مطالعه ایمنوهیستوشیمی بتا-کاتنین در کارسینوم تجربی کولون موش صحرائی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 2، دوره 3، 2 (10) تابستان، شهریور 1388، صفحه 451-458   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

یوسف دوستار^{* 1}؛ داریوش مهاجری¹؛ فاطمه فتحی آذر²؛ علی ناموران³

¹گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران

²دانشکده داروسازی، دانشکاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران

³دانش‌آموخته دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران

چکیده

آدنوکارسینوم کولون و رکتوم یکی از معمول‌ترین و درمان‌پذیر‌ترین موارد بدخیمی‌های دستگاه گوارش می‌باشند. تحقیقات اخیر در مورد سرطان‌های کولون و رکتوم نشانگر موتاسیون ژن بتا-کاتنین و تجمع درون هسته‌ای آن در سلول‌های هیپرپلاستیک می‌باشد. بنابراین، احتمالاً پروتئین بتا-کاتنین می­تواند به عنوان یک شاخص پیشگوئی و تشخیصی مهم در این بیماری مطرح باشد. هدف از این مطالعه، ارزیابی بیان پروتئین بتا-کاتنین هسته‌ای در سلول‌های هیپرپلاستیک کولون متعاقب تیمار با 1و2 دی­متیل هیدرازین می‌باشد. در این مطالعه 56 سر موش صحرائی نر نژاد ویستار با سن 12 هفته و وزن 300-200 گرم انتخاب و به­طور تصادفی در دو گروه مساوی تیمار و شاهد تقسیم گردیدند. در گروه تیمار جهت القاء کارسینوم کولون از 1و2 دی­متیل هیدرازین به میزان 40 میلی‌گرم برای هر کیلوگرم وزن بدن به مدت 4 هفته و هر هفته دو تزریق به روش زیر جلدی استفاده گردید. به گروه شاهد مشابه گروه تیمار سالین نرمال تزریق گردید. پس از گذشت 8 هفته از بافت کولون دیستال هر دو گروه جهت تهیه مقاطع ریزبینی و انجام ایمنوهیستوشیمی نمونه­برداری به عمل آمد. ایمنوهیستوشیمی نمونه­ها نشان داد که میزان پدیداری پروتئین بتا-کاتنین هسته‌ای در گروه تیمار به  طور معنی­داری بیشتر از گروه شاهد می­باشد (01/0>p). مطالعه حاضر نشان می­دهد که بیان بتا-کاتنین هسته‌ای در موارد هیپرپلازی و نئوپلازی کولون می­تواند افزایش یابد.

کلیدواژه‌ها

کولون؛ کارسینوم؛ بتا-کاتنین؛ ایمنوهیستوشیمی

اصل مقاله

مقدمه

 

