تشخیص گونه مایکوپلاسما گالی‌سپتیکوم به‌وسیله 16S rRNA PCR با پرایمرهای اختصاصی در نمونه‌های بالینی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 7، دوره 3، 2 (10) تابستان، شهریور 1388، صفحه 493-502   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

سید علی پوربخش^{* 1}؛ افشین ذاکری²؛ نریمان شیخی³؛ سعید چرخکار³؛ عباس اشتری⁴

¹گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، ایران، ایران

²دانشجوی دوره دکترای تخصصّی بیماریهای طیور، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، ایران، ایران

³گروه علوم درمانگاهی، دانشکده علوم تخصصّی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران

⁴آزمایشگاه رفرانس مایکوپلاسما، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرج، کرج، ایران

چکیده

 مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم به عنوان یکی از اصلی­ترین پاتوژن­های پرندگان، خسارات اقتصادی فراوانی را به صنعت مرغداری وارد می­کند. هدف اصلی این مطالعه شناسایی گونه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم در نمونه­های بالینی با استفاده از روش  16S rRNA PCRمی­باشد. برای بررسی تیتر سرمی، 18 فارم تخم­گذار تجارتی و 8 فارم مادر گوشتی انتخاب و تست RSAT (Rapid Serum Agglutination Test) انجام گردید. جهت نمونه‌برداری برای  PCR (Polymerase Chain Reaction)، از 17 فارمی که در تست RSAT مثبت شده بودند، 10 فارم انتخاب و 109 سوآپ استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه از هر فارم تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلی­لیتر PBS انداخته شد و به آزمایشگاه منتقل گردید تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. در این مطالعه، پرایمرهای اختصاصی برای ژن 16S rRNA استفاده شد. پرایمرهای مورد استفاده برای ژن16S  rRNA کاملاً اختصاصی مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم می­باشد و با تمام مایکوپلاسما­ها و دیگر باکتری­های موجود در نای طیور قابل تفریق است. از 26 فارم مورد آزمایش، 17 فارم در تست سرمی RSAT مثبت شدند. محصولPCR  تولیدی توسط پرایمرهای اختصاصی، در 10 فارم، 46 نمونه معادل 2/42 درصد در PCR ، باند 530 جفت بازی را برای همه سویه­های فیلدی بر روی ژل الکتروفورز تشکیل داد.16S rRNA PCR  با حساسیت بالا می­تواند در تشخیص قطعی عفونت با مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم در آزمایشگاه به کار برده شود. 

کلیدواژه‌ها

مایکوپلاسما گالی‌سپتیکوم؛ نمونه‌های بالینی؛ PCR

اصل مقاله

مقدمه

 

     با توجه به اهمیت بیماری مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم از جنبه اقتصادی و با توجه به ایجاد بیماری مزمن تنفسی (CRD) و با در نظر گرفتن تحمیل هزینه­های درمانی زیاد و عدم پاسخ­دهی مناسب و عدم بروز حداکثر عملکرد پرندگان آلوده به این باکتری، استفاده از روش­های تشخیصی مطمئن و سریع که بتواند در شرایط خاص در حداقل زمان ممکن و با درصد احتمال بسیار بالا این عامل را تشخیص دهد، بسیار ضروری به نظر می­رسد. تشخیص به موقع مایکوپلاسما هم از جهت پرورش­دهندگان مرغ مادر، هم پرورش­دهندگان
جوجه­های تجارتی و هم از نظر سازمان دامپزشکی حائز اهمیت می­باشد (15). مایکوپلاسماها پروکاریوت­های بسیار کوچکی هستند که فاقد دیواره سلولی بوده و به این دلیل در مقابل آنتی­بیوتیک­هایی که روی سنتز دیواره سلولی اثر می‌کنند، مقاوم می­باشند. شکل کلونی‌ها مثل تخم‌مرغ پخته
(fried egg) یا دکمه‌ای شکل می‌باشد. همچنین نسبت به احتیاجات پیچیدة غذایی در صورت کمبودشان مقاوم هستند. بعضی از مایکوپلاسما­ها فقط یک نوع حیوان را آلوده می‌کنند
(host specific) ولی بعضی‌ها قادرند در چندین حیوان مختلف ایجاد بیماری نمایند. مایکوپلاسماها در گیاهان، جانوران، انسان و حشرات ایجاد بیماری می‌کنند. به­طور عمومی، مایکوپلاسماها در سطح مخاطی کلونیزه می‌شوند و اکثراً غیرمهاجم هستند ولی بعضی گونه‌ها مثل مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم قادر به سوراخ کردن سلول‌ها هستند. مایکوپلاسماها به­طور اولیه به غشای مخاطی دستگاه تنفس و یا ادراری تناسلی، چشم و مفاصل تمایل دارند. بسیاری از آنها
به­عنوان انگل‌های سطحی شناخته می‌شوند و به­ندرت بافت­ها را مورد تهاجم قرار می‌دهند. البته انتشار آنها به اندام­های مختلف، بیانگر حداقل یک عفونت عمومی زودگذر است.
به­طور کلی، گونه‌های مایکوپلاسما و احتمالاً سویه‌های خاصی تمایل بیشتری به بعضی از بافت­ها یا اندام­ها دارند هر چند این تمایل الزاماً به معنی حذف کامل از سایر اندام­ها نیست (17).

با استناد به آنالیز توالی ژن 16S rRNA تصور می‌شود که مایکوپلاسماها حدود 600 میلیون سال قبل با از دست دادن قسمت­های غیرضروری از ژنوم خود از جمله ژن­های سنتنز دیواره سلولی از باکتری­های گرم مثبت و مشخصاً
 کلستریدیوم­ها مشتق شده‌اند.

تاکنون 23 گونه مختلف مایکوپلاسما از پرندگان جدا شده که ماکیان و بوقلمون میزبان 16 گونه از آنها می‌باشند. در این میان تنها چهار گونه برای طیور بیماری­زا هستند که شامل مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم، مایکوپلاسما سینوویه، مایکوپلاسما مله آگریدیس و مایکوپلاسما آیوا می‌باشد. به دلیل اهمیت نقش بیماری­زایی مایکوپلاسماهای طیور، از سال­ها قبل برنامه
ریشه­کنی از گله‌های مولد به اجرا درآمده است. با این وجود مایکوپلاسماها در گله‌های طیور حضور داشته و عفونت مایکوپلاسمایی همچنان یک معضل بزرگ صنعت طیور محسوب شده و در صورت آلوده شدن گله‌های مولد با ارزش، ممکن است کشتار شده و یا اینکه نتاج آنها ارزش صادرات و فروش خود را از دست بدهند. مایکوپلاسماها از کلاس Mollicutes، شاخه I یعنی Mycoplasmatales و جنس I یعنی mycoplasma هستند و بیش از 100 گونه دارند. دارای DNA بوده و برای رشد به کلسترول نیاز دارد. درجه حرارت اپتیمم برای رشد 37 درجه­سانتی­گراد است. با آنالیز ژن ریبوزوم 16srRNA می‌توان ارتباط ژنتیکی بین مایکوپلاسماها را بررسی کرد.

روش کشت مایکوپلاسما پرزحمت، کند، گران و نیازمند شرایط استریل است. واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز روش جایگزین سریع و اختصاصی برای کشت می‌باشد. در دهه 1990 روش­های مولکولی برای شناسائی مایکوپلاسمای پرندگان توصیف شد. اساس تمام آنها مبتنی بر تکثیر یا شناسائی یک قطعه خاص از ژنوم می‌باشد. در این بین ژن 16S rRNA به دلیل ثبات قابل توجه در گونه‌ها و حتی در میان جنس مورد توجه بیشتر قرار گرفته و با تکثیر، تعیین توالی و یا استفاده از پروب، امکان شناسائی ارگانیسم فراهم می‌شود (10، 15 و 16).

مواد و روش‌کار

- نمونه برداری و انجام RSAT

     372 نمونه سرمی از 26 فارم شامل 8 فارم مادر گوشتی و 18 فارم تخم­گذار تجارتی اخذ گردید و جهت انجام تست RSAT به آزمایشگاه سرولوژی انتقال یافت. برای انجام RSAT مراحل زیر انجام شد:

