بررسی شیوع سرمی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب‌های تعدادی از اسب‌داری‌های تهران با استفاده از روش آگلوتیناسیون میکروسکوپی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 8، دوره 9، 4 (36) زمستان، بهمن 1394، صفحه 347-365   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

محمدرحیم حاجی‌حاجیکلایی^{* 1}؛ علیرضا نفیسی مظفر²؛ صمد لطف الله زاده³؛ مسعود قربانپور⁴؛ غلامرضا عبدالله پور³

¹استاد ﮔﺮوه ﻋﻠﻮم درﻣﺎﻧﮕﺎﻫﻲ، داﻧﺸﻜﺪه داﻣﭙﺰﺷﻜﻲ، داﻧﺸﮕﺎه ﺷﻬﻴﺪ چمران اهواز، اهواز، ایران.

²داﻧﺶ‌آﻣﻮﺧﺘﻪ داﻧﺸﻜﺪه داﻣﭙﺰﺷﻜﻲ، داﻧﺸﮕﺎه ﺷﻬﻴﺪ ﭼﻤﺮان اهواز، اهواز، ایران.

³دانشیار ﮔﺮوه ﻋﻠﻮم درﻣﺎﻧﮕﺎﻫﻲ، داﻧﺸﻜﺪه داﻣﭙﺰﺷﻜﻲ، داﻧﺸﮕﺎه تهران، تهران، ایران.

⁴استاد گروه پاتوبیولوی، داﻧﺸﻜﺪه داﻣﭙﺰﺷﻜﻲ، داﻧﺸﮕﺎه ﺷﻬﻴﺪ چمران اهواز، اهواز، ایران.

چکیده

   به­منظور بررسی سرولوژیکی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس از تعداد 152 رأس اسب متعلق به 7 واحد اسب­داری واقع در اطراف تهران، نمونه­گیری به­عمل آمد. برای مشخص شدن پادتن ضد لپتوسپیرا اینتروگانس از روش آگلوتیناسیون میکروسکوپی با استفاده از 5 سروتیپ زنده لپتوسپیرا اینتروگانس (گریپوتیفوزا، پومونا، ایکترهموراژیه، کانیکولا و هارجو) استفاده شد. از 152 رأس اسب تحت مطالعه، 23 رأس (13/15 درصد) به یک یا چند سروتیپ آلوده بودند. اسب­های آلوده تیتر سرمی 1:100 الی 1:200 داشتند. بیشