بررسی کیفیت بهداشتی آب‌های معدنی طبیعی به فروش رسیده در سطح شهر تبریز در سال 1387

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 6، دوره 3، 2 (10) تابستان، شهریور 1388، صفحه 485-491   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

جلیل خندقی^{* 1}؛ محمدرضا صحت خواه²

¹گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد سراب، سراب، ایران

²آزمایشگاه مواد غذایی معاونت غذا و داروی دانشگاه علوم پزشکی، تبریز، تبریز، ایران

چکیده

با افزایش رو به رشد تولید و مصرف آب­های معدنی بطری شده در کشورمان در دهه اخیر توجه به کیفیت میکروبی این محصولات بسیار حائز اهمیت می­باشد. هدف از مطالعه حاضر آزمایش تعدادی از آب­های معدنی طبیعی بطری شده که در سطح شهر تبریز به فروش می­رسند، می­باشد. در این بررسی تعداد 150 نمونه از این محصولات از نظر تعداد کل میکروارگانیسم­­های هوازی، کلیفرم­ها، کلیفرم­هایمدفوعی، اشرشیاکولای، استرپتوکوک­هایمدفوعی، کلستریدیوم پرفرینجنس و سودوموناس آئروجینوزا مورد ارزیابی قرارگرفتند. تعداد کل میکروب­های هوازی، سودوموناسوکلستریدیوم با روش فیلتراسیون غشایی و کلیفرم­هاواسترپتوکوک­هایمدفوعی با روش بیشترین تعداد احتمالی (MPN) مورد آزمایش قرار گرفتند.نتایج حاکی از این بود که در 3/25 درصد از نمونه­ها هیچ­گونه رشدی در پلیت حاوی محیط پلیت کانت آگار وجود نداشت و در 2 درصد از نمونه­ها تعداد کل میکروارگانیسم­های هوازی در سطح بالایی (بیشتر از 20 باکتری در هر میلی­لیتر) قرار داشت. همچنین از مجموع 6/72 درصد از نمونه­هایی که از نظر تعداد کل میکروب­های هوازی قابل قبول بوده­اند، به ترتیب 75/2، 83/1، 75/2 و 91/0 درصد با کلیفرم­ها، استرپتوکوک­های مدفوعی، سودوموناس وکلستریدیوم آلوده بودند. 

کلیدواژه‌ها

آب معدنی طبیعی؛ تعداد کل میکروارگانیسم‌های هوازی؛ کلیفرم؛ فیلتراسیون غشایی؛ بیشترین تعداد احتمالی

اصل مقاله

مقدمه

 

       طبق تعریف سازمان غذا و دارو (FDA)، آب­های بطری شده (Bottled water) آب­هایی هستند که به­وسیله کارخانه در بطری یا هر ظرف دیگر مناسب برای مواد غذایی (Food grade) پر می­شود و به­ مصرف انسان می­رسد (12).

 منبع این آب می­تواند از چشمه­های طبیعی (Spring water) یا آب­های زیرزمینی (Ground water) باشد.
آب­های بطری شده را می­توان به روش­هایی مانند استفاده از ازن (Ozonation)، کربناسیون (Carbonation)، تقطیر نمودن (Distillation)، استفاده از پرتوهای ماوراء بنفش (UV) و یا فیلتر نمودن (Filtration)، میکروب­زدائی نمود ولی به هر حال استفاده از انواع روش­های فوق به استثنای فیلتراسیون در مورد آب­های معدنی طبیعی (Natural Mineral Water) ممنوع است (2 و 8).

مصرف آب­های بطری شده در طی دهه گذشته در کشور ایران به سرعت رو به افزایش است و بنابراین توجه به کیفیت بهداشتی این آب­ها برای حفظ و ارتقاء بهداشت و سلامت جامعه بیش از پیش ضروری می­نماید و این در حالی است که در مقایسه با سایر فرآورده­های غذایی، کمتر به کیفیت بهداشتی آب­های معدنی بطری شده پرداخته شده است.

