فیلتر سرنگی به قطر منافذ 45/0 میکرومتر سترون گشته و در یک لوله آزمایش سترون درپوش­دار نگه­داری شد. به­طوری­که محلول ذخیره تهیه شده، محتوی 100000 میکروگرم مونولورین در هر میلی­لیتر بود. با توجه به اینکه مونولورین روی باکتری­های گرم مثبت در مقایسه با باکتری­های گرم منفی اثرات ضدمیکروبی بیشتری دارد، لذا در آزمایش روی باسیلوس سرئوس ابتداء رقت 1/0 از محلول ذخیره تهیه شد، سپس رقت­های دو برابر (two fold) تا 8 رقت، یعنی از 10000 تا  g/mlμ 78 در لوله­های آزمایش محتوی آبگوشت مغذی تهیه شدند. همچنین با توجه به اثرات ضد میکروبی کمتر مونولورین روی باکتری­های گرم منفی، در آزمایش روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇، از محلول ذخیره مونولورین، رقت­های دو برابر تا g/mlμ 780 تهیه شدند (15).

 2-3- آماده سازی اسانس­ها:

اسانس­های مورد مطالعه که شامل اسانس­های استاندارد پونه (Mentha pulegium L.) و نعناع (.Mentha spicata L) بودند، از شرکت باریج اسانس کاشان تهیه شدند. برای حل نمودن اسانس­ها از محلول 10 درصد دی متیل سولفوکساید یا DMSO (Dimethylsulfoxide) استفاده شد، به این صورت که ابتدا به میزان 1/0 گرم از اسانس­های مورد مطالعه به لوله­های آزمایش محتوی 1 میلی­لیتر از محلول 10 درصد DMSO افزوده شد و با استفاده از شیکر لوله آزمایش تا ایجاد یک سوسپانسیون شیری رنگ تکان داده شدند. در مرحله بعدی محلول اسانس­ها، با استفاده از فیلتر سرنگی با قطر منافذ 45/0 میکرومتر سترون و در یک لوله آزمایش درپوش­دار سترون ریخته شدند. به­طوری­که هر کدام از محلول­ها، محتوی  g/mlμ100000 یا mg/ml 100 از اسانس­های پونه و نعناع بودند. سپس از محلول­های اسانس­ها، رقت­های دو برابر تا 8 رقت یعنی از 100000 تا  g/mlμ 780 در لوله­های آزمایش محتوی آبگوشت مغذی تهیه شدند (19).

2-4- آنالیز ترکیب­های تشکیل دهنده اسانس­ها:

ترکیبات تشکیل دهنده اسانس­های گیاهان مورد مطالعه با همکاری پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی شناسایی شدند. اسانس­های گیاهان مورد نظر پس از آماده سازی به دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف­سنج جرمی (GC/MS) تزریق گردیدند تا نوع ترکیب­های تشکیل دهنده آنها مشخص شود. دستگاه گاز کروماتوگرافی استفاده شده از نوع Agilent مدل 6890 با ستون به طول 30 متر، قطر داخلی 25/0 میلی­متر و ضخامت لایه 25/0 میکرومتر از نوع HP-5MS بود. برنامه دمایی ستون به این نحو تنظیم گردید: دمای ابتدائی آون 50 درجه سانتی­گراد و توقف در این دما به مدت 5 دقیقه، گرادیان حرارتی 3 درجه سانتی­گراد در هر دقیقه، افزایش دما تا 240 درجه سانتی­گراد با سرعت 15 درجه در هر دقیقه، افزایش دما تا 300 درجه و 3 دقیقه توقف در این دما، دمای اتاقک تزریق 290 درجه سانتی­گراد بود و از گاز هلیوم به عنوان گاز حامل با سرعت جریان (فلو) 8/0 میلی­لیتر در دقیقه استفاده گردید. طیف­نگار جرمی مورد استفاده از نوع Agilent مدل 5973 با ولتاژ یونیزاسیون 70 الکترون ولت، روش یونیزاسیون EI و دمای منبع یونیزاسیون 220 درجه سانتی­گراد بود. شناسایی طیف­ها به کمک شاخص بازداری آنها و مقایسه آن با شاخص­های موجود در کتب مرجع (2) و مقالات (11، 18 و 20) و با استفاده از طیف­های جرمی ترکیبات استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه کامپیوتری صورت گرفت.