     سرطان روده بزرگ دومین دلیل مرگ و میر ناشی از سرطان در دنیا است. طبق آمار ارائه شده، سالانه این سرطان مسئول مرگ 19000 نفر در انگلستان، 85000 نفر در اروپا و 61000 نفر در ایالات متحده است (1، 2، 3، 4 و 24). در ایران آمار قابل استنادی برای میزان وقوع سرطان وجود ندارد ولی براساس آن­چه از منابع برمی‌آید بیشترین درصد سرطان مربوط به دستگاه گوارش و به خصوص روده بزرگ است و درصد بالایی از بدخیمی‌ها و مرگ و میر را در ایران شامل می­شود. میزان بالای چربی و پروتئین جیره باعث افزایش وقوع سرطان روده بزرگ می­شود (2 و 8)، این درحالی است که به نظر
می­رسد تغذیه با چربی پایین، فیبر بالا، کلسیم بالا و مصرف مقدار زیاد سبزیجات در غذای روزانه باعث کم شدن میزان بروز سرطان روده بزرگ می‌شود. مطالعات آزمایشگاهی حاکی از ارتباط بین فاکتورهای تغذیه و سرطان روده بزرگ دارد (14، 15 و 16). با این وجود مکانیسم حمایتی اجزای اشاره شده هنوز به درستی مشخص نشده است. به­نظر می‌رسد تجمع سلول­های دارای جهش در روده بزرگ و رکتوم باعث ایجاد تومور و بدخیمی می­شود (9). سرطان روده بزرگ یکی از
مهم­ترین عوامل مرگ و میر در مردان و زنان در شهرهای صنعتی است (2 و 12). بتا-کاتنین یک مولکول مرکزی یا اصلی در مسیر پیام­رسانی داخل سلولی است که پیشتر به عنوان عامل دخیل در سرطان­زایی یا تومورزایی انواع سرطان­های دستگاه گوارشی از جمله سرطان معده و کولون شناخته شده بود. مطالعات پیشین درباره سرطان کولون، ارتباط بین پیدایش
بتا-کاتنین هسته‌ای، وخامت بیماری و بقاء ضعیف­تر بیماران مبتلا به سرطان کولون را نشان داده است. براساس پژوهش‌های انجام شده، نقش بتا- کاتنین در سرطان کولون و رکتوم را به تنهایی نمی­توان از طریق مسیر پیام­رسان wnt تشریح کرد. این پروتئین می‌تواند یک نقش آلترناتیو داشته باشد که با تمایز سلول­های سرطانی و پیش­بینی بهتر برای بیماری در ارتباط است. بایستی خاطر نشان نمود که بر اساس نتایج مطالعه Wanitsuwan و همکاران وی در سال 2008، پدیداری بیش از حد بتا- کاتنین به­صورت تجمع هسته‌ای آن در پیشگوئی نتایج سرطان­های کولورکتال بسیار حائز اهمیت می‌باشد (22)، با توجه به این­که بروز و تجمع شکل هسته‌ای این پروتئین می‌تواند یک شاخص تشخیصی خوبی برای موارد کارسینوم کولون باشد. هدف از انجام این مطالعه، بررسی میزان پدیداری پروتئین بتا-کاتنین به روش ایمونوهیستوشیمی در کارسینوم تجربی کولون موش صحرائی می‌باشد.

مواد و روش‌کار

    موش­های صحرایی نر نژاد ویستار از دانشگاه علوم پزشکی دانشگاه تبریز خریداری و در شرایط 5 حیوان در هر قفس و نیز با سیکل 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و درجه حرارت 2±22 سانتی­گراد و رطوبت 10%±55 نگه­داری شدند.

 

طراحی آزمایش:

    در این مطالعه تعداد 56 سر موش صحرائی نر نژاد ویستار با سن 12 هفته و وزن 300-200 گرم انتخاب و به طور تصادفی در دو گروه مساوی تیمار و شاهد تقسیم گردیدند. در گروه تیمار جهت القاء کارسینوم کولون از 1و2 دی متیل هیدرازین به میزان 40 میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن به­مدت 4 هفته و هر هفته دو تزریق به روش تزریق زیرجلدی استفاده گردید. در گروه شاهد مشابه گروه تیمار سالین نرمال تجویز گردید. پس از گذشت 4 هفته از بافت کولون دیستال هر دو گروه جهت تهیه مقاطع 3 میکرونی و انجام ایمنوهیستوشیمی نمونه برداری به­عمل آمد.

روش القای کارسینوم تجربی کولون در موش صحرائی:

    جهت ایجاد تجربی سرطان روده بزرگ در جوندگان از ماده  1,2-dimethylhydrazine (DMH)استفاده می‌شود که قابلیت سرطان‌زائی در روده بزرگ و کوچک را داشته و با القای کریپت­های نابجا در روده و متعاقب آن ایجاد تومور همراه است و روش استاندارد مطالعه تجربی سرطان روده بزرگ است (8، 9 و 17).

جهت ارزیابی اثرات DMH کریپت­های نابجای ایجاد شده
(Aberrant Crypt Foci ACF) مورد بررسی قرار می­گیرد. کریپت­های نابجا در روده از عوامل مستعد کننده روده برای ایجاد آدنوم و آدنوکارسینوم بوده و از طریق بررسی آنها
می­توان در شناسایی زود هنگام سرطان کمک گرفت. برای القاء کارسینوم کولون، ماده شیمیائی 1و2 دی متیل هیدرازین با دز 40 میلی­گرم برای هر کیلوگرم وزن بدن و محلول در EDTA به روش زیر جلدی تزریق ‌گردید. تزریق هر هفته دو بار تزریق با فاصله مساوی و به­مدت 8 هفته انجام شد (6، 14 و 19).

روش انجام ایمنوهیستوشیمی:

 1- تهیه بلوک پارافینی 2- برش به ضخامت 3 میکرون و قرار دادن مقاطع بر روی لام سایلین 3- پارافین زدائی 4- قرار دادن مقاطع در مایکروویو 5- قرار گرفتن مقاطع در دمای اتاق ­
به­مدت 15 دقیقه 6- شستشوی بافت­ها در آب جاری 7- شستشو در بافر TBS 8- پوشاندن لام­ها با آب اکسیژنه 9- شستشو با بافر TBS 10- پوشاندن لام­ها با منوکلونال­آنتی­بادی بتا-کاتنین موش به همراه آنتی سرم آنتی­بتا-کاتنین خرگوش (ساخت کمپانی DAKO) 11- قرار دادن مقاطع در دمای اتاق به­مدت 30 دقیقه 12- شستو با بافر TBS 13- پوشاندن سطح لام­ها با پلیمر نشان­دار شده با پراکسیداز 14- شستشو با بافر TBS 15- پوشاندن سطح لام­ها با کروموژن+سوبسترا 16- شستشو با بافر TBS 17- رنگ آمیزی هماتوکسیلین و مونته کردن (20،18 و 22).

روش نمونه‌برداری و آنالیز آماری داده‌ها:

آنالیز آماری در مطالعه حاضر با آزمون t (t-Test) مستقل به انجام رسید. بر اساس جدول کوهن و ضریب اثر 5/0، توان آزمون ( beta -1) 90 درصد و05/0=α حداقل حجم نمونه 28 مورد انتخاب گردید. برای بیان کمی تغییرات کیفی حاصله، از روش رتبه‌بندی تراکم پروتئین بتا-کاتنین مطابق جدول 1 استفاده گردید.

جدول 1- روش رتبه‌بندی تراکم پروتئین بتا-کاتنین

	میزان بسیار کم حضور پروتئین- بتا-کاتنین	میزان کم حضور پروتئین- بتا-کاتنین	میزان متوسط حضور پروتئین -بتا-کاتنین	میزان زیاد حضور پروتئین- بتا-کاتنین
میزان حضور پروتئین بتا- کاتنین	0	1	2	3

 

نتایج

     مطالعات ریزبینی بافت اپی‌تلیوم کولون موش صحرائی گروه تیمار نشانگر اپی‌تلیوم هیپرپلاستیک و مناطق ACF (Aberrant crypt foci) (نگاره­های 1 و 2) به همراه ارتشاح سلول‌های تک‌‌­هسته‌ای بود. در مطالعات ایمونوهیستوشیمی، میزان پروتئین بتا-کاتنین در مقاطع بافتی کولون موش‌های صحرائی گروه تیمار پس از دریافت 8 هفته‌ای 1و2 دی متیل هیدرازین نسبت به گروه شاهد تغییرات معنی­داری را نشان داد، به طوری که تراکم بتا-کاتنین در مخاط کولون گروه شاهد بسیار ملایم بود (نگاره­های 3 و 4).

 

 

نگاره1- نمای ریزبینی از بافت اپی‌تلیوم کولون موش صحرائی گروه تیمار که در آن مقاطع متعدد کریپت‌های هیپرپلاستیک (Aberrant crypt foci) (پیکان­‌های 1) به همراه ارتشاح سلول‌های تک‌‌­هسته‌ای (پیکان­‌های 2) قابل مشاهده می‌باشد (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمائی40×).

 

 

نگاره2- نمای ریزبینی از بافت اپی‌تلیوم کولون موش صحرائی گروه تیمار که در آن مقاطع کریپت‌های هیپرپلاستیک (Aberrant crypt foci) (پیکان 1) با رشد هیپرپلاستیک سلولی (پیکان 2) به همراه ارتشاح سلول‌های تک‌‌­هسته‌ای (پیکان 3) در پیرامون آن‌ها کریپت‌ها قابل رویت می‌باشد (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمائی400×).

 

 

 

نگاره3- نمای ریزبینی از بافت اپی‌تلیوم کولون موش صحرائی گروه تیمار که در آن پروتئین بتا-کاتنین در مخاط کولون به رنگ قهوه‌ای روشن
(پیکان 1) و پرولیفراسیون سلول‌های اپی‌تلیالی (پیکان 2) قابل رویت می‌باشد. (ایمنو‌هیستوشیمی پروتئین بتا-کاتنین، بزرگنمائی400×). پدیداری بتا- کاتنین به­وسیله آنتی بادی مونوکلونال آنتی بتا-کاتنین موش و آنتی سرم آنتی بتا-کاتنین خرگوش.

