تعیین ردیف نوکلئوتیدی و قرابت فیلوژنتیکی ژن Tax ویروس لوسمی گاو در ایران

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 5، دوره 3، 2 (10) تابستان، شهریور 1388، صفحه 477-483   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

حسن ممتاز^{* 1}؛ پوریا امینی²؛ بهنام عباسیان²

¹گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران

²دانش‌آموخته دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران

چکیده

ویروس لوسمی گاو (BLV) از خانواده رتروویریده،دون خانواده ارتورتروویرینه و جنس دلتارتروویروس واجد 3 ژن ساختمانی اصلی env، pol،gag و تعدادی ژن تنظیم­کننده همانند­سازی از جمله Tax، Rex، IIIR وC IV می­باشد. به منظور تعیین قرابت فیلوژنی ژن Tax ویروس BLV در
نمونه­های آلوده به این ویروس در ایران در ابتدا قطعه 927 جفت بازی ژن Tax از چهار نمونه آلوده در سیستم PCR تکثیر و جهت تعیین ردیف نوکلئوتیدی سکانس گردید. نتایج حاصل از مقایسه ردیف نوکلئوتیدی تعیین شده در این مطالعه با سکانس شناخته شده ژن Tax ویروس BLV در سایر کشورها نشانگر وجود 4/3 تا 7/7 درصد تنوع ژنتیکی در این ژن بود که در این میان بیشترین قرابت با ردیف نوکلئوتیدی ژن Tax در آمریکا )سکانس (AY700378.1 با 6/96 درصد تشابه و بیشترین تفاوت مربوط به جدایه این ویروس در استرالیا (سکانس AY700379.1) و ژاپن (سکانس AY700381.1) با 3/92 درصد قرابت مشاهده شد.

کلیدواژه‌ها

ویروس لوسمی گاو؛ ژن Tax؛ قرابت فیلوژنتیکی؛ ایران

اصل مقاله

مقدمه

 

     بیماری لوکوز انزئوتیک گاو در اثر ویروس لوسمی گاو (Bovine Leukemia Virus) از جنس دلتارترویروس (Deltaretrovirus)، دون خانواده ارتورتروویرینه (Orthoretrovirinae) و خانواده رتروویریده      (Retroviridae) ایجاد و به صورت رشد نئوپلاستیک لنفوسیت­ها که اغلب اعضای بدن را درگیر می­کند، اتفاق
می­افتد (1، 5 و 16).

ژنوم رتروویروس­ها دیپلوئید و هر قطعه هاپلوئیدی آن یک مولکول RNA تک رشته­ای مثبت با اندازه 7 تا 11 کیلو باز می­باشد. رتروویروس­های کامل واجد سه 3 ژن اصلی gag که اختصاصی گروه بوده و باعث کد­شدن پروتئین­های هسته مرکزی ویروس می­شود، pol (پلی مراز) که آنزیم­های دخیل در تکثیر ویروس یعنی آنزیم رونوشت­برداری معکوس را کد می­کند و (envelope) env که باعث کدکردن
گلیکوپروتئین­های غشاء ویروس می­شود و تعدادی ژن
تنظیم­کننده همانندسازی نظیر CVI، RIII، Rex و Tax هستند. این ویروس­ها قادر به ایجاد پروویروس از جنس DNA در سلول­های آلوده به خود می­باشند (2، 3 و 22). پروتئین  Tax دارای چندین اپی­توپ شناسایی برای
لنفوسیت­های T سیتوتوکسیک است و می­تواند پاسخ این سلول­ها را القا کند (21). به واسطه اهمیت این ژن در رتروویروس­ها، امروزه استفاده از ژن Tax در طراحی
واکسن­های DNA به­ویژه در عفونت­های انسانی نظیر بیماری ناشی از HTLV-1 مورد توجه قرار گرفته است و مشخص شده که واکسیناسیون علیه عفونت ناشی از HTLV-1 با استفاده از پروتئین نوترکیب Tax می­تواند پاسخ قوی از لنفوسیت­های T سیتوتوکسیک را تحریک کند (8 و 23). لوکوز گاوی امروزه به عنوان معضل سیستم گاوداری­های صنعتی در جهان مورد توجه بوده و هر کجای دنیا که سیستم­های گاوداری مدرن در پرورش گاوهای شیری وجود دارد، لوکوز گاوی به عنوان یک معضل اساسی مدنظر قرار گرفته است و امروزه تلاش­های فراوانی جهت دست­یابی به یک روش پیشگیری مناسب انجام شده یا در حال انجام است (16). در ایران تاکنون اقدامی در جهت پیشگیری از بیماری به روش واکسیناسیون و یا ساخت واکسن و طراحی روش­های تشخیص بیماری صورت نگرفته است. همت زاده و ممتاز در سال­های اخیر اقدام به شناسایی پروتئین­های ویروس BLV در بافت­های توموری شده توسط ویروس کرده و تنوع پروتئینی ویروس را مشخص نموده­اند. در ادامه پادگن­های دخیل در تحریک پاسخ ایمنی هومورال به روش وسترن بلات مشخص و پادگن­های p24 وgp51 در بافت­های مبتلا به لنفوسارکوم شناسایی و ژن­های gag و Tax ویروس در سلول E.coli کلون­سازی و بیان شده است (6، 7، 12 و 14). از آنجایی که تنوع ژنتیکی ژن  Taxویروس لوکوز گاوی در سویه­های ایران شناسایی نشده است، لذا مطالعه حاضر با هدف تعیین ردیف نوکلئوتیدی ژن Tax در نمونه­های ایران و مقایسه ردیف نوکلئوتیدی این ژن با سایر کشورها طرح­ریزی شده است.

مواد و روش‌کار

     1-نمونه­ها: DNA تخلیص شده از بافی­کوت و عقده لنفاوی تعدادی از گاوهای آلوده به لوکوز گاوی که در مطالعات قبلی از نظر سرمی و مولکولی پاسخ مثبت نشان داده بودند (4 و 12) به همراه نمونه ویروسBLV  رشد کرده در کشت سلولی (Fetal Lamb Kidney) FLK  (Svanova Biotech, Uppsala, Sweden)
به عنوان نمونه کنترل مثبت.

2-آزمایش PCR: جهت تکثیر ژن Tax ویروس BLV در DNA تخلیص­شده از نمونه‌های مورد مطالعه از زوج پرایمرهای نشان داده شده در جدول 1 که بر اساس سکانس ژن Tax ویروس ثبت شده در بانک ژنی طراحی شد استفاده ‌گردید:

 

 

جدول 1- پرایمرهای مورد استفاده جهت آنالیز ژن Tax ویروس BLV

 

Accession number	Size of Product (bp)	Primer sequence	Primer name
AY700378.1	927	5`-GCAAGTGTTGTTGGTTGGGG-3`	BLV-Tax-F
		5`- TCAAAAAAGGCGGGAGAGCC-3`	BLV-Tax-R

 

 

 

 

 

 

 

جهت انجام آزمایش  PCRو تکثیر قطعه ژنی  Tax از دستگاه Master cycler gradient
(Eppendorf Germany Co.) با حجم 50 میکرولیتر واجد 5 میکرولیتر PCR buffer 10x، 2 میلی­مول Mgcl2، 200 میکرومول dNTP، 2 میکرومول از زوج پرایمرهای BLV-Tax-F و BLV-Tax-R، 1 واحد آنزیم 1 واحدی
  Tag DNA Polymerase(Roche applied science) و 1 میکروگرم از  DNA هر نمونه استفاده شد. برنامه حرارتی مورد استفاده عبارت بود از:

یک سیکل 94 درجه 4 دقیقه، 33 سیکل تکراری 94 درجه 1 دقیقه، 58 درجه 1 دقیقه و 72 درجه 50 ثانیه و سیکل انتهایی 72 درجه 6 دقیقه (17).

3-تعیین ردیف نوکلئوتیدی: محصول PCR مربوط به 4 نمونه از نمونه‌های مثبت شده در آزمایش PCR جهت تعیین ردیف نوکلئوتیدی قطعة تکثیریافته در PCR به شرکت Macrogen  کره ارسال گردید.