2-5- تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC):

ارزش MIC اسانس­ها و مونولورین، هم به­صورت جداگانه و هم به­صورت توأم روی باکتری­های مورد نظر مطالعه شدند. برای دستیابی به این هدف از روش Broth micro dilution MIC testing استفاده شد. در این روش از پانل پلی­استیرن حاوی 96 چاهک استفاده می­گردد. در مطالعه حاضر نیز از میکروپلیت­های استریل 96 چاهکی ته پهن با حجم چاهک 360 میکرولیتر استفاده گردید (8).

2-5-1- تعیین MIC مونولورین و اسانس­های پونه و نعناع به­صورت جداگانه روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ و باسیلوس سرئوس:

ابتدا به میزان 160 میکرولیتر از آبگوشت مغذی، سپس به میزان 20 میکرولیتر از غلظت­های تهیه شده مونولورین و یا
اسانس­های پونه و نعناع و در نهایت به میزان 20 میکرولیتر باکتری از کووت­های حاوی تعداد تقریبی CFU/ml 10⁶ به چاهک­های میکروپلیت افزوده شدند. بدین ترتیب حجم محتویات در چاهک­ها به 200 میکرولیتر رسیده و با توجه به ایجاد رقت 1/0 در چاهک­ها، غلظت مونولورین و اسانس­ها در چاهک­ها 10 برابر رقیق شده و تعداد تقریبی باکتری­ها هم در چاهک­ها بهCFU/well  10⁵ خواهند رسید. برای کنترل مثبت (استریلیتی)، 200 میکرولیتر آبگوشت مغذی و برای کنترل منفی (رشد باکتری­ها)، 180 میکرولیتر آبگوشت مغذی همراه با 20 میکرولیتر از تلقیح­های باکتریایی به چاهک­ها افزوده شدند. میکروپلیت­ها پس از درپوش گذاری به مدت 20 ثانیه در سرعت rpm 300  در دستگاه ترموشیکر میکروپلیت تکان داده شده سپس به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتی­گراد گرمخانه گذاری شدند. پس از 24 ساعت، میکروپلیت­ها از گرمخانه خارج شده و چاهک­ها به­صورت چشمی یا Visual از نظر ایجاد یا عدم ایجاد کدورت بررسی شدند. سپس برای تأیید، به میزان 10 میکرولیتر از اولین چاهک شفاف، همراه با یک چاهک شفاف و کدر مجاور آن برداشت نموده و پس از رقت سازی، به­صورت سطحی در آگار مغذی کشت داده شدند. MIC پایین­ترین غلظت یک ماده ضد میکروب که موجب کاهش 90 درصد یا بیشتر تلقیح اولیه گردد، تعریف گردید (7). همچنین حداقل غلظت کشندگی یا MBC (Minimum bactericidal concentration) پایین­ترین غلظت ماده ضد میکروب که موجب کاهش 9/99 درصد یا بیشتر تلقیح اولیه گردد، تعریف شد (5، 6 و 7).

2-5-2- تعیین MIC مونولورین و اسانس­های پونه و نعناع به­صورت توام روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ و باسیلوس سرئوس :

 ابتدا به میزان 140 میکرولیتر از آبگوشت مغذی، 20 میکرولیتر از غلظت­های مختلف مونولورین و 20 میکرولیتر از غلظت­های مختلف اسانس­های پونه و نعناع ولی یکسان با غلظت مونولورین و در نهایت 20 میکرولیتر باکتری از کووت­های حاوی تعداد تقریبی CFU/ml 10⁶ به چاهک­های میکروپلیت ریخته شدند که در مجموع حجم چاهک­ها به 200 میکرولیتر خواهند رسید. کنترل­های مثبت و منفی و همچنین سایر مراحل همانند تعیین MIC مونولورین و اسانس­های پونه و نعناع
به­صورت جداگانه بودند.