 

 

 

نگاره4- نمای ریزبینی از بافت اپی‌تلیوم کولون موش صحرائی گروه شاهد که در آن پروتئین بتا-کاتنین در مخاط کولون به رنگ قهوه‌ای روشن
 (پیکان­های 1 و 2) قابل رویت می‌باشد. (ایمنو‌هیستوشیمی پروتئین بتا-کاتنین، بزرگنمائی400×). ایمنو‌هیستوشیمی پروتئین بتا-کاتنین. پدیداری بتا- کاتنین به­وسیله آنتی بادی مونوکلونال آنتی بتاکاتنین موش و آنتی سرم آنتی بتا-کاتنین خرگوش.

 

 

تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها:

 داده‌های حاصل در هر دو گروه تیمار و شاهد، توسط نرم افزار spss ویرایش 13 و آزمون t-Test  مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اختلاف میانگین تغییرات پروتئین بتا-کاتنین بین گروه‌های تیمار و شاهد معنی‌دار(p<0.01) بود که در جدول 2 آورده شده است.

 

جدول2- میانگین تغییرات پروتئین بتا- کاتنین در بافت کولون موش‌های گروه تیمار و شاهد.

متغیر‌های وابسته	خطای استاندارد	انحراف از معیار	میانگین
بتا-کاتنین گروه شاهد	1204/0	6372/0	9643/0
بتا-کاتنین گروه تیمار	1460/0	7724/0	321/2*

p<0.01:* در مقایسه با گروه شاهد

 

بحث و نتیجه‌گیری

     بتا-کاتنین یک مولکول مرکزی یا اصلی در مسیر پیام­رسانی داخل سلولی پیشتر به عنوان عامل دخیل در سرطان­زایی یا تومورزایی انواع سرطان­های دستگاه گوارشی از جمله سرطان معده و کولون شناخته شده بود. مطالعات پیشین درباره سرطان کولون، ارتباط و توافق مابین پیدایش بتا-کاتنین هسته‌ای، وخامت بیماری و بقاء ضعیف­تر را نشان داده است (21). براساس نتایج Wanitsuwan و همکاران وی در سال 2008، پدیداری بیش از حد بتا-کاتنین به­صورت تجمع هسته‌ای آن در پیشگوئی نتایج سرطان­های کولورکتال بسیار حائز اهمیت می‌باشد (22).

Yasuhiro و Hideki در سال 2003 بیان نمودند که آنزیم گلیکوژن سنتتاز کیناز 3 با پروتئین آدنوماتوز پلی‌‌پوزیس کولی و پروتئین آگزین باعث فسفوریلاسیون بخش N-ترمینال (سرین/ترئونین) پروتئین بتا-کاتنین گردیده و پس از تداخل پروتئین F-box دگرداسیون پروتوزومی صورت گرفته و پروتئین بتا-کاتنین در هسته سلول رها و با فاکتور سلول‌های تی یا TCF باند می‌شود (23). هرگونه موتاسیون در ژن‌های مسیر فوق می‌تواند باعث تجمع غیرطبیعی این پروتئین در هسته‌ سلول‌ گردد که در موارد تغییرات دیسپلاستیک اپی‌تلیوم کولون تجمع پروتئین بتا-کاتنین در کانون‌ کریپیت‌های نابجا (نگاره­های 1 و 2) وجود دارد که به­نام (BCAC)
 Beta-catenin-accumulated crypt خوانده می‌شود.

 Brabetz و همکاران در سال 2000 به پدیداری بیش از اندازه این پروتئین در هسته و ارتباط آن با اندازه نئوپلاسم‌ها اشاره نمودند (3). Hideki و Yasuhiro در سال 2003 در مورد تراکم بتا-کاتنین در اپی‌تلیوم دیسپلاستیک کولون با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد (23).

