ارزیابی وضعیت هموسیستئین پلاسما در بیماری دیابت ملیتوس القاء شده با استرپتوزوتوسین در خرگوش

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 1، دوره 3، 2 (10) تابستان، شهریور 1388، صفحه 445-450   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

کاوه عظیم زاده^{* 1}؛ سیامک عصری رضائی²؛ شهاب الدین صافی¹؛ ایرج سهرابی حقدوست¹؛ مجید ابراهیمی حامد³

¹گروه پاتولوژی، دانشکده علوم تخصّصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران

²گروه پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه اورمیه، اورمیه، ایران

³گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اورمیه، اورمیه، ایران

چکیده

در این تحقیق مقادیر هموسیستئین پلاسما، به­عنوان یک ریسک فاکتور مستقل در بیماری­های قلبی-عروقی، در دیابت القائی ناشی از استرپتوزوتوسین در خرگوش سفید نیوزیلندی مورد سنجش و ارزیابی قرار گرفت. در این تحقیق 12 سر خرگوش نر سفید نیوزیلندی انتخاب و به 2 گروه مجزا (تیمار و شاهد) تقسیم گردید. پس از اطمینان از سالم بودن خرگوش­ها (طبیعی بودن مقادیر گلوکز، اوره و کره­آتینین پلاسما)، به گروه تیمار استرپتوزوتوسین با دوز 65 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم به­صورت تک دوز و از طریق ورید مارژینال تزریق گردید و به گروه تیمار نیز سالین نرمال با دوز مشخص تزریق شد. در ادامه 24، 48 و72 ساعت و سپس هر هفته یکبار تا 12 هفته از ورید مارژینال خرگوش­ها خونگیری به­عمل آمد و مقادیر هموسیستئین، انسولین و گلوکز پلاسما مورد سنجش و ارزیابی آماری قرار گرفت. نتایج حاکی از افزایش معنی­دار (01/0p<) هموسیستئین و گلوکز و کاهش معنی­دار (01/0p<)انسولین پلاسمای گروه تیمار در مقایسه با گروه شاهد در طول 12 هفته از مطالعه بود. در این مطالعه علی­رغم کاهش انسولین پلاسما، افزایش هموسیستئین پلاسما به­عنوان ریسک فاکتور مستقل در بیماری­های قلبی-عروقی در خرگوش سفید نیوزیلندی مشاهده شد.

کلیدواژه‌ها

دیابت ملیتوس؛ استرپتوزوتوسین؛ هموسیستئین

اصل مقاله

مقدمه

 

     دیابت ملیتوس (نوع I و II) یکی از مهم­ترین بیماری­های متابولیکی است که نقش بسیار مهمی در بروز عوارض مختلف دارد (15). یکی از مهم­ترین عوارض ناشی از دیابت ملیتوس نوع I، بیماری­های قلبی-عروقی بوده که عامل اصلی آن نیز آترواسکلروزیس می­باشد که با اختلال در کارکرد
سلول­های آندوتلیال عروق همراه است (14). چندین فاکتور در بروز آترواسکلروزیس ناشی از دیابت مؤثر است که یکی از اساسی­ترین و مهم­ترین آنها ترکیبی بنام هموسیستئین می­باشد. هموسیستئین برای اولین بار توسط Butz  و Du Vigneaud در سال 1932 کشف شد. هموسیستئین هومولوگ اسید آمینه سیستئین بوده که اختلاف آن در زنجیره جانبی، وجود یک گروه –CH₂-  اضافی قبل از گروه تیول (-SH-) می­باشد. این ترکیب ضمناً می­تواند از اسید آمینه ضروری متیونین نیز مشتق شود (1، 2، 4، 11 و 16).

 جهت بررسی وضعیت هموسیستئین پلاسما می­توان از حیوانات آزمایشگاهی اعم از موش سوری، موش صحرایی و خرگوش سفید نیوزیلندی برای القاء دیابت استفاده نمود که در موش صحرایی به­طور وسیع انجام گرفته ولی در خرگوش مقاله منتشر شده­ای در رابطه با تغییرات هموسیستئین در دیابت نوعI (ناشی از داروی استرپتوزوتوسین) مشاهده نگردید بدین جهت تصمیم گرفته شد مطالعه­ای در خرگوش سفید نیوزیلندی انجام گیرد.