 آب­های معدنی نیز مانند بسیاری از محصولات غذایی، استریل نبوده و می­توانند دارای تعداد قابل قبول و مجاز از میکروارگانیسم­های مختلف باشند. به­طور کلی دو دسته از باکتری­ها در NMW دیده می­شوند:

1 ـ باکتری­های فلور طبیعی آب (Autochthonous) که در خود منبع آب موجود هستند و معمولاً سایکروتروف و گرم منفی بوده و چون با شرایط محیطی خود به خوبی سازگار
شده­اند، تعداد آن­ها بلافاصله بعد از بطری شدن شروع به ازدیاد نموده و در سطح بالائی باقی می­ماند.

2 ـ باکتری­های خارجی (Allochthonous) که در هنگام بطری کردن آب در کارخانه، از منابع مختلفی مانند تجهیزات و سطوح و پرسنل به آب راه می یابند و به دلیل کمبود مواد مغذی معمولاً قادر به بقاء در این محیط نمی­باشند. با این وجود مواردی از جداسازی باکتری­ها و ویروس­های پاتوژن، حتی چندین هفته پس از تولید آب­های معدنی، گزارش شده است
(6، 10 و 11).

مثلاً Kerr و همکارانش در سال 1999 به ارزیابی بقاء E.coli O157: H7 در آب­های بطری شده پرداخته و نتیجه گرفتند، این پاتوژن در آبهای معدنی طبیعی (NMW) مدت زمان بیشتری نسبت به سایر آب­های بطری شده زنده می­ماند (7).

طبق استاندارد ملی ایران به شماره 2591 حد مجاز آلودگی میکروبی آب­های معدنی طبیعی در مراکز فروش به شرح جدول 1 می­باشد (2).

جدول 1- حد مجاز آلودگی آب­های معدنی طبیعی

نوع میکروارگانیسم	دمای گرمخانه­گذاری  (سانتی­گراد)	حداکثر قابل قبول
شمارش کلی باکتری­ها	37	20/میلی­لیتر
کلیفرم­ها	37	در هر 250 میلی­لیتر منفی باشد
استرپتوکوک­های مدفوعی	37	در هر 250 میلی­لیتر منفی باشد
کلستریدیوم­های احیاء کننده سولفیت	42	در هر 250 میلی­لیتر منفی باشد
سودوموناس آئروجینوزا	42	در هر 250 میلی­لیتر منفی باشد

هدف از این مطالعه­، بررسی میزان آلودگی آب­های معدنی طبیعی بطری شده، به میکروارگانیسم­های شاخص آلودگی بوده و بدین منظور تعداد 150 نمونه از آب­های بطری شده عرضه شده در سطح فروشگاه­های شهر تبریز مورد آزمایش قرار گرفت. مواد و روش‌کار

     برای انجام این آزمایش تعداد پنج بطری 5/1 لیتری آب معدنی طبیعی، از سه سری ساخت، متعلق به ده کارخانه تولیدکننده آب معدنی طبیعی بطری شده، از فروشگاه­های سطح شهر تبریز انتخاب شده ( مجموعاً 150 نمونه ) و از نظر حضور و تعداد کل میکروب­های هوازی،کلیفرم­ها،
کلیفرم­های مدفوعی یا TTC (ThermoTolerantColiforms)، اشرشیاکولای، استرپتوکوک­های مدفوعی (آنتروکوک)، کلستریدیوم­های احیاءکننده سولفیت ( کلستریدیوم پرفرینجنس) و نیز سودوموناس آئروجینوزا مورد مطالعه قرارگرفت .

برای ارزیابی آلودگی با سودوموناس و کلستریدیوم پرفرینجنس و مشخص کردن تعداد کل میکروب­های هوازی از روش فیلتراسیون غشایی و در مورد کلیفرم­ها و استرپتوکوک­هایمدفوعی از روش بیشترین تعداد احتمالی یا MPN (Most Probable Number ) استفاده شد (5).