4-تعیین قرابت نوکلئوتیدی: نمونه‌های سکانس شده در این مطالعه با سکانس ژن Tax ویروس BLV در سایر کشورها (ثبت شده در بانک ژنی NCBI) با استفاده از نرم افزار ClustalX و Njplot مقایسه و ضمن تعیین Sequence identity matrix، درخت فیلوژنی مربوطه رسم شد.

نتایج

     ردیف نوکلئوتیدی ژن Tax ویروسBLV مربوط به 4 نمونه از نمونه­های مثبت شده در آزمایش PCR سکانس و با استفاده از نرم افزار ClustalX با ردیف نوکلئوتیدی این ژن ثبت شده در بانک ژنی (National Center for Biotechnology Information NCBI ،Alignment) گردید و پس از مقایسه شباهت­ها و تفاوت­های ردیف نوکلئوتیدی با استفاده از نرم افزارNjplot  قرابت فیلوژنتیکی آنها ترسیم شد که درخت فیلوژنی حاصله در نگاره 1 و میزان قرابت بین ژن Tax ویروسBLV در ایران با سایر کشورها در جدول 2 نشان داده شده است

 

 

 

نگاره1- درخت فیلوژنتیکی مربوط به ردیف نوکلئوتیدی ژن Tax ویروسBLV در ایران با تعدادی از سکانس‌های ثبت شده این ژن در بانک ژنی

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول2- نتایج حاصل از مقایسه ردیف نوکلئوتیدی ژن Tax ویروسBLV در ایران با تعدادی از سکانس‌های ثبت شده این ژن در سایر کشورها
 (Sequence Identity Matrix)

Seq	AY700378.1 USA	AY700381.1 Japan	AY700380.1 Belgium	AY70035201 Costa Rica	AY70037901 Australia	Iran 1	Iran 2	Iran 3	Iran 4
AY700378.1 USA	ID	967/0	966/0	949/0	949/0	966/0	964/0	963/0	962/0
AY700381.1 Japan	967/0	ID	957/0	942/0	942/0	926/0	93/0	923/0	929/0
AY700380.1 Belgium	966/0	957/0	ID	954/0	95/0	951/0	95/0	949/0	952/0
AY700382.1 Costa Rica	949/0	942/0	954/0	ID	933/0	962/0	961/0	959/0	963/0
AY700379.1 Australia	949/0	942/0	95/0	933/0	ID	925/0	929/0	923/0	928/0
Iran-1	966/0	926/0	951/0	962/0	925/0	ID	981/0	979/0	982/0
Iran-2	964/0	93/0	95/0	961/0	929/0	981/0	ID	981/0	986/0
Iran-3	963/0	923/0	949/0	959/0	923/0	979/0	984/0	ID	985/0
Iran-4	962/0	929/0	952/0	963/0	928/0	982/0	986/0	985/0	ID

 

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

     تشخیص و مطالعه عفونت­های رتروویروسی از جهات مختلف می­تواند مورد توجه قرار گیرد. نتایج مطالعات زیادی که روی ویروس نقصان ایمنی انسان (HIV) انجام گرفته زمینه بسیار وسیعی را پیرامون مطالعه تنوع ژنتیکی، چگونگی تشخیص، مطالعات اپیدمیولوژیک و نهایتاً راهکارهای مناسب برای پیشگیری از عفونت­های رتروویروسی فراهم آورده است. در بین عفونت­های رتروویروسی دام­ها، لوکوزانزئوتیک گاوها در صدر اهمیت قرار دارد و از همین رو است که تحقیقات بسیار گسترده­ای در مورد روش­های تشخیص، کنترل و



پیشگیری از این بیماری با استفاده از روش­های سرولوژیک و مولکولار بیولوژیک انجام گرفته و می­گیرد.

به واسطه خصلت طبیعی رتروویروس­ها که ناشی از
رونوشت­برداری معکوس از ژنوم آنهاست وقوع موتاسیون و در نتیجه تنوع ژنوتیپی و فتوتیپی آنها از وفور بالایی برخوردار است و همین خصلت است که ارزش تشخیصی بسیاری از آزمون­های آزمایشگاهی را زیر سوال می­برد. مقالات زیادی را می­توان یافت که به اعداد و ارقام خاصی تحت عنوان حساسیت و ویژگی در تست­های تشخیصی اشاره نموده­اند. تکرار همین آزمون توسط محققین دیگر معمولاً با نتایج متفاوتی همراه بوده است که علت این مسئله را می­توان در تنوع ژنتیکی این ویروس جستجو نمود.

در بین ژن­های ساختمانی ویروس BLV ژن­هایgag ، pol و env ازجمله ژن­های نسبتاً حفاظت شده هستند که تنوع ژنی در بین آنها کمتر دیده شده و به واسطه همین خصلت طبیعی امروزه از روش­های تشخیص بیولوژی مولکولی بر پایه PCR، کلونینگ و... با استفاده از ردیابی پروویروس BLV و یا
ژن­های ساختمانی مذکور طراحی شده­اند. رتروویروس­های پیچیده علاوه بر این 3 ژن ساختمانی ژن­های تنظیم­کننده­ای نظیر  TaxوRexوRIII وCIV را نیز کد می­کنند که در همانندسازی ویروس دخالت داشته و همین امر پایداری و قدرت بیماری­زایی آ­نها را افزایش می­دهد (9، 21 و 23).

ژن Tax پروتئینی را کد می­کند که در همانندسازی ویروس ضروری بوده و باعث تورم غدد می­شود. از طرفی این ژن باعث تحریک همانندسازی از چند ژن سلولی از جمله ژن مولد 2-IL می­شود (11 و 15). Tax به­عنوان گیرنده برای
آنزیم­های آلفا و بتا پلی­مراز عمل می­کند (10 و 18) و مطالعات جدید نشان می­دهد که در سرطان­زایی رتروویروس­ها خصوصاً سرطان سلول­های خونی نقش دارد (21). پروتئین Tax دارای چندین اپی­توپ شناسایی برای لنفوسیت­های T سایتوتوکسیک است و می­تواند پاسخ این سلول­ها را القاء کند. به واسطه اهمیت این ژن در رتروویروس­ها امروزه استفاده از این ژن در طراحی واکسن­های DNA به ویژه در عفونت­های انسانی نظیر بیماری ناشی از HTLV-1 مورد توجه قرار گرفته است و مشخص شده که واکسیناسیون علیه عفونت ناشی از HTLV-1 با استفاده از پروتئین نوترکیب Tax می­تواند پاسخ قوی لنفوسیت­های T سایتوتوکسیک را تحریک کند (8، 19، 20 و 23).

مطالعه حاضر با هدف ردیابی ژن Tax ویروس BLV، تعیین ردیف نوکلئوتیدی این ژن و بررسی تنوع ژنتیکی آن انجام گرفت و همان­گونه که در قسمت نتایج ذکر شد یکی از اهداف اصلی این بررسی یعنی ردیابی ژن Tax در نمونه­های آلوده به BLV برای اولین بار در ایران به تحقق پیوست و وجود ژن مذکور با توسل به روش تعیین ردیف نوکلئوتیدی (Sequencing) قطعه مربوطه مورد تأیید قرار گرفت. تعیین ردیف نوکلئوتیدی قطعه 927 جفت بازی تکثیر یافته در PCR در تقریبا 900 نوکلئوتید از چهار نمونه سکانس­شده انجام گرفت. در قسمت دیگر این تحقیق به منظور تأیید ردیف نوکلئوتیدی ژن Tax و مقایسه تنوع ژنتیکی این ژن در
نمونه­های ایران با سایر ویروس­های موجود در دنیا اقدام به مقایسه ردیف نوکلئوتیدی تعیین شده این ژن در ایران با تعدادی از سکانس­های شناخته شده این ژن در بانک ژنی NCBI گردید. مقایسه ردیف­های ژنی حاکی از وجود 5/1 تا 1/2 درصد تنوع در چهار نمونه سکانس­شده در ایران و 4/3 تا 7/7 درصد تنوع بین نمونه­های ایران با سایر کشورها بود (جدول 1) که در این میان بیشترین قرابت مربوط به سکانس شناخته شده این ژن در آمریکا (سکانس 700378.1 AY) با 6/96 درصد قرابت و بیشترین تفاوت مربوط به جدایه این ویروس در استرالیا (سکانس AY 700379.1) و ژاپن (سکانس  AY 700381.1) با 3/92 درصد قرابت مشاهده شد. با استفاده از نرم افزار X  Clustal و Njplot درخت فیلوژنیک ردیف­های ژنی مقایسه شده ترسیم گردید و همان گونه که در نگاره (1) مشاهده می­شود، سویه­های ایران در شاخه سکانس آمریکا قرار دارد و تفاوت معنی­داری را با سکانس شناخته شده ژن Tax در استرالیا و ژاپن نشان می­دهد. در مطالعه انجام شده توسط ممتاز و همکاران که به منظور تعیین قرابت ژنتیکی ژن gag ویروس  BLVدر ایران انجام گرفت نیز 1 تا 7/8 درصد تنوع ژنتیکی در ژن gag ویروس مشاهده شد که در این میان بیشترین قرابت با سکانس­های شناخته شده این ژن در آمریکا (سکانس­های M 10987.1 وNC 001414.1) و بیشترین تفاوت مربوط به جدایه این ویروس در استرالیا (سکانس D 00647.1) مشاهده شد (13).

مشاهده تنوع نه­چندان چشمگیر ردیف ژنتیکی ژن Tax ویروس BLV را می­توان بر اساس گسترش جغرافیایی ویروس توجیه نمود. با توجه به اینکه منشاء بسیاری از گاوهای اصیل موجود در گاوداری­های ایران به کشورهای آمریکایی باز می­گردد، لذا شباهت ژنتیکی حاصله در این تحقیق نیز می­تواند موید این ادعا باشد. از طرفی، نقل و انتقال دام بین کشورهای شرق دور (ژاپن و استرالیا) با ایران سابقه تاریخی ندارد لذا استقرار سویه­های ژاپنی و استرالیایی ویروس در شاخه دیگر درخت فیلوژنی نشانگر تفاوت بیشتر ردیف ژنی Tax این ویروس بین ایران با کشورهای مزبور می­باشد.

مراجع

1. کارگرموخر، ر.، حسامی قاجار، م.، اهورایی، پ.، قابوسی، ب.، خدمتی، ک.، عزی، ع.، پورزاهدی، ر. و سرمست، ر. (1375):  بررسی سرواپیدمیولوژیک بیماری لوکوز انزئوتیک گاوان (EBL) در ایران. پژوهش و سازندگی، سال 9، جلد 1، صفحات: 167-164.
2. کیوانفر، ه‍. و کریمی، ن. (1376): ویروس­شناسی دامپزشکی (بخش بیماری‌ها). چاپ اول، مؤسسه انتشارات و چاپ دانشگاه تهران، شماره 2357، صفحات: 335-324 و 344. 
3. کیوانفر، ه‍.، همت‌زاده، ف. و محمودیان، ع. (1380): ویروس‌شناسی دامپزشکی (بیولوژی ویروس‌ها). انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 43، 57، 61، 65 و 82-80.
4. ممتاز، ح. و همت زاده، ف. (1382): بررسی سرولوژیک آلودگی با ویروس BLV در گاوداری­های استان چهارمحال و بختیاری. مجله تحقیقات دامپزشکی ایران، دانشگاه شیراز، دوره 4، شماره 1، صفحات: 44-37.
5. نورمحمدزاده، ف. و برین، ع. (1370): جستجوی سرولوژیکی پادتن ضد لوکوز انزئوتیک گاوی (BLV) در گوسفند. مجله دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، 46دوره 46، شماره 1، صفحات:80-69.
6. همت زاده، ف. و ممتاز، ح. (1383): مطالعه الگوی الکتروفورتیک پروتئینی عصاره عقده­های لنفاوی گاوهای لوکوزی و مقایسه آن با گاوهای به ظاهر سالم. مجله دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، دوره 59، شماره 2، صفحات: 47-43.
7. همت زاده، ف. و ممتاز، ح. (1386): ردیابی پادگن­های دخیل در پاسخ ایمنی همورال در عقده­های لنفاوی گاوهای مبتلا به لوکوز گاوی. مجله تحقیقات دامپزشکی، دانشگاه تهران، دوره 62، شماره 5، 284-281.
8. Boris-Lawrie, K., Altanerova, V., Altaner, C., Kucerova, L. and Temin, H.M. (1997): In vivo study of genetically simplified bovine leukemia virus derivatives that lack tax and rex. Journal of Virology., 71(2): 1514-1520.
9. Corcelette, S., Massé, T. and Madjar, J.J. (2000): Initiation of translation by non-AUG codons in human T-cell lymphotropic virus type I mRNA encoding both Rex and Tax regulatory proteins. Nucleic Acids Research, 28(7): 1625-1634.
10. Debacq, C., Asquith, B., Kerkhofs, P., Portetelle, D., Burny, A., Kettmann, R. and Willems, L. (2002): Increased cell proliferation, but not reduced cell death, induces lymphocytosis in bovine leukemia virus-infected sheep. Proceding National Academic Science USA, 99(15): 10048-10053.
11. McGirr, K.M. and Buehring, G.C. (2006): Tax & rex: overlapping genes of the deltaretrovirus group. Virus Genes., 32(3): 229-239.