 فرضیه ارتباط هموسیستئین پلاسما با بیماری­های قلبی-عروقی توسط McCully و همکارانش در سال 1969 مطرح گردید و در مطالعات بعدی اپیدمیولژیک نیز فرضیه ایشان توسط Nehler و همکارانش در سال 1997 به اثبات رسید،
به­طوری­که هموسیستئین به­عنوان ریسک فاکتور مستقل در بروز بیماری­های قلبی-عروقی و آترواسکلروزیس ناشی از دیابت مورد تأیید قرار گرفت (10 و 12).

برای القاء دیابت نوع I اکثراً از ترکیباتی که در گروه داروهای شیمی درمانی هستند، استفاده می­شود که شامل آلوکسان و استرپتوزوتوسین می­باشد (13). استرپتوزوتوسین یا همان استرپتوزوسین (streptozocin) (STZ) (zonosar) با فرمول شیمیایی از مشتقات آنتی­بیوتیک­های صناعی بوده و توسط قارچی به­نام استرپتومایسس آکروموژنز (Streptomycetes achromogenes) سنتز می­شود ( 6، 7 و 9). از این ترکیب جهت درمان کارسینومای جزایر لانگرهانس و تومورهای کارسینوئید و لنفوماها استفاده می­شود. این ترکیب، پودری است به رنگ زرد لیمویی که به صورت لیوفیلیزه و در ویال­های مختلف (mg 1000 تا mg 5)  وجود دارد (7).

مواد و روش‌کار

     در این تحقیق، تعداد 12 سر خرگوش نر آزمایشگاهی (نژاد سفید نیوزیلندی) با وزن تقریبی 132±452/1 کیلوگرم از دانشکده دامپزشکی دانشگاه اورمیه خریداری شدند. سپس خرگوش­های مورد نظر، به­صورت تصادفی به دو گروه 6 تایی تیمار و شاهد تقسیم شدند و در مکانی مناسب و آرام و در درجه حرارت 20-24 درجه سانتی­گراد و 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با هدف عادت کردن خرگوش­ها به محیط به­مدت 2 هفته نگه­داری گردیدند. جهت تغذیه خرگوش­های مذکور، از جیره استاندارد (پلیت، گندم و ذرت) به میزان 150-120 گرم در روز به­ازای هر خرگوش استفاده می­گردید. در این تحقیق از داروی استرپتوزوتوسین جهت القای دیابت استفاده شد که به­صورت ویال قهوه­ای رنگ یک گرمی ساخت شرکت آمریکائی  Aldrich Sigma بود. به گروه تیمار داروی استرپتوزوتوسین با دوز 65 میلی­گرم بازای هر کیلوگرم وزن بدن (3 و 6) به­صورت داخل وریدی و از طریق ورید مارژینال تزریق شد. البته قبل از هر گونه تزریق، از کلیه خرگوش­ها خونگیری به­عمل آمد و آزمایش CBC صورت گرفت و با مقایسه نتایج آزمایشگاهی با مقادیر نرمال از سلامتی خرگوش­ها اطمینان حاصل شد. پس از تزریق دارو توسط سرنگ­های انسولینی به گروه تیمار، به گروه شاهد بر اساس وزن خرگوش حجم مشخصی سالین نرمالِ استریلِ قابل تزریق، با همان روش تزریق شد. سپس در فواصل زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از تزریق و بعد، هر هفته یک بار تا 12 هفته (3 ماه) از ورید مارژینال خونگیری انجام شد و بلافاصله بعد از خونگیری، خون به لوله­های حاوی EDTA منتقل و پلاسما توسط دستگاه سانتریفیوژ و با دور 3000 در مدت 10 دقیقه جدا گردید.