در روش اول پس از فیلتر کردن حجم 100 میلی­لیتر از آب بطری با استفاده از فیلترهای میکروبیولوژی (با قطر منافذ 45/0 میکرون)، فیلترهای مذکور روی محیط جامد PCA ( Plate Count Agar) برای نمایش تعداد کل میکروب­های هوازی و محیط انتخابی Pseudomonas Selective Agar یا همان CET Agar (Cetrimide agar) برای شناسائی سودوموناس آئروجینوزا و بالاخره محیط SPS Agar (Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar)، برای شناسائی کلستریدیوم پرفرینجنس قرار داده شد و سپس پلیت­های حاوی PCA، 24 ساعت در 36 درجه سانتی­گراد و پلیت­های حاوی SPS Agar، 48 ساعت در 36 درجه سانتی­گراد و در جار
بی­هوازی و پلیت­های حاوی ستریماید آگار، ابتدا چند ساعت در 30 درجه سانتی­گراد (به منظور التیام و احیای اجرام آسیب دیده احتمالی) و سپس تا 48 ساعت در 41 درجه سانتی­گراد گرمخانه­گذاری گردیدند (1 و 5).

برای جداسازی کلیفرم­ها، محیط LST ( Lauryl Sulfat Triptose broth) استفاده و لوله­های آزمایش 24 ساعت در 36 درجه سانتی­گراد گرمخانه­گذاری شدند (که ایجاد کدورت و تجمع گاز در زیر لوله دورهام نشانه مثبت بودن تست می­باشد) و تعداد کلیفرم­ها در هر میلی­لیتر از نمونه با استفاده از جدول MPN محاسبه شد. برای ارزیابی حضور کلیفرم­های مدفوعی چند قطره از محتویات لوله­های آزمایش مثبت در لوله­های آزمایش حاوی محیط BGBB (Brilliant Green Bile Broth) و لوله دورهام تلقیح شده و در 42 درجه سانتی­گراد گرمخانه­گذاری شد (که ایجاد کدورت و تولید گاز نشانگر مثبت بودن حضور TTC است).

در روش MPN نیز از روش پنج لوله­ای استفاده شد و
رقت­های انتخاب شده 1/0 و صفر و 10 برابر بودند که
محیط­های کشت دو قدرته (Double strength) در رقت ده برابر به­کار رفت (مقدار دو برابر از محتویات توصیه شده توسط شرکت سازنده در آب مقطر حل و محیط کشت تهیه شد) (5 و 11).

همچنین به­منظور جستجوی اشرشیا کولای از نمونه­های مثبت مرحله اخیر تست (IMViC) انجام گرفت (1 و 3).

 برای جدا سازی استرپتوکوک­هایمدفوعی نیز از محیط Glucose Azide broth استفاده شد که لوله­های آزمایش حاوی محیط کشت، پس از تلقیح شدن ابتدا چند ساعت در 36 درجه و سپس تا 48 ساعت در 45 درجه سانتی­گراد گرمخانه گذاری گردید ( که تولید اسید در محیط نشانگر مثبت بودن تست می­باشد).

برای تأیید بیشتر انتروکوک­ها، چند قطره از محتویات لوله­های آزمایش مثبت در محیط Aesculin Bile Agar تلقیح شد تا قدرت هیدرولیز اسکولین در محیط و تولید رنگ قهوه­ای مایل به سیاه بررسی شود.

 برای تأیید کلستریدیوم پرفرینجنس احتمالی نیز، تعداد پنج پرگنه سیاهرنگ از محیط SPS Agar انتخاب و پس از کشت در محیط کشت BHI Agar (برای در دست داشتن مقدار کافی از نمونه خالص میکروبی) مورد آزمایشات زیر قرار گرفت:

رنگ­آمیزی گرم، احیای نیترات، تحرک، تجزیه قند لاکتوز و ذوب ژلاتین (4، 5 و 9)

برای ارزیابی خواص احیای نیترات و متحرک بودن به محیط نیترات براث، مقدار 3 گرم در لیتر آگار اضافه شده و در
لوله­های آزمایش درپیچ­دار تقسیم شد که از نمونه مورد نظر به کمک آنس نوک تیز و به­طور عمقی در این محیط تلقیح گردید.