یک حجم از سرم (تقریباً معادل ) را روی یک کاشی سفید ریخته و یک حجم از آنتی­ژن رنگی مایکوپلاسما
گالی­سپتیکوم به آن اضافه گردید. به منظور مخلوط نمودن آنتی ژن و سرم، کاشی به­شکل دورانی تکان داده شد. در صورت وجود آنتی­بادی علیه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم پدیدة آگلوتیناسیون اتفاق می‌افتاد که با گرد هم آمدن ذرات معلق در مایع مشخص گردید (سرم مرغ حداکثر در مدت 2 دقیقه و سرم بوقلمون در مدت 3 دقیقه با آنتی ژن آگلوتینه می‌شود). در خصوص تأیید تشخیص مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم کلیه
سرم­های مثبت مرحله قبل به مدت 30 دقیقه در بن ماری 56 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و آزمایش تکرار گردید (جهت غیر فعال سازی واکنشگرهای غیر اختصاصی). سرم­های مثبت مرحله قبل را با PBS رقیق نموده و آزمایش تکرار شد در صورتی­که سرم­ها در رقت یک هشتم با آنتی ژن مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم آگلوتینه شوند از نظر تست سریع مثبت و در صورت عدم آگلوتیناسیون منفی قلمداد می‌شدند. جهت تسریع و سهولت کار می‌توان مراحل 4 و 5 را ادغام نمود. یعنی ابتدا رقت  تهیه نمود و سپس به­مدت 30 دقیقه در بن ماری 56 درجه سانتی­گراد قرار داد و بعد آزماش را تکرار نمود. نتیجه این آزمایش به صورت مثبت (+) یا منفی (-) گزارش شد (5).

آماده‌سازی محیط کشت و بررسی عملکرد محیط‌های کشت:

محیط‌های متعددی جهت کشت مایکوپلاسما وجود دارد. یکی از محیط‌هایی که تقریباً تمامی نیازهای مایکوپلاسمای طیور در آن به­کاررفته و به­طور گسترده‌ای در ایالات متحده استفاده می‌شود محیط کشت Frey است. محیط دیگری که برای کشت مایکوپلاسما به­کار می‌رود محیط کشت PPLO می‌باشد. علاوه‌بر محیط کشت پایه، جهت غنی‌سازی محیط باید مواد دیگری نیز به آن اضافه شود. هر دو محیط در این مطالعه استفاده شده است (1). یکی از مهم­ترین جنبه‌های کشت مایکوپلاسماها به­ویژه مایکوپلاسماهای پرندگان بررسی محیط کشت جهت اطمینان از توانایی آن در حمایت از رشد مایکوپلاسما می‌باشد و ممکن است مایکوپلاسما به دلیل عدم کارآیی محیط توانایی رشد در آن محیط را نداشته باشد. لذا حتی پس از تغییر در یکی از اجزاء حتماً باید محیط کشت مورد آزمایش قرار گیرد. مهم­ترین اجزائی که ممکن است در نارسائی محیط کشت دخیل باشند شامل عصاره مخمر، سرم و آگار می‌باشند. که در این میان عصاره مخمر به­ویژه عصاره‌های تجارتی مورد توجه ویژه باید قرار گیرند. لذا توصیه بر استفاده از عصاره مخمر تازه تهیه شده در آزمایشگاه می‌باشد. پس از تهیه محیط‌های کشت فوق توانایی آنها در حمایت از رشد مایکوپلاسما با استفاده از سویه کم پاساژ مایکوپلاسما     گالی­سپتیکوم مورد تأیید قرار گرفت. همچنین از تمام اجزاء محیط کشت و محیط کشت نهایی جهت اطمینان از عاری بودن از آلودگی میکروبی کشت میکروبی به­عمل آمد(1).

نمونه‌برداری جهت کشت:

نمونه‌ها از گله‌های مادر گوشتی و تخم­گذار تجارتی اخذ گردید. در این مطالعه جهت کشت و جداسازی از گله‌هائی نمونه‌برداری صورت گرفت که قبلاً در RSAT نتایج مثبت به­دست آمده بود. در این مطالعه 510 نمونه از 17 فارم مادر گوشتی و تخم گذار تجارتی اخذ گردید.

نمونه‌برداری از پرندگان زنده:

نمونه در پرنده زنده از شکاف کامی (Chonal cleft) اخذ گردید. با استفاده از سوآب کتانی استریل از نای یا شکاف کامی نمونه تهیه شد و پس از تلقیح در لوله آزمایش حاوی محیط کشت مایکوپلاسما سوآب دور انداخته شد و سپس درب لوله آزمایش محکم بسته شد. نمونه‌ها به­صورت انفرادی و با دقت به منظور جلوگیری از آلوده شدن جمع‌آوری شد. هر نمونه پس از اخذ، سریعاً در داخل فلاسک حاوی بسته‌های یخ قرار گرفت. نمونه‌ها در داخل فلاسک سریعاً به آزمایشگاه منتقل گردید و در انکوباتور 37 درجه قرار گرفت (1).

 

 

نمونه‌برداری از پرندگان تلف شده:

نمونه‌ها از پرندگان کالبدگشایی شده از نای، یا کیسه هوایی و ریه با کمک سوآب کتانی اخذ شد. بقیه مراحل همانند نمونه‌برداری از پرندگان زنده بود.

کشت و جداسازی:

پس از قراردادن نمونه‌ها در انکوباتور، محیط‌های کشت، روزانه مورد بررسی قرار می‌گرفت. تغییر رنگ در 24 ساعت اول ناشی از آلودگی باکتریایی یا رشد مایکوپلاسماهای ساپروفیت قلمداد شده و این نمونه‌ها از انکوباتور حذف می‌گردیدند. در روزهای بعد هر تغییر رنگی از قرمز به زرد و کدر شدن محیط سریعاً پاساژ داده شده و به­طور همزمان به محیط کشت مایع و جامد انتقال داده می‌شد. نمونه‌هایی که تا ده روز هیچ تغییر رنگی نداشتند نیز در روز دهم پاساژ داده و به محیط مایع و جامد منتقل می‌شدند. به­هرحال نمونه‌های اصلی تا یک ماه در انکوباتور حفظ شده و درصورتی که شواهدی از رشد در آنها با ساب کالچر آنها مشاهده نمی‌شد به­عنوان نمونه منفی حذف می‌گردیدند. محیط‌های کشت جامد در انکوباتور حاوی 5% CO₂ با اتمسفر بسیار مرطوب قرار گرفته و هر روز جهت شناسایی پرگنه مایکوپلاسمایی توسط میکروسکوپ مورد بررسی قرار می‌گرفت (1).

نمونه‌برداری جهت PCR:

هدف اصلی این مطالعه شناسایی گونه مایکوپلاسما
گالی­سپتیکوم با استفاده از روش  16S rRNA PCRمی­باشد.

جهت نمونه‌برداری برای PCR، از 17 فارمی که در تست RSAT مثبت شده بودند، 10 فارم انتخاب و 109 سوآپ استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه از هر فارم تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلی­لیتر PBS انداخته و به آزمایشگاه منتقل شد تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد (1). 

 

 

 

مراحل استخراج DNA به روش فنل کلروفورم:

     ابتدا مقدار 500 میکرولیتر از نمونه مورد نظر بعد از قرار دادن در شیکر به درون میکروتیوپ 5/1 میلی­لیتری انتقال داده شد و جهت رسوب‌گیری به مدت 15 دقیقه در13000 دور سانتریفوژ گردید (نمونه­ها حاوی ذرات بزرگ بودند که ابتدا به مدت 5 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ شدند و محلول رویی به تیوپ جدید منتقل گردید و تیوپ حاوی مواد ته‌نشین شده دور انداخته شد. سپس مراحل بعدی روی محلول رویی انجام گردید). پس از سانتریفوژ، بافر لیز­کننده اضافه گردید. سپس به خوبی مخلوط گردیده و در شیکر، تکان داده شد و در بن‌ماری 56 درجه سانتی­گراد به مدت 4-5/3 ساعت قرار داده شد. ترکیبات تشکیل دهنده بافر لیزکننده در زیر آمده است. به ازاء هر200 میلی­لیتر از محلول بالا، 20 میلی­لیتر پروتئیناز K اضافه گردید.

 

Lysis Buffer
50 Mm (pH=8)	Tris-Hcl
1%	SDS
100 Mm	NaCl
50 Mm	EDTA
1ml (2mg/µl)	Proteinase K

 

در این مرحله تریس با pH برابر 8 نقش بافر، EDTA به عنوان مهارکننده آنزیم­های DNAase، SDS به­عنوان
حل­کننده چربی­های موجود در غشاء سلول و نمونه و پروتئیناز K به عنوان هضم کننده پروتئین­ها و اتصالات بین سلولی عمل می­کند. در این مرحله نمونه­ها حاوی DNA آزاد شده از مولکول پروتئین و چربی می­باشند. اما هنوز مخلوطی از مواد اضافه موجود است که به آن شیره خام (crude lysate)
می­گویند.