هموسیستئین پلاسما توسط کیت انسانی (Diazyme Laboratories USA,1288,Gregg Court Poway,CA,92064 ,www.diazyme.com) و با استفاده از دستگاهِ RA1000 به­صورت اتوماتیک
اندازه­گیری گردید. انسولین پلاسما به­روش
الکتروکِمی­لومینسانس ((ECL توسط دستگاه Elecsys 2010، محصول کمپانی Roche (محصول مشترک آلمان و ژاپن) و کیتِ انسانی ساخت همان شرکت، اندازه­گیری شد. گلوکز نیز توسط دستگاه اتوآنالایزر ساخت شرکت Hitachi با استفاده از کیت Elitech فرانسه اندازه­گیری ‌شد. وزن تقریبیِ نهایی خرگوش­های گروه شاهد در پایان دوره 12 هفته 94±729/1 کیلوگرم و وزن تقریبیِ نهایی گروه تیمار 56±925/1 کیلوگرم شد. در این تحقیق داده­ها با استفاده از نرم افزار spss ویرایش 15 تحت ویندوز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. آماره­های مربوط به داده­ها شامل میانگین و انحراف معیار بودند. عملیات مقایسه میانگین هر یک از پارامترها در گروه­های بیمار و سالم توسط آزمون t-Test مستقل در سطح خطای 01/0=α انجام گرفت. برای ارزیابی وجود همبستگی بین متغیرها انسولین و هموسیستئین از آزمون آماری پیرسون استفاده شد.

نتایج

     در این تحقیق افزایش معنی­داری (01/0p<) در هموسیستئین و گلوکز و کاهش معنی­دار (01/0p<) در انسولین در گروه تیمار در مقایسه با گروه شاهد در طول 12 هفته از مطالعه و ارتباط معنی­دار منفی بین انسولین و هموسیستئین مشاهده گردید (نمودار 1).

نتایج حاصل از اندازه­گیری هموسیستئین پلاسما در گروه­های تیمار و شاهد در طول 12 هفته از مطالعه در جدول 1 درج شده است. همان­گونه که قابل مشاهده است، مقادیر هموسیستئین پلاسما در گروه شاهد در طول 12 هفته از مطالعه، بین 8-5 واحد در لیتر پلاسما در نوسان بوده در
حالی­که در گروه تیمار به­طور معنی­داری افزایش یافته است.

 

جدول 1- مقادیر هموسیستئین پلاسما در  گروه­های تیمار و شاهد در طول 12 هفته از مطالعه

 

 

 

نتایج حاصل از اندازه­گیری مقادیر گلوکز پلاسما در گروه­های تیمار و شاهد در طول 12 هفته از مطالعه در جدول 2 درج شده است. همانگونه که قابل مشاهده است، مقادیر گلوکز در

گروه شاهد در طول 12 هفته از مطالعه، بین 74-59 میلی­گرم در صد میلی­لیتر پلاسما در نوسان بوده در حالی­که در گروه تیمار به­طور معنی­داری افزایش یافته است.

 

 

جدول 2- مقادیر گلوکز پلاسما در گروه­های تیمار و شاهد در طول 12 هفته از مطالعه

 

نتایج حاصل از اندازه­گیری مقادیرانسولین پلاسما در گروه­های تیمار و شاهد در طول 12 هفته از مطالعه در جدول 3 درج شده است. همانگونه که قابل مشاهده است، مقادیر انسولین پلاسما در گروه شاهد در طول 12 هفته از مطالعه، بین 4-2 میکرو واحد در میلی­لیتر پلاسما در نوسان بوده در حالی­که در گروه تیمار به­طور معنی­داری کاهش یافته است.

 

جدول 3- مقادیر انسولین پلاسما در گروههای تیمار و شاهد در طول 12 هفته از مطالعه

 

 

 

 

نمودار1- همبستگی انسولین و هموسیستئین، که نشان دهندة ارتباط معنی­دار منفی می‌باشد.