2-6- تحلیل آماری نتایج:

آزمایشات در سه بار تکرار انجام و نتایج حاصل میانگین هر سه تکرار می­باشد. تجزیه و تحلیل داده­ها توسط نسخه 15 برنامه آماری SPSS انجام شد. بررسی تأثیر انواع عوامل ضد میکروب روی باسیلوس سرئوس و اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ توسط آنالیز واریانس انجام شد. بررسی اختلاف شاخص­ها هم توسط آزمون­های توکی و دانکن در p<0.05  و p<0.01 انجام گرفتند. 

نتایج

     نتایج حاصل از آنالیز ترکیبات تشکیل دهنده اسانس­های مورد مطالعه با استفاده از روش GC/MS در جدول 1 همچنین مقایسه میانگین نتایج MIC مربوط به سه تکرار مونولورین و اسانس­های پونه و نعناع به­صورت جداگانه و توأم روی باسیلوس سرئوس و اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ در جداول 2  آمده است.

 

 

 

جدول 1- ترکیبات شیمیایی موجود در اسانس­های نعناع (.Mentha spicata L) و پونه (.Mentha pulegium L)

ردیف	نام ترکیب	اسانس نعناع (%)	اسانس پونه (%)	اندیس بازداری (RI)
1	α-Thujene	04/0	-	931
2	α-Pinene	27/1	03/0	939
3	Camphene	-	76/0	953
4	Sabinene	62/0	04/0	976
5	β-Pinene	34/2	08/0	980
6	3-Octanone	03/0	-	984
7	β-Myrcene	88/0	03/0	991
8	3-Octanol	52/0	08/0	993
9	3-Carene	07/0	-	1011
10	α-Terpinene	07/0	-	1018
11	p-Cymene	69/0	-	1026
12	Limonene	88/23	-	1031
13	Eucalyptol	-	01/5	1033
14	cis-Ocimene	05/0	-	1040
15	trans-Ocimene	19/0	-	1050
16	γ-Terpinene	24/0	-	1062
17	α-Terpinolene	13/0	-	1088
18	Linalool	09/0	19/0	1098
19	trans-Pinocarveol	-	04/0	1139
20	cis-Sabinol	-	09/0	1140
21	Isopulegol	15/0	-	1145
22	Cis-β-Terpineol	15/0	-	1144
23	Menthone	79/1	39/3	1154
24	Borneol	-	68/1	1165
25	Menthol	38/3	-	1173
26	Terpinen-4-ol	39/0	54/0	1177
27	α-Terpineol	21/0	52/5	1189
28	cis-Dihydrocarvone	9/0	18/0	1193
29	trans-Ddihydrocarvone	09/0	-	1200
30	trans-Carveol	25/0	-	1217
31	Pulegone	07/0	68/2	1237
32	Carvone	87/55	89/0	1242
33	Piperitone	-	60/33	1252
34	Geraniol	17/1	-	1255
35	trans-Anethole	-	03/0	1283
36	Bornyl acetate	-	93/0	1285
37	Thymol	13/0	2/0	1290
38	Carvacrol	-	08/0	1298
39	trans-Carvyl acetate	12/0	-	1337
40	Pipeirtenone	05/0	71/28	1342
41	cis-Carvone oxide	06/0	-	1363
42	Piperitenone oxide	-	94/3	1369
43	β-Elemene	05/0	-	1375
44	Geranyl acetate	16/0	28/0	1383
45	β-Bourbonene	6/0	-	1384
46	β-Cubebene	06/0	-	1390
47	Cis-Jasmone	05/0	-	1394
48	β-Caryophyllene	42/0	46/0	1418
49	Geranyl acetone	-	17/0	1453
50	β-Farnesene	13/0	-	1458
51	Germacrene D	05/0	-	1480
52	-Cadineneγ	-	06/0	1513
53	Caryophyllene oxide	06/0	76/0	1581
54	Viridiflorol	04/0	-	1590
درصد کل ترکیبات شناسایی شده		19/97	51/90