بعد از 4 ساعت نمونه­ها خارج شدند و هم­حجم آن (100 میکرولیتر نمونه + 100 میکرولیتر بافر لیز کننده جمعاً 200  میکرولیتر) فنل اشباع شده به نمونه­ها اضافه گردید تا DNA از شیره خام با استفاده از حلال­های غیر قطبی استخراج گردد. نمونه­ها خوب تکان داد شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید (سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). نمونه­ها دو فاز تشکیل دادند که به آرامی با سمپلر فاز رویی کشیده شد و به تیوپ جدید انتقال یافت و فاز زیر آن به همراه تیوپ دور انداخته شد. هم حجم با فاز رویی که توسط سمپلر کشیده شده بود (در حد 150 میکرولیتر)، به تیوپ، مخلوط فنل- کلروفورم (که از قبل به نسبت مساوی با هم مخلوط شده‌اند) اضافه شد. تیوپ­ها به خوبی تکان داده شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید.

نمونه­ها دو فاز تشکیل دادند که به آرامی با سمپلر فاز رویی کشیده شد و به تیوپ جدید انتقال یافت و فاز زیر آن به همراه تیوپ دور انداخته شد. هم حجم با فاز رویی که توسط سمپلر کشیده شده بود (در حد 150 میکرولیتر)، به تیوپ، کلروفورم اضافه شد. تیوپ­ها به خوبی تکان داده شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید (سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). محلول رویی با سمپلر کشیده شد و به تیوپ­های جدید انتقال یافت. یک دهم حجم آن استات سدیم 3 مولار جهت تغلیظ و ته­نشین کردن DNA اضافه شد (محلول استات سدیم باعث یونیزه شدن DNA گشته و حل شدن آن را کاهش می­دهد) و به آرامی مخلوط گردید و دو برابر حجم نمونه، الکل مطلق 100-96 درجه سرد اضافه شد. به مدت 20- 15دقیقه نمونه­ها در فریزر 20 درجه سانتی­گراد زیر صفر قرار داده شد. نمونه­ها از فریزر خارج گردید و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ شد (سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). مایع رویی تیوپ تخلیه شد و بعد از تکان دادن، جهت خشک شدن الکل موجود در تیوپ، زیر هود قرار داده شد (باید دقت گردد تا نمونه موجود در تیوپ بیش از حد خشک نگردد چون باعث شکسته شدن DNA می­گردد که برای انجام مطالعه مطلوب نمی­باشد). 50 میکرولیتر آب مقطر استریل به نمونه (DNA) اضافه شد و به یخچال انتقال یافت (درصورتی­که فاصله زمانی آزمایش طولانی باشد نمونه­ها باید در فریزر 20- درجه سانتی­گراد قرار داده شوند) (2، 5، 6، 9، 13 و 17).

PCR و تشخیص گونه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم:

    به منظور تأیید نمونه­ها از روش واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز استفاده شد. پرایمرهای استفاده شده اختصاصی ژن 16S rRNA در مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم بودند و این پرایمرها جهت شناسائی MG در کشت خالص و یا نمونه بالینی استفاده شده‌اند (3، 9، 10 و 11). پرایمرها عبارت بودند از:

 

توالی نوکلئوتیدی	نام پرایمر
5’-AACACCAGAGGCGAAGGCGAGG3’	MG-10F
5’-ACGGATTTGCAACTGTTTGTATTGG-3’	MG-11R

 

واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد و در تمامی موارد کنترل‌های مثبت و منفی همزمان استفاده شد و اجزاء آن عبارت بودند از:

Water                                         17.36µl

PCR Buffer (10X)                      2.50 µl

dNTP (10mM)                                         0.75 µl

F primer (20 pmole/ µl)               0.15 µl

R primer (20 pmole/ µl)               0.15 µl

Taq DNA polymerase (5U/ µl)     0.10 µl

MgC12 (50mM)                         2.00 µl

Template DNA                             1.94 µl

 

 

 

 

 

 

تمامی واکنش­ها در ترموسایکر Gradient Mastercycler (Eppendroff، آلمان) انجام گرفت و برنامه آن به­صورت زیر

بود:

جداشدن اولیه DNA	94C	5min
30 سیکل شامل جداشدن، جفتشدن و طویل شدنDNA	94C 58C 72C	30sec 60sec 30sec
طویل شدن انتهائی	72C	10min

الکتروفورز:

قالب ژل آگاروز

     صفحات شیشه‌ای، شانه و تیغه‌های کناری با استفاده از یک ماده شوینده کاملاً تمیز شد (ضخامت شانه و تیغه کناری باید یکسان باشد) و با استفاده از آب مقطر دیونیزه آبکشی گردید. صفحات شیشه‌ای با استفاده از اتانول 95 درجه کاملاً آبگیری و در مجاورت هوا خشک شد. قالب ژل از طریق قرار دادن تیغه‌های کناری در سطح داخلی صفحه پشتی و سپس قرار دادن صفحة رویی بر روی تیغه‌ها بسته شد. به­طوریکه تیغه‌ها کمی خارج‌تر از لبه پلیت‌های شیشه‌ای قرار داده شد به­طوری­که پس از قرار دادن صفحة شیشه‌ای رویی تیغه‌ها به آرامی فشار داده شد تا در جای خود بین دو صفحه قرار گیرند. اطراف و زیر قالب با استفاده از یک نوار چسب با کیفیت خوب آب‌بندی شد. نشت نکردن نوار چسب‌ها پس از افزودن ژل آگاروز بسیار اهمیت دارد (1).