 

بحث و نتیجه‌گیری

Jacob      و همکاران در سال 1998 با مطالعه­ای که بر روی موش­های مبتلا به دیابت نوع I ناشی از استرپتوزوتوسین داشتند به این نتیجه رسیدند که غلظت هموسیستئین پلاسما در
موش­های دیابتیک ارتباط مستقیم با غلظت انسولین پلاسما دارد به­طوری­که که در موش­های مبتلا به دیابت نوع I که انسولین تزریق نشده بود مقدار هموسیستئین 40 درصد کمتر از گروه شاهد بود و در گروهی که به آنها انسولین تزریق شد، افزایش غلظت هموسیستئین پلاسما را داشتند.Jacob  علت کاهش هموسیستئین را (متعاقب کاهش انسولین) نقش مهم انسولین در متابولیسم هموسیستئین بیان کرد (8). در این مطالعه با وجود کاهش معنی­دار انسولین در طول 3 ماه از مطالعه، افزایش معنی­دار هموسیستئین پلاسما مشاهده گردید. بر اساس تحقیقاتی که Pavia  در سال 2000 در دیابت نوعI  انجام داد مشخص شد که با وجود کاهش انسولین و افزایش غلظت گلوکز، هیچ گونه تغییر معنی­داری در غلظت هموسیستئین پلاسما در گروه دیابتی و مقادیر مرجع وجود ندارد (14). در بررسی­های انجام شده توسط Robillon در سال 1994 وCotellessa  در سال 2001، کاهش معنی­دار مقادیر هموسیستئین پلاسما در مبتلایان به دیابت نوع I گزارش شد. Robillon علت کاهش هموسیستئین پلاسما را تأثیر مستقیم انسولین در چرخه متیونین در نظر گرفت به این معنی­که انسولین می­تواند باعث تغییر فعالیت مسیر ترانس­سولفوراسیون و دی متیلاسیون در چرخه متیونین شود. با کاهش انسولین پلاسما در دیابت نوع I، مسیر ترانس­سولفوراسیون فعال شده و هموسیستئین به ترکیبات واسط غیر هموسیستئینی تبدیل گشته و بدین ترتیب از مقدار هموسیستئین خون کاسته می­شود (5 و 15) که با نتایج حاصل از این تحقیق همخوانی ندارد. با توجه به مطالب فوق، نتایج ضد و نقیضی در ارتباط با مقادیر هموسیستئین در دیابت نوع I  در موش صحرایی استنباط   می­شود. این در حالی ­است ­که در رابطه با تغییرات هموسیستئین در خرگوش­های دیابتی تجربی نوع I، تحقیقی صورت نگرفته و یا مقاله­ای منتشر نشده است ولی آنچه که مسلم است، بر اساس نتایج به­دست آمده در این تحقیق و مقایسه آن با نتایج به­دست آمده در موش­های صحرایی دیابتی لازم به­ ذکر است که برخلاف موش صحرایی که متعاقب دیابت القائی نوع I (توسط استرپتوزوتوسین)، کاهش و یا عدم تغییرِ غلظتِ هموسیستئین وجود دارد، در این مطالعه، با وجود کاهش انسولین، افزایش معنی­دار هموسیستئین (به­عنوانِ ریسک فاکتور مستقل در بیماری­های قلبی-عروقی) مشاهده گردید.  در رابطه با تغییرات گلوکز لازم به­ذکر است که مقادیر گلوکز در گروه آزمایش از روز دوم سیر صعودی داشته و این افزایش تدریجی تا آخر 12 هفته ادامه یافته است ولی در مطالعه Mir و همکاران در سال 2008 بر روی دیابت ملیتوس نوع I در خرگوش، 1) پس از افزایش در روز دوم، از آن روز به بعد تا پایان روز 15 با سیر کاهشی گلوکز در گروه آزمایش مواجه هستیم که این وضعیت با مطالعه حاضر همخوانی ندارد (2) افزایش گلوکز در روز دوم در مطالعه Mir و همکاران تقریباً 2 برابر بیشتر از مقدار گلوکز در همان روز در مطالعه حاضر است که این حالت احتمالاً ناشی از تنوع در حساسیت به داروی استرپتوزوتوسین بر اساس گونه، سویه، وزن حیوان، شرایط تغذیه­ای، شرایط محیطی و جنس می­باشد. تغییرات انسولین از روز دوم تا پایان هفته 11 با سیر کاهشی مواجه بوده ولی در پایان هفته 12 با افزایش مواجه شده است که علت این امر احتمالاً ناشی از تجدید سلول­های بتا باشد. در رابطه با تغییرات وزن لازم به ذکر است که در مطالعه حاضر به طور میانگین با افزایش وزن خرگوش­های گروه آزمایش در طول دوره مطالعه مواجه شدیم که این وضعیت با مطالعه Mir و همکاران همخوانی ندارد (3).   