برای سنجش قدرت تجزیه قند لاکتوز و ذوب ژلاتین نیز به محیط BHI broth مقدار 10 گرم در لیتر، قند لاکتوز و 05/0 گرم در لیتر، معرف فنل رد و نیز 120 گرم در لیتر، ژلاتین اضافه شده و سپس به همان روش قبلی از نمونه­های مشکوک در این محیط تلقیح انجام گرفت.

بالاخره به­منظور تأیید سودوموناس آئروجینوزا هم، تعداد پنج پرگنه مایل به رنگ سبز که در زیر نور UV با طول موج 360 نانومتر، نور فلورسنت سبز تولید می­کرد، انتخاب و پس از کشت در محیط BHI broth (برای در دست داشتن مقدار کافی از نمونه خالص میکروبی) مورد آزمایشات زیر قرار گرفت:

رنگ­آمیزی گرم، اکسیداز، کاتالاز و کشت در محیط OF (4 و 9).

نتایج

     بر اساس نتایج آزمون­های میکروبی، آب­های معدنی آزمایش شده، به 3 دسته تقسیم شدند که عبارتند از:

گروه اول: نمونه­هایی که جمعیت میکروب­های هوازی آنها صفر بوده است. که تعداد 38 نمونه از 150 نمونه آزمایش شده (3/25 %)، اینگونه بوده­اند لذا مورد آزمایشات بعدی نیز قرار نگرفتند.

گروه دوم: نمونه­هایی که جمعیت میکروب­های هوازی در آنها پائین­تر از حد مجاز آلودگی تعیین شده توسط استاندارد ملی ایران یعنی 20 باکتری در هر میلی­لیتر بوده است. که تعداد 109 نمونه از کل نمونه­های مورد آزمایش (6/72 %) از این دسته بوده­اند و نتایج مراحل بعدی آزمایش این گروه در جدول 2 ذکر شده است.

 

جدول 2 - تعداد نمونه­های آلوده به میکرواگانیسم­های شاخص که ACC در آنها کمتر از حد مجاز می­باشد

 

نوع نمونه

تعداد کلیفرم­ها در هر 100 میلی­لیتر

تعداد کلیفرم­های مدفوعی در هر 100 میلی­لیتر

تعداد اشرشیا کولای در هر 100 میلی­لیتر

تعداد استرپتوکوک مدفوعی در هر 100 میلی­لیتر

تعداد سودوموناس در هر 100 میلی­لیتر

تعداد کلستریدیوم­ها در هر 100 میلی­لیتر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

NMW

3

106

صفر

109

صفر

109

2

107

3

106

1

108

 

 

گروه سوم: نمونه­هایی که جمعیت میکروب­های هوازی آنها بالاتر از حد مجاز استاندارد ملی ایران بوده است، که تعداد 3


نمونه از کل نمونه­های مورد آزمایش (2 %) این­گونه بوده­اند و نتایج مراحل بعدی آزمایش این دسته از نمونه­ها نیز در جدول 3 آمده است.

 

 

 

 

 

 

 

جدول 3- تعداد نمونه­های آلوده به میکروارگانیسم­های شاخص که ACC در آنها بالاتر از حد مجاز می­باشد

 

نوع نمونه

تعداد کلیفرم­ها در هر 100 میلی­لیتر

تعداد کلیفرم­های  مدفوعی در هر  100 میلی­لیتر

تعداد اشرشیا کولای در هر  100 میلی­لیتر

تعداد استرپتوکوک مدفوعی در هر 100 میلی­لیتر

تعداد سودوموناس در هر  100 میلی­لیتر

تعداد کلستریدیوم­ها در هر  100 میلی­لیتر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

1≤

صفر

NMW

2

1

صفر

3

صفر

3

1

2

صفر

3

صفر

3

 

 

درضمن در جدول 4، تعداد موارد آلوده به میکروارگانیسم­های شاخص از بین نمونه­های گروه دوم نشان داده شده است.

 

جدول 4- تعداد موارد آلوده به میکروارگانیسم­های شاخص از بین
نمونه­هایی که جمعیت میکروب­های هوازی در آنها پائین­تر از 20 باکتری در هر میلی­لیتر بوده است (گروه دوم)

تعداد نمونه	تعداد نمونه­های آلوده به
	کلیفرم	استرپتوکوک	سودوموناس	کلستریدیوم
3	*
1	*	*
2			*
1			*	*
1		*

 

بحث و نتیجه‌گیری

       همان­طور که در نتایج مشاهده می­شود در مجموع نزدیک به 98 درصد از نمونه­های مورد آزمایش از نظر جمعیت کل میکروب­های هوازی، قابلیت مصرف دارند ولی مجموعاً تعداد 7

 

نمونه (42/6%) از آب­هایی که آلودگی آنها از نظر جمعیت میکروب­های هوازی در حد قابل قبول می­باشد از نظر حضور کلیفرم­ها، استرپتوکوک­های مدفوعی، سودوموناس آئروجینوزا و کلستریدیوم پرفرینجنس غیر قابل مصرف می­باشند، لذا تنها سنجش جمعیت میکروب­های هوازی برای ارزیابی کیفیت بهداشتی NMW نمی­تواند کافی باشد و میزان سایر باکتری­های شاخص آلودگی آب یعنی کلیفرم­ها، کلیفرم­های مدفوعی، استرپتوکوک­های مدفوعی، کلستریدیوم پرفرینجنس، سودوموناس آئروجینوزا در هر 250 میلی­لیتر از نمونه باید صفر باشد (6 و 8).

در گروه دوم از نمونه­های مورد آزمایش در این تحقیق­، مشاهده می­شود که  75/2% از نمونه­ها، از نظرحضور کلیفرم و 86/1% از نظر استرپتوکوک­های مدفوعی و  75/2% هم از نظر سودوموناس آئروجینوزا و نیز 91/0% از نظر حضور کلستریدیوم پرفرینجنس در هر 100 میلی­لیتر از نمونه مثبت می­باشند.

چنانچه مشاهده می­شود، یک مورد از 109 نمونه آزمایش شده در گروه دوم حاوی کلستریدیوم پرفرینجنس می­باشد. اصولاً تعداد این میکروارگانیسم در مقایسه باکلیفرم­های مدفوعیو اشرشیاکولای در مدفوع خیلی کم است (منشاء هر دو میکروارگانیسم از مدفوع می­باشد) ولی از آنجا که کلستریدیوم قادر به تولید اسپور است و اسپورها می­توانند مدت طولانی در آب زنده بمانند، لذا می­توانند سبب ایجاد آلودگی در نمونه­هایی شوند که حتی از نظر کلیفرم­ها منفی است (5).

 به­علاوه آلودگی نسبتاً بالائی (83/2 %) از نمونه­های گروه دوم به سودوموناس آئروجنینوزا دیده می­شود. این باکتری از دسته اجرام گرم منفی سرماگراست که به­خوبی با شرایط محیطی خود سازگار شده و می­تواند با پائین آوردن فعالیت متابولیکی خود مدت طولانی در آب زنده بماند (10). محققین مختلفی جداسازی سودوموناس را از آب­های معدنی گزارش کرده­اند که در برخی از آنها درصد بالایی از آلودگی گزارش شده مانند آلودگی 83 درصدی آب­های معدنی در مطالعه Manaia و همکارانش در سال 1990 درحالی­که برخی از گزارشات مانند تجربه Bischofberger و همکارانش در همان سال میزان آلودگی کمتری را نشان می­دهد. Vess و همکارانش نیز علت بقای این باکتری را چسبیدن به جدار پلاستیکی ظروف
بسته­بندی آب دانسته­اند. در ضمن سودوموناس آئروجنینوزا برخلاف سایر انواع سودوموناس­هاقادر به رشد در دمای 41 درجه سانتی­گراد هم هست که به­عنوان معیاری برای تفکیک این میکروارگانیسم از سایر سودوموناس­ها استفاده می­گردد (5).