آماده کردن مخلوط ژل آگاروز:

     جهت شناسائی و رویت محصول PCR از الکتروفورز (Apelex، فرانسه) نمونه‌ها در روی ژل آگاروز 1% و بافر 1% TAE استفاده شد. برای تهیه 1% TAE از 25% TAE
(Tris base , Acetic acid and ETDA) استفاده شد
به­طوریکه 20 میلی­لیتر از این محلول با 480 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط گردید. برای آماده کردن ژل  ابتدا 35/0 گرم از ژل آگاروز (Roche،Agarose MP) در 35 میلی‌لیتر از بافر 1% TAE در یک ارلن ریخته شد و با استفاده از حمام آب­جوش حرارت داده شد. حرارت دادن تا حل شدن کامل آگاروز ادامه یافت. پس از سردشدن دمای آن به حدود 50 درجه ، 1.7 لاندا اتیدیوم بروماید (ETBr) به آن اضافه شد (این نسبت­ها برای یک کست حاوی ژل 15 گودی کافی می­باشد). سپس محلول با دقت و به آرامی و بدون ایجاد حباب هوا در قالب ژل ریخته شد. برای این منظور از حذف­کننده حباب­های هوا
(Air bubble remover) استفاده گردید. از ترازسنج جهت یکنواخت پخش شدن ژل در تمام سطوح تانک الکتروفورز استفاده گردید. سپس در ژل و در محل خود قرار داده شد و تا جامدشدن کامل، ژل در دمای اتاق قرار گرفت. پس از آن شانه خارج و ژل در دستگاه الکتروفورز قرار گرفت و محلول 1% TAE تا پوشاندن کامل سطح ژل در تانک ریخته شد. µl 10 از محصول PCR با دو میکرولیتر از بافر بارگذاری (Loading buffer) مخلوط (محلول x1) و در گوده‌های ژل قرار داده شد. پس از اتمام بارگذاری نمونه‌ها، الکترودها به منبع تغذیه متصل شده، ژل در جریان ثابت 100 ولت به مدت 45 دقیقه قرار گرفت. ژل روی دستگاه UV
(BioRAD, Bio-Rad Lab.-California, USA) قرار گرفته و از آن عکس تهیه شد (13).

نتایج

نتایج حاصل از تست RSAT :

     از 372 نمونه سرمی اخذ شده از 26 فارم، 17 فارم در تست RSAT مثبت شدند. این 17 فارم شامل 3 فارم مادر گوشتی و 14 فارم تخم گذار تجارتی بود. به­طورکلی از 372 نمونه اخذ شده، 137 نمونه در تست RSAT مثبت، 202 نمونه منفی و از 33 نمونه سرمی مشکوک، 10 نمونه در رقت یک هشتم مثبت اعلام گردیدند.

نتایج حاصل از کشت:

از 510 نمونه جمع آوری شده از 17 فارم با تعداد 30 نمونه از هر فارم، 254 نمونه مثبت معادل 8/49% مایکوپلاسما      گالی­سپتیکوم جداسازی گردید. از 17 فارم، 3 فارم باکتری مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم جداسازی نگردید. معمولاً اولین نشانه­های رشد و تغییر رنگ در محیط مایع حدود روز پنجم مشاهده می­شد. اگر چه در برخی موارد شواهد رشد در نمونه­ها تا روز بیست و دوم نیز رویت نشد. در مجموع محدوده زمانی که نمونه­های اصلی شواهد تغییر رنگ و رشد را نشان می­دادند بین روزهای پنجم تا بیست و پنجم بعد از نمونه­برداری ثبت شد و نمونه­هایی که تا روز بیست و پنجم مثبت نشده بودند در ادامه انکوباسیون نیز تغییر رنگی نشان ندادند. به­دنبال تغییر رنگ محیط کشت از قرمز به زرد که ناشی از تخمیر گلوکز و کاهش PH محیط می­بود، نمونه به­عنوان مثبت فرض شده و مراحل زیر جهت تأیید و خالص­سازی انجام گرفت (1). پاساژ نمونه مثبت به محیط مایع جدید و محیط جامد (2) ذخیره­سازی با استفاده از گلیسرول 5% در فریزر 70 درجه سانتی­گراد زیر صفر (3) بررسی حضور MG در محیط کشت مایع. در صورت تأیید حضور MG در محیط آبگوشت، محیط جامد در انکوباتور CO2 و با رطوبت بالا قرار می­گرفت تا رویت پرگنه انجام گیرد. پس از رویت پرگنه مایکوپلاسما، یک پرگنه انتخاب و به محیط مایع منتقل و پس از رشد و تغییر رنگ محیط، جدایه با استفاده از PCR تأیید می­شد.