12. Momtaz, H. (2009): Expression of bovine leukemia virus Tax protein in bacterial cell. Research Journal of Biological Science, 4(5): 542-546.
13. Momtaz, H., Hemmatzadeh, H. and Amiri, E. (2009): Cloning and  phylogenetic analysis of Bovine Leukemia Virus p24 gene of Iranian isolate. Research Veterinary Science. In Press.
14. Momtaz, H., Hemmatzadeh, H. and Keyvanfar, H. (2008): Expression of bovine leukemia virus p24 protein in bacterial cell. Pakistan Journal of Biological Science, 11(20): 2433-2437.
15. Pyeon, D. and Splitter, G.A. (1999): Regulation of Bovine Leukemia Virus tax and pol mRNA levels by interleukin-2 and -10. Journal of Virology, 73(10): 8427-8434.
16. Radostits, O.M., Gay, C.C., Hinchcliff, K.W. and Constable, P.D. (2007): Veterinary Medicine, A  textbook of the diseases of cattle, horses, sheep, pigs and goats. 10th ed., Saunders, Elsevier, pp: 1245-1248.
17. Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001): Molecular cloning :a laboratory manual. 3th ed., ColdSpringHarbor Laboratory, New York, pp: 874-895.
18. Tajima, S. and Aida, Y. (2000): The region between amino acids 245 and 265 of the bovine leukemia virus (BLV) Tax protein restricts transactivation not only via the BLV enhancer but also via other retrovirus enhancers. Journal of Virology, 74(23): 10939-10949.
19. Tajima, S. and Aida, Y. (2002): Mutant Tax protein from bovine leukemia virus with enhanced ability to activate the expression of c-fos. Journal of Virology, 76(5): 2557-2562.
20. Tajima, S., Takahashi, M., Takeshima, S.N., Konnai, S., Yin, S.A., Watarai, S., Tanaka, Y., Onuma, M., Okada, K. and Aida, Y. (2003): A mutant form of the Tax protein of bovine leukemia virus (BLV), with enhanced transactivation activity, increases expression and propagation of BLV in vitro but not in vivo. Journal of Virology, 77(3): 1894-1903.
21. Twizere, J.C., Kerkhofs, P., Burny, A., Portetelle, D., Kettmann, R. and Willems, L. (2000): Discordance between bovine leukemia virus Tax immortalization in vitro and oncogenicity in vivo. Journal of Virology, 74(21): 9895-902.
22. Twizere, J.C., Lefèbvre, L., Collete, D., Debacq, C., Urbain, P., Heremans, H., Jauniaux, J.C., Burny, A., Willems, L. and Kettmann, R. (2005): The homeobox protein MSX2 interacts with Tax oncoproteins and represses their transactivation activity. Journal of Biological Chemistery, 280(33): 29804-29811.
23. Usui, T., Konnai, S., Tajima, S., Watarai, S., Aida, Y., Ohashi, K. and Onuma, M. (2003): Protective effects of vaccination with bovine leukemia virus (BLV) Tax DNA against BLV infection in sheep. Journal Veterinary Medical Science, 65(11): 1201-1205.