تحقیقات نشان داده است که ژنAPC  یا Adenomatous Polyposis Coli به­عنوان یک ژن ساپرس کننده رشد تومور می‌باشد که نه تنها در اکثریت موارد کارسینوم کولون موتاسیون آن معلوم شده است، بلکه در سایر موارد سرطانی نظیر کارسینوم کبد نیز موتاسیون آن تشخیص داده شده است. محصول ژن APC، پروتئینی است به وزن 312 کیلو دالتون که دارای دومن‌های متعددی است که از آن طریق با سایر پروتئین‌ها شامل پروتئین بتا-کاتنین، آکسین، CTBC، Asefs، IQGAP1 و میکروتوبول‌ باند می‌باشد. نقش دیگری که برای APC بیان شده  اتصال و مهاجرت سلولی، سازماندهی آکتین و شبکه میکروتوبولی سلول‌ها است (1، 7 و 16).

Carmen و همکاران وی در سال 2001 و Nelson در سال 1997 اثرات القائی 1و2 دی­متیل هیدرازین در کارسینوم کولون و پدیداری پروتئین بتا-کاتنین هسته‌ای را تفسیر نمودند (6 و 24). طبق نظر ایشان 1و2 دی‌متیل هیدرازین از طریق ایجاد موتاسیون در ژن مولد پروتئین بتا-کاتنین باعث القا کارسینوم کولون در روده موش صحرائی می‌گردد. آنها بر این باور بودند که کارسینوم کولون عمدتاً در اثر موتاسیون ژنی ایجاد می‌گردد، مخصوصاً ژن‌هایی که در ترمیم و رپلیکاسیون DNA موثر می‌باشند. از بین این ژن‌ها می‌توان ژن APC یا آدنوماتوز پلی‌پوزیس کولی را نام برد که 85-80 درصد موارد کارسینوم کولون مربوط به موتاسیون ژن فوق می‌باشد که در مطالعه حاضر احتمالاً موتاسیون ژن فوق در اثر 1و2 دی­متیل هیدرازین روی داده است. با وجود این، مطالعات نشان داده است موتاسیون ژن آدنوماتوز پلی‌پوزیس کولی و ژن پروتئین بتا-کاتنین یا CTNNB1 از دلایل اصلی و موثر در بروز کارسینوم کولون می‌باشد. محصول ژن CTNNB1 پروتئین بتا-کاتنین می‌باشد که یک پروتئین اتصالی کادهرینی بوده و در اتصال بین سلولی نقش دارد. اما نقش دیگری که برای این پروتئین در نظر گرفته می­شود، فعال کننده ترانس­کریپتاسیون سلولی بوده و آن اغلب زمانی است که این پروتئین در هسته سلول با خانواده TCF/LEF یا فاکتور سلول‌های لنفوسیتی تی/فاکتور مشوق لنفوئیدی تشکیل کمپلکس می‌دهد. میزان بتا-کاتنین در سیتوزول سلول از طریق آبشار مسیر سیگنال­های ترانسدوکسیون Wnt در مجموعه یا کمپلکس پروتئینی شامل APC، Axin و GSK-3β یا سرین گلیکوژن کیناز سنتتاز تری­بتا افزایش می­یابد. در موتاسیون ژن CTNNB1 بخش مهمی از آنزیم  GSK-3βسرین/ترئونین تغییرات پیدا کرده که محل استقرار پروتئین بتا-کاتنین می‌باشد که نتیجه آن تجمع کمپلکس پروتئین بتا-کاتنین+TCF/LEF در هسته سلول­های دیسپلاستیک می‌‌باشد. در مطالعه حاضر نیز در گروه تیمار با 1و2 دی متیل هیدرازین، میزان پدیداری پروتئین بتا-کاتنین نسبت به گروه شاهد به طور معنی­داری بیشتر می­باشد (6). بنابراین، پدیداری پروتئین بتا-کاتنین هسته‌ای در سلول‌های سرطانی کولون می­تواند به عنوان یک شاخص تشخیصی خوب مطرح باشد (5، 6، 10، 11 و 17).