 

 

جدول 2-  مقایسه میانگین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) مربوط به سه تکرار مونولورین و اسانس­های پونه و نعناع به­صورت جداگانه و توأم (g/mlµ)

میکروارگانیسم عوامل ضد میکروب	باسیلوس سرئوس	اشریشیاکولایO157:H7
مونولورین	26 a	10000< c
اسانس پونه	5000 b	4166 a
اسانس نعناع	10000< c	10000 b
مونولورین + اسانس پونه	26 a	8333 b
مونولورین + اسانس نعناع	31 a	6666 ab

                             حروف مشترک نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنی­دار است.

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

 

Hadjiakhoondi  و همکاران در سال 2000 ترکیب شیمیایی اسانس نعناع (Mentha spicata L.) را با روش GC/MS تعیین نمودند. 28 ترکیب که شامل 14/90 درصد از کل ترکیبات اسانس می­شدند، شناسایی شدند. عمده ترکیبات تشکیل دهنده عبارت بودند از: کاروون (40/22 درصد)، لینالوول (25/11 درصد) و لیمونن (80/10 درصد). Mahboubi و Haghi در سال 2008 فعالیت ضد میکروبی و ترکیب شیمیایی اسانس پونه (Mentha pulegium L.) را با استفاده از روش GC/MS تعیین نمودند. عمده ترکیبات تشکیل دهنده عبارت بودند از: پیپریتون (38 درصد)، پیپریتنون (33 درصد)، آلفا ترپینئول (7/4 درصد)، 1 و 8 سینئول (4 درصد)، اکسید پیپریتون (4/3 درصد)، منتون (1/3 درصد)، بورنئول (9/4 درصد) و پولگون (3/2 درصد). Mohsenzadeh در سال 2007 اثر ضد باکتریایی غلظت­های مختلف (01/0 تا 15 درصد) اسانس­های آویشن (Thymus vulgaris)، نعناع فلفلی (Mentha piperita L.)، زیره (Carum carvi)، رازیانه (Foeniculum vulgar)، پونه (Mentha pulegium) و ترخون (Artmesia dracunculus) را روی استافیلوکوکوس آرئوس و اشریشیاکولای در محیط آبگوشت مغذی مطالعه نمود. ارزش MIC اسانس­های نعناع فلفلی، رازیانه، آویشن، پونه، زیره و ترخون روی اشریشیا کولای به­ترتیب 03/0 ± 5/0، 03/0 ± 1، 01/0 ± 3/0، 03/0 ± 7/0، 02/0 ± 6/0 و 13/0 ± 2 درصد بودند.

 Razavi-Rohani و Griffiths در سال 1994 فعالیت ضد باکتریایی مونولورین و تری گلیسرول 1و2 لورات را به­صورت تنها و به­صورت ترکیب با سه عامل شلاته کننده در pH های مختلف و غلظت­های مختلف NaCl مطالعه نمودند. فعالیت این عوامل در برابر 16 باکتری (7 گرم مثبت و 9 گرم منفی) به منظور تعیین MIC  با استفاده از روش Spiral gradient end point مطالعه شد. مونولورین در برابر تمام باکتری­های گرم مثبت مورد مطالعه مؤثر بود، ولی در برابر باکتری­های گرم منفی فقط در حضور EDTA اثر کرد. مهار باکتریایی در pH پائین و غلظت­های بالای NaCl در بیشترین میزان بود. Razavi-Rohani و Griffiths در سال 1996 فعالیت ضد میکروبی ترکیبات لیزوزیم، مونولورین، تری گلیسرول 1و2 لورات و بوتیلیتد هیدروکسی آنیزول (Butylated hydroxylanizole) را در برابر 7 باکتری گرم مثبت و 8 باکتری گرم منفی در pH  و غلظت­های مختلف NaCl و EDTA با استفاده از روش Spiral gradient end point مطالعه نمودند. اثر مهاری لیزوزیم درحالت ترکیب با مونولورین روی باکتری­های گرم مثبت اندکی بیشتر از
باکتری­های گرم منفی بود ولی اثر توأم آنها، به­طور قابل توجهی بیشتر از اثر مونولورین به تنهایی نبود. در مورد باکتری­های گرم مثبت، ترکیب مونولورین و BHA  اثر مهاری بیشتری از اثر هر کدام به تنهایی داشتند. با این وجود، مونولورین اثرات ضد میکروبی BHA  را در برابر باکتری­های گرم منفی کاهش داد. Branen و Davidson در سال 2004 با استفاده از روش Microtiter plate اثر متقابل اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (Ethylenediaminetetraacetic acid) و لاکتوفرین را با نایسین، لیزوزیم و مونولورین در برابر لیستریا مونوسایتوجنز، اشریشیاکولای، سالمونلا آنتریتیدیس و پزودوموناس فلورسنس مطالعه نمودند. EDTA  به­صورت سینرژیست، فعالیت نایسین، مونولورین و لیزوزیم را در Tryptic soy broth روی دو سویه آنتروپاتوژن اشریشیاکولای تشدید نمود. علاوه بر این، ترکیبات مختلف نایسین، لیزوزیم و مونولورین با EDTA نسبت به بعضی از باکتری­های گرم منفی کشنده بوده درحالی­که هیچکدام از این مواد ضد میکروب به تنهایی در برابر این باکتری­های گرم منفی باکتریسید نبودند.  

Preuss و همکاران در سال 2005  اثرات مهاری و کشندگی اسانس پونه کوهی و چند اسانس دیگر را همراه با مونولورین به روش Macro-broth-dilution روی استافیلوکوکوس آرئوس، باسیلوس آنتراسیس، اشریشیاکولای، کلبسیلا پنومونیه، هلیکوباکتر پیلوری و مایکوباکتریوم تره (Mycobacterium terrae) مطالعه نمودند. اسانس پونه کوهی به غیر از باسیلوس آنتراسیس روی سایر ارگانیسم­های مورد آزمایش دارای اثر کشندگی بود. مونولورین روی استافیلوکوکوس آرئوس و مایکوباکتریوم تره دارای اثر کشندگی بود ولی روی اشریشیاکولای و کلبسیلا پنومونیه فاقد اثر بود. در مقابل، هلیکوباکتر پیلوری نسبت به مونولورین بسیار حساس بود. همانند اسانس پونه کوهی، مونولورین هم روی باسیلوس آنتراسیس اثرات مهاری داشت.