نکته قابل توجهی که در جدول شماره 4 نیز مشاهده می­شود، این است که در نمونه­های گروه دوم، دو مورد از آلودگی­ها تنها بهسودوموناسو یک مورد نیز به استرپتوکوک­ها و کلستریدیوم مربوط می­شود و این موضوع به خوبی نشان می­دهد که علاوه بر اینکه آلودگی آب­های معدنی به سودوموناس، می­تواند مستقل از آلودگی کلیفرمی در آب­های معدنی باشد، حتی
استرپتوکوک­های مدفوعیو کلستریدیوم پرفرینجنس هم که منشاء مشترکی با کلیفرم­ها دارند، هر کدام می­توانند به­طور مستقل از آلودگی آب به کلیفرم­ها، سبب آلودگی این محصولات گردند. لذا جستجوی تک­تک این میکروارگانیسم­ها در NMW ضرورت پیدا می­کند.

برای ریشه­یابی مشکل آب­هایی که آلودگی در آنها مشاهده
می­شود، ابتدا باید از سرچشمه اصلی آب نمونه برداری نمود و چنانچه آلودگی از منبع آب باشد، باید به روش­هایی مانند فیلتراسیون و غیره در صدد حل مشکل برآمد و گرنه مشکل در بهداشت کارخانه تولید کننده (اعم از دستگاه­ها و تجهیزات و یا پرسنل و ... ) می­باشد، که بایستی با اتخاذ تدابیری مانند اجرای درست سیستم کنترل کیفیت بهداشتی، از جمله سیستم (HACCP)، آلودگی را کنترل و به حداقل رساند. 

مراجع

1. رضویلر، و. (1378): میکروب­های بیماری­زا در مواد غذایی و اپیدمیولوژی مسمومیت­های غذایی، چاپ اول، انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 95 – 84.
2. مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران (1365): ویژگی­های باکتریایی آب معدنی، انتشارات مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران، شماره 2591.
3. مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران (1382): آب معدنی، روش آزمون میکروبیولوژیکی، انتشارات مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران، شماره 5869.

1. 4.  Cowman, S. and Kelsey, R. Bottled Water. In: Vanderzant, C. and Splittstoesser, D.F. (1992):  Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 3^rd ed., APHA , WashingtonDC, pp: 1031-1036.

5. Harrigan,W.F. Microbiological examination of specific foods-Water. In: Harrigan,W.F. (1998): Laboratory methods in food microbiology. 3^rd ed., Academic press, London, pp: 298-305.
6. Hunter, R.P. (1993): The microbiology of bottled natural mineral waters (a review). Journal of applied bacteriology, (74): 345-352.
7. Kerr, M., Fitsgerald, M., Sheridan, J.J., Mcdowell, D.A. and Blair, I.S. (1999): Survival of Escherichia coli O157:H7 in bottled natural mineral water. Journal of applied microbiology, (87): 833-841.
8. Loy, A., Beisker, W. and meier, H. (2005): Diversity of bacteria growing in natural mineral water after bottling, Applied and environmental microbiology, (71): 3624-3632.
9. Mac Fadin, J.F. Section ш: Identification schems-gram negative bacteria. In: Mac Fadin, J.F. (2000): biochemical tests for identification of medical bacteria, 3^rd ed., Lippincott, Williams&Wilkins, Washington, USA, pp: 705-731.
10. Mavridou, A. (1992): Study of the microbial flora of a non-carbonated natural mineral water. Journal of applied bacteriology, (73): 355-361.
11. Tamaguini, L.M. and Gonzales, R.D. (1997): Bacteriological srability and growth kinetics of Pseudomonas aeroginosa in bottled water. Journal of applied microbiology, (83): 91-94.
12. Warburton, D., Harrison, B., Crawford, C., Foster, R., Fox, C., Gour, L. and Krol, P. (1998): A further review for the microbiological guality of bottled water soled in Canada: 1992-1997 survey results. International journal of food microbiology, (39): 221-226.