نتایج حاصل از 16S rRNA PCR و تشخیص گونه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم:

     به منظور تأیید نمونه­ها از روش PCR استفاده گردید. پرایمرهای استفاده شده کاملاً اختصاصی گونه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم بودند (3، 9، 10 و 11) به­طوری­که محصول PCR تولید شده در تمام نمونه­ها و سویه استاندارد ts-11، یک قطعه 530 جفت بازی را تشکیل می­داد که مشخص کننده مایکوپلاسما گالی سپتیکوم بود. از 109 نمونه اخذ شده از 10 فارم، 46 نمونه معادل 2/42 درصد در PCR باند 530 جفت بازی را بر روی ژل آگاروز نشان دادند. پرایمرهای استفاده شده کاملاً اختصاصی گونه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم بودند (16) به­طوری­که محصول PCR تولید شده در تمام نمونه­ها و سویه استاندارد ts-11، یک قطعه 530 جفت بازی را تشکیل داد.  اختصاصیت این تست با توجه به مطالعه قبلی محققین می­باشد (نگاره 1) (3، 9، 10 و 11).  

 

530

 

 

M  1  2  3   4    5  6  7  8   9  10  11 12

 

 

نگاره1- محصول PCR ژن 16S rRNA با استفاده از پرایمرهای 10F MG- و MG-11R.

M: Gene Ruler 100bp plus DNA Ladder. Lane 1: ts-11، واکسن: Lane 2:کنترل منفی

 جدایه­های فیلدی:  Lane 3-12

 

بحث و نتیجه‌گیری

     با توجه به اهمیت بیماری مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم از جنبه اقتصادی و با توجه به ایجاد بیماری مزمن تنفسی (CRD) و با در نظر گرفتن تحمیل هزینه­های درمانی دو چندان و عدم پاسخ­دهی مناسب و عدم بروز حداکثر عملکرد پرندگان آلوده به این باکتری، استفاده از روش­های مبتنی بر شناسایی DNA برای تشخیص MG به­طور مستقیم از بافت یا جدایه‌های آزمایشگاهی ضروری به نظر می­رسد (1). اگرچه می‌توان از پروب برای شناسائی MG استفاده نمود، اما روش
بسیار معمول، تکثیر قطعه اختصاصی از ژنوم باکتری است. برای این منظور کیت‌های تجاری نیز در دسترس هستند (1). روش­هایی برای تشخیص همزمان انواع مایکوپلاسما در نمونه‌های بالینی ابداع شده است که از آن جمله می‌توان به PCR چندگانه و PCR-RLFP اشاره کرد. نتایج PCR ظرف یک تا دو روز مشخص می‌شود، در حالی­که برای کشت و تعیین هویت ارگانیسم یک تا سه هفته زمان نیاز است. همچنین PCR قادر است نتایج دقیقی در حضور عفونت‌های مخلوط با چندین مایکوپلاسما، آلودگی با عفونت‌های باکتریایی ثانویه، مهارکننده‌های رشد مایکوپلاسما مثل آنتی بادی، آنتی بیوتیک، یا سایر عوامل میزبانی ارائه دهد (1 و 17). به­ویژه رشد مایکوپلاسماهای ساپروفیت که رشد سریعتری در محیط غنی شده نسبت به مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم دارند از مهم­ترین مشکلات کشت می‌باشد. شناسائی DNA ارگانیسم‌های غیر زنده مثلاً پس از درمان با آنتی­بیوتیک از معایب PCR است. در این مطالعه، به منظور  تأیید  نمونه­ها  از  روش  واکنش زنجیره‌ای  پلی­مراز  استفاده  شد. پرایمرهای استفاده شده اختصاصی ژن 16S rRNA در مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم بودند و این پرایمرها جهت شناسائی MG در کشت خالص و یا نمونه بالینی استفاده شده‌اند. با استفاده از این پرایمرها تمام سویه­های فیلدی، محصول PCR  530 جفت باز را تشکیل دادند (17). محصول PCR تولید شده توسط پرایمرهای اختصاصی 10F/11R تنها با مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم واکنش داده و با هیچکدام از 22 گونه مختلف مایکوپلاسما واکنش نمی دهد (17).