در تحقیق حاضر در  آنالیز GC/MS عمده ترکیبات تشکیل دهنده اسانس نعناع عبارت بودند از: کاروون (87/55 درصد)، لیمونن (88/23 درصد)، منتول (38/3 درصد)، بتاپینن (34/2 درصد)، منتون (79/1 درصد)، آلفا پینن (27/1 درصد) و ژرانیول (17/1 درصد)، همچنین عمده ترکیبات تشکیل دهنده اسانس پونه عبارت بودند از: پیپریتنون (60/33 درصد)، پیپریتون (71/28 درصد)، آلفا ترپینئول (52/5 درصد)، اکالیپتول (01/5 درصد)، اکسید پیپریتنون (94/3 درصد)، منتون (39/3 درصد)، پولگون (68/2 درصد)، بورنئول (68/1 درصد). سایر ترکیبات تشکیل دهنده اسانس­های نعناع و پونه که مقادیر آنها کمتر بودند در جدول شماره 1 فهرست شده است. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که MIC اسانس پونه، اسانس نعناع، مونولورین، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع از لحاظ تأثیر روی باسیلوس سرئوس اختلاف معنی­دار دارند (p<0.01). همچنین در آزمون دانکن گروه­بندی حاصله به این صورت بود که گروه یک (کمترین MIC) شامل مونولورین، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع، گروه دو شامل اسانس پونه و گروه سه (بیشترین MIC) شامل اسانس نعناع می­شدند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که MIC اسانس پونه، اسانس نعناع، مونولورین، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ اختلاف معنی­دار دارند (p<0.01). همچنین در آزمون دانکن گروه­بندی حاصله به این شکل بود که گروه یک (کمترین MIC) شامل اسانس پونه، ترکیب مونولورین با اسانس نعناع، گروه دو شامل ترکیب مونولورین با اسانس نعناع، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و اسانس نعناع، و گروه سه (بیشترین MIC) شامل مونولورین می­شدند. علاوه بر این، در اثر ترکیب مونولورین با اسانس نعناع اثرات مهاری سینرژیستی روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ مشاهده شد.

مقایسه میانگین MIC عوامل ضد میکروب با آزمون توکی نشان داد که میانگین MIC ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع روی باسیلوس سرئوس در مقایسه با میانگین MIC مونولورین به تنهایی معنی­دار
نمی­باشد (p>0.05). همچنین میانگین MIC ترکیب اسانس پونه با مونولورین و ترکیب اسانس نعناع با مونولورین روی باسیلوس سرئوس به ترتیب در مقایسه با میانگین MIC  اسانس پونه و اسانس نعناع به­صورت جداگانه معنی­دار بودند. از سوی دیگر نتایج آزمون توکی نشان داد که میانگین MIC ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ در مقایسه با میانگین MIC مونولورین به تنهایی معنی­دار
نمی­باشد. همچنین میانگین MIC ترکیب اسانس پونه با مونولورین و ترکیب اسانس نعناع با مونولورین روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ به ترتیب در مقایسه با میانگین MIC اسانس پونه و اسانس نعناع به­صورت جداگانه معنی­دار نبودند.

بنابراین از تحقیق حاضر می­توان چنین نتیجه­گیری نمود که مؤثرترین عوامل ضد میکروب روی باسیلوس سرئوس، مونولورین، ترکیب مونولورین با اسانس پونه و ترکیب مونولورین با اسانس نعناع بوده و کم تأثیرترین عامل روی آن، اسانس نعناع می­باشد. همچنین می­توان نتیجه گرفت که مؤثرترین عامل روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇، اسانس پونه بوده و کم تأثیرترین عامل روی آن، مونولورین می­باشد.   

بنابراین یافته­های تحقیق کنونی با نتایج Preuss و همکاران، همچنین Razavi-Rohani و Griffiths در بی­تأثیر بودن مونولورین به تنهایی روی عمده باکتری­های گرم منفی
به­خصوص اشریشیاکولای و کلبسیلا همخوانی دارد.

با توجه به اینکه MIC ترکیب مونولورین و اسانس­های نعناع و پونه روی اشریشیاکولای O₁₅₇:H₇ در مقایسه با  MIC استفاده جداگانه هر کدام معنی­دار نبودند لذا برای تأثیر قابل توجه روی عمده باکتری­های گرم منفی ترکیب مونولورین با عوامل شلاته کننده و همچنین سایر عوامل ضد میکروب طبیعی پیشنهاد می­گردد.

مراجع

1. رضویلر، و. (1387): میکروب­های بیماری­زا در مواد غذایی و اپیدمیولوژی مسمومیت­های غذائی، چاپ اول، انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 90-84  و 156-153. 