Korinek و همکارانش تجمع بتا-کاتنین و  Tcf-4را که در بافت اپیتلیالی کولون پدیدار می­شود تشریح و نشان دادند که hTcf-4 در هسته سلول­های سرطانی کولون با بتا–کاتنین ارتباط پایدار و ثابت برقرار و اساساً فعال می‌باشد. با وجود این، پروتئین APC باعث انفصال بتا–کاتنین از hTcf-4 و در نتیجه منجر به توقف فعالیت رونویسی آن می‌شود. از آنجایی که تصور بر این بود که غیر فعال شدن ژن APC به عنوان ژنی که مهار کننده تومورهاست منجر به نئوپلازی در ناحیه کولورکتال می­شود، از یافته‌های Korinek و همکارانش در سال 2005 چنین برمی­آید که بتا-کاتنین در رشد نئوپلاستیک کولون دخیل می‌باشد که در مطالعه حاضر نیز میزان تراکم آن در گروه تیمار بیشتر بوده و نشانگر تجمع زیاد این پروتئین  در سلول‌ها‌ی دیسپلاستیک اپی‌تلیوم کولون می‌باشد که با نتایج آنها هم­خوانی دارد (13، 20 و 21). Sparks و همکارانش در سال 1998 گزارش کردند که شاید دو مسیر برای غیر فعال شدن اثرات مهاری و بازدارندگی APC وجود داشته باشد که این امر می­تواند با ایجاد جهش ژنی در خود پروتئین APC و یا ایجاد جهش در بتا-کاتینن اتفاق افتد. معلوم شده است که سلول­های توموری کولورکتال جهش‌هایی دارند که منجر به تغییرات و جابجایی‌های اساسی در مواضع فسفریلاسیون بتا-کاتنین
می­شود. این یافته‌ها حاکی از آن است که APC ، بتا– کاتینن و Tcf-4 در ایجاد تومورهای کولورکتال دخیل هستند و هرچه تغییرات دیسپلاستیک در روند رشد سرطانی اپی‌تلیوم کولون کمتر باشد، به همان نسبت بیان پروتئین بتا-کاتنین کم و منظم‌تر می‌باشد، در حالی که در موارد تغییرات دیسپلاستیک تراکم آن قابل توجه می‌باشد (4، 9، 13 و 17). با مطالعه‌ای که Brembeck و Rosario در سال 2006 انجام دادند، بیان نمودند که پروتئین بتا-کاتنین یک پروتئین چند منظوره 88 کیلودالتونی است که نه­تنها به همراه پروتئین کادهرین در اتصال بین سلولی نقش دارد، بلکه در موارد کارسینوم کولون به عنوان یک شاخص تشخیصی و پیشرفت رشد تومور می­تواند اهمیت داشته باشد (4). در مطالعه حاضر که به روش استفاده از آنتی بتاکاتنین (ایمنوهیستوشیمیM3539) میزان تراکم این پروتئین سنجیده شد، اختلاف میانگین بروز این پروتئین در گروه تیمار نسبت به گروه شاهد معنی­دار و نشانگر اثر القائی 1و2 دی متیل هیدرازین در کارسینوم کولون و پدیداری پروتئین بتا-کاتنین بود (نگاره­های 3 و 4). بنابراین باتوجه به نتایج مطالعه حاضر می‌توان اظهار داشت که پدیداری بتا-کاتنین هسته‌ای می‌تواند در کارسینوم کولون افزایش یابد. شاید لازم است مطالعاتی تکمیلی با فرضیات دقیق و بیان متغیر‌های موثر کمی و کیفی انجام پذیرد تا راهگشای سایر فعالیت‌های پژوهشی باشد.