آزمون 16S rRNA-PCR جهت تشخیص گونه مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم با پرایمرهای اختصاصی MG-10F و
MG-10R با توجه به تشکیل باند 530 جفت بازی برای تمامی سویه­های فیلدی مورد استفاده در این مطالعه و سویه واکسینال ts-11 و نتایج حاصل از این مطالعه، می­تواند با حساسیت 100 درصد مورد استفاده قرار گیرد.

مراجع

1. حسینی، ح. (1385): مطالعات مولکولی جدایه­های مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم از طیور، رساله دکترای تخصصّی بیماری­های طیور، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، صفحات: 120-1.
2. Biomune. (2006):VECTORMUNE®FP-MG.http://www.biomune.company.com/chickens/vectormunefpmg.html.
3. Biro, J., Erdei, N., Szekely, I. and Stipkovits, L. (2006): Differentiation of mycoplasma gallisepticum strains using molecular methods. Acta Veterinaria Hungarica, 54: 437-448.
4. Bradbury, J.M. and Levisohn, S. Experimantal infections in poultry. In: Tully, J.G. (1996):  Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Volume II-Diagnostic Procedures, San Diego, CA: Academic Press. pp: 361-370.
5. Charlton, B.R., Bickford, A.A., Chin, R.P. and Walker, R.L. (1999): Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Mycoplasma gallisepticum isolates from turkeys from the central valley of California. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11:408-415.
6. Charlton, B.R., Bickford, A.A., Walker, R.L. and Yamamoto, R. (1999): Complementary randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis patterns and primer sets to differentiate Mycoplasma gallisepticum strains. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11: 158-161.
7. Collett, S.R. (2005): Monitoring broiler breeder flocks for mycoplasma gallisepticum infection after vaccination with ts- 11. Department of production animal studies, faculty of veterinary science, University of Pretoria, pp: 1-79.
8. Dennis, Y.M., Chiu, W.K. and Allen Chan, K.C. (2006): Clinical applications of PCR. Humana Press, pp: 4- 22.
9. Fan, H.H., Kleven, S.H. and Jackwood, M.W. (1995): Application of polymerase chain reaction with arbitrary primers to strain identification of Mycoplasma gallisepticum. Avian Dis., 39: 729-735.
10. Feberwee, A., Mekkes, D.R., de Wit, J.J., Hartman, E.G. and Pijpers, A. (2005): Comparison of culture, PCR, and different serologic tests for detection of mycoplasma gallisepticum and mycoplasma synoviae infections. Avian Dis., 49: 260-268.
11. Garcia, M., Ikuta, N., Levisohn, S. and Kleven, S.H. (2005): Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens. Avian Dis., 49: 125-32.
12. Gharaibeh, S. and Al Roussan, D. (2008): The use of molecular techniques in isolation and characterization of mycoplasma gallisepticum from commercial chicken in Jordan. Int. J. Poult. Sci., 7(1): 28-35.
13. Kempf, I., Blanchard, A. Gesbert, F. Guittet, M. and Bennejean, G. (1993): The polymerase chain reaction for Mycoplasma gallisepticum infection. Avian Pathol., 22: 739-750.
14. Khan, M.I. (2002): Multiplex PCR of Avian Pathogenic Mycoplasmas, in PCR Detection of Microbial Pathogens, by Joachim, Frey, Konard, Sachse Humana Press, pp: 223.
15. Kleven, S.H. (2008): Control of avian mycoplama infections in commercial poultry. Avian Dis., 52: 367-374.
16. Kleven, S.H. Mycoplasmosis. In: Saif, Y.M., Barnes, H.J., Gilsson, J.R., Fadly, A.M., Mc Dongald, L.R. and swayne, D.E. (2008): Diseases of Poultry. 12^th ed., Iowa state university press, USA, pp: 805-808.
17. OIE terrestrial manual. (2008): Avian mycoplasmosis, chapter 2.3.5. pp: 482-496.