 

2. Adams, R.P. (1995): Identification of Essential Oils by Gas Chromatography/ Mass Spectroscopy. Allured Publ. Crop., Carol Stream, IL.
3. Branen, J.K. and Davidson, P.M. (2004): Enhancement of nisin, lysozyme, and monolaurin antimicrobial activities by ethylenediaminetetraacetic acid and lactoferin. International Journal of Food Microbiology, 90: 63-74. 
4. Burt, S. (2004): Essential oils: their antibacterial properties and potential application in foods-a review. International Journal of Food Microbiology, 94: 223-253.
5. Canillac, N. and Mourey, A. (2001): Antibacterial activity of the essential oil of Picea excelsa on Listeria, Staphylococcus aureus and coliform bacteria. International Journal of Food Microbiology, 18: 261-268.
6. Carson, C.F., Hammer, K.A. and Riley, T.V. (1995): Broth microdilution method for determining the susceptibility of Escherichia coli and Staphylococcus aureus to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Microbios, 82: 181-185.
7. Cosentino S, Tuberoso CI, Pisano B, Satta M, Mascia V, Arzedi E, et al. (1999): In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils. Letters in Applied Microbiology, 29: 130-135.
8. Coyle, M.B. (2005):  Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing, American Society for Microbiology, pp: 53-62.
9. Hadjiakhoondi, A., Aghel, N., Zamanzadeh-Nadgar, N. and Vatandoost, H. (2000): Chemical and biological study of Mentha spicata L. essential oil from Iran. Journal of Daru, 8: 19-21.
10. Lieberman, S., Enig. M.G. and Preuss, H.G. (2006): A review of monolaurin and lauric acid: Natural virucidal and bactericidal agents.  Alternative and Complementary Therapies, 12(6): 310-314.
11. Lorenzo, D. (2002): Essential oils of Mentha pulegium and Mentha rotundifolia from Uruguay. Brazilian Archives of Biology and Technology, 45(4): 519-524. 
12. Mahboubi, M. and Haghi, G. (2008): Antimicrobial activity and chemical composition of Mentha pulegium L. essential oil. Journal of Ethnopharmacol., 119: 325-327.
13. Mohsenzadeh, M. (2007): Evaluation of antibacterial activity of selected Iranian essential oils against Staphylococcus aureus and Escherichia coli in nutrient broth medium. Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(20): 3693-3697.
14. Preuss HG, Echard B, Enig M, Brook I, Elliott TB. (2005):  Minimum inhibitory concentrations of herbal essential oils and monolaurin for gram-positive and gram-negative bacteria. Molecullar and Cellular Biochemistry, 272: 29-34.
15. Razavi-Rohani, S.M. and Griffits, M.W. (1994): The effect of mono and polyglycerol laurate on spoilage and pathogenic bacteria associated with foods. Journal of Food Safety, 14: 131-151.
16. Razavi-Rohani, S.M. and Griffits, M.W. (1996): Inhibition of spoilage and pathogenic bacteria associated with foods by combinations of antimicrobial agents. Journal of Food Safety, 16: 87-104.
17. Robinson, R.K. (2002): Dairy microbiology handbook. 3rd ed., John Wiley and Sons, Inc., New York, pp: 103, 563.
18. Sacchetti, G. (2005): Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods. Food Chemistry, 91: 621-632.
19. Sharififar, F. (2007): In vitro evaluation of antibacterial and antioxidant activities of the essential oil and methanol extract of endemic Zataria multiflora Boiss. Journal of Food Control., 18: 800-805.
20. Soković MD, Vukojević J, Marin PD, Brkić DD, Vajs V, van Griensven LJ. (2009): Chemical composition of essential oils of Thymus and Mentha species and their antifungal activities. Molecules, 14: 238-249.
21. Yesil Celiktas, O. (2007):  Antimicrobial activities of methanol extracts and essential oils of Rosmarinus officinalis, depending on location and seasonal variations. Journal of Food Chemistry, 100: 553-559.