مراجع

1. ملک نیا، ن. و شهبازی، پ. (1375): بیوشیمی عمومی، چاپ دوازدهم، انتشارات دانشگاه تهران، صفحه: 171.
2. محمد نژاد، ا. و پاسالار، پ. (1386): بیوشیمی مصور هارپر، (ترجمه)، تألیف: موری، آر. ویرایش بیست و هفتم، تهران، انتشارات اندیشه رفیع، صفحه: 256.
3. Abdul Baqui, R.C. and Bhagat, M.M. (2008): Biochemical and Histomorphological Study of Streptozotocin- induced Diabetes Mellitus in Rabbits. Pakistan Journal of Nutrition, 7: 359-364.
4. Bolander, C.  (2003):  Homocysteine Review. Journal of European Pharmacology, pp:1-4.
5. Cotellessa,  M.,  Minniti,  M.S.,  Cerone,  R.,  Prigione,  F.,  Calevo,  M.S. and  Lorini,  R.  (2001): Low total plasma homocysteine concentration in patients with type 1 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Care, 9:459.
6. Ganda, O.P., Rossi, A.A. and Like, A.A. (1976): Studies of streptozotocin diabetes. Journal of diabetes, 25:595-603.
7. Haskell, C.M. (2001): Cancer Treatment. 7^th ed., Saunders, London, pp: 99-198.
8. Jacobs, R.L., House, J.D., Brosnan, M.E. and Brosnan, J.T. (1998): Effects of streptozotocin-induced diabetes and insulin treatment on homocysteine metabolism in the rat diabetes. Journal of Diabetes, 47: 1967-1970.
9. Laviola, L., Belsanti, G., Davalli, A., Napoli, R., Perrini, S. and Weir, G.C., et al. (2001): Effects of streptozotocin diabetes and diabetes treatment by islets transplantation on in- vivo insulin signalling in rat heart. Journal of Diabetes, 50: 2709-2720.
10. Mc Cully, K.S. (1969): Vascular pathology of homocysteinemia: implication for the pathogenesis of arteriosclerosis. American Journal of Pathology, 56: 111-28
11. Miller, A.L., Gregory N.D. and Kelly, S. (1997):  Homocysteine metabolism: Nutritional modulation and impact on health and disease. Alternative Medicine Review, 2: 234-254.
12. Nehler, M.R., Talor, L.M. and Porter, J.M. (1997):  Homocysteine as a risk factor for atherosclerosis: a review. Journal of Cardiovascular Surgery, 5: 559-567.
13. Nukatsuka, M., Yoshimura, Y., Nishida, M. and Kawada, J. (1988): Enhancment by Streptozotocin of Anion superoxide radical generation by the xanthine oxidase system of pancreatic beta-cells. FEBS Lett., 239: 295-298. 
14. Pavia, C., Ferrer, I., Valls, C., Artuch, R., Colome, C. and Vilaseca, M.A. (2000): Total homocysteine in patients with type 1 Diabetes. Journal of Diabetes Care, 23: 84-87.
15. Robillon, J.F., Canivet, B. and Candito, M. (1994): Type 1 diabetes mellitus and homocysteine. Diabetes Metabolism, 20: 494-496.
16. Wijekoon, E.P., Brosnan, M.E. and Brosnan, J.T. (2007): Homocysteine metabolism in diabetes. Journal of Metabolism, 1175-1179.