مراجع

1. Aoki, K. and Taketo, M. (2007): Adenomatous polyposis coli (APC): a multi-functional tumor suppressor gene J. Cell Sci., 120: 3327-3335.
2. Bird, R.P. (1995): Role of aberrant crypt foci in understanding the pathogenesis of colon cancer. Cancer Letters, 93: 55-71.
3. Brabetz, T., Jung, H., Faller, G. and Kichner, T. (2000): Expression of nuclear β-catenin and c-myc is correlated with tumor size but not with proliferative activity colorectal adenoma. Am. J. Pathol., 156: 865-870.
4. Brembeck, F.H. and Rosario, M. (2006): Birchmeier W. Balancing cell adhesion and wnt signaling, the key role of β-catenin. Curr. Opin. Gen. Dev., 16: 51-59.
5. Chithra, V. and Leelamma, S. )2000(: Coriandrum sati6um — effect on lipid metabolism in 1, 2-dimethyl hydrazine induced colon cancer. Journal of Ethnopharmacology, 71: 457-463.
6. Carmen, A., Meirong, Xu., Gayle, A. and Roderick, H. (2001(: Dashwood. ß-Catenin mutation in rat colon tumors initiated by 1, 2-dimethylhydrazine and 2-amino-methylimidazo [4, 5-f] quinoline, and the effect of post-initiation treatment with chlorophyllin and indole-3-carbinol carcinogenesis. food and chemical toxicology, 2: 315-320.
7. Dias, M.C., Spinardi-Barbian, A.L.T., Rodrigues, M.A.M., Camargo, J.L.V., Teran, E. and Barbisan, L.F. )2006(: Lack of chamopreventive effect of ginger on colon carcinogenesis induced by 1, 2-dimethylhydrazine in rats.food and chemical toxicology, 44: 877-884.
8. Fearon, E.R. and Vogelstein, B. (1990): A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 61: 759-767.
9. Goss, K.H. and Groden, J. (2000): Biology of the adenomatous polyposis coli tumor suppressor. J. Clin. Oncol., 18: 1967-1979.
10. Hecht, A. and Kemler, R. (2000): Curbing the nuclear activities of ß-catenin: control over Wnt target gene expression. EMBO Rep., 1: 24-28.
11. Honmat, M. and Suzuki, Y. (2000): Nuclear translocation of beta-catenin in colorectal cancer. British Journal of Cancer, 82: 1689-1693.
12. Kamaleeswari, M., Deeptha, K., Sengottuvelan, M. and Nalini, N. (2006): Effect of dietary caraway (Carum carvi L.) on aberrant crypt foci development, fecal steroids, and intestinal alkaline phosphatase activities in 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology, 214: 290-296.
13. Korinek, V., Barker, N., Morin, P.J., Van Wichen, D., De Weger, R., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Clevers, H. (2005): Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma. Science, 21: 1784-1787.
14. Manju, V. and Nalini, N. (2005): Chemopreventive efficacy of ginger, a naturally occurring anticarcinogen during the initiation, post-initiation stages of 1,2 dimethylhydrazine-induced colon cancer. Clinica Chimica Acta., 358: 60-67.
15. Rodrigues, M.A.M., Silva, L.A.G., Salvadori, D.M.F., Camargo, J.L.V. and Montenegro, M.R. (2002): Aberrant crypt foci and colon cancer: comparison between a short and medium term bioassay for colon medium-term bioassay for colon carcinogenesis using dimethylhydrazine in Wistar rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 35: 351-355.
16. Roberts, J.D., Berndt, S., Marine, J. and Anastas, N. (2008): New regulators of Wnt/ {beta}-catenin signaling revealed by integrative molecular screening. Science Signaling, 1: 12-18.
17. Shibata, H.H., Takano, H. and Ito, M. (2007): β-Catenin is essential in intestinal adenoma formation. PNAS, 104: 18199-18204.
18. Sparks, A.B., Morin, P.J., Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (1998): Mutational analysis of the APC/ß-Catenin/Tcf pathway in colorectal cancer. Cancer Res., 58: 1130-1134.
19. Thurnherr, N., Deschner, E.E., Stonehill, E.H. and Lipkin, M. (1973): Induction of adenocarcinomas in the colon in mice by weekly injection of 1,2-dimethylhydrazine. Cancer Research, 33: 940-945.
20. Oyama, T., Yamada, K. and Hata, K. (2008): Further upregulation of beta-catenin/Tcf transcription is involved in the development of macroscopic tumors in the colon of ApcMin/+ mice. Carcinogenesis, 29: 666-672.
21. Polakis, P. (2000): Wnt signaling and cancer. Genes Dev., 14: 1837-1851.
22. Wanitsuwan, W., Kanngurn, S., Boonpipattanapong, T., Sangthong, R. and Sangkhathat, S. (2008): Overall expression of beta-catenin outperforms its nuclear accumulation in predicting outcomes of colorectal cancers. World J. Gastroenterol., 14(39): 6052-6059.
23. Yasuhiro, Y. and Hideki, M. (2003): Pre-cancerous lesions for colorectal cancer in rodent a new concept. Carcinogenesis, 24: 1015-1019.
24. Nelson, R.L. Dietary minerals and colorectal cancer. In: Rowland, I.R. (1991): Nutrition, Toxicity and Cancer. CRC Press, London, pp: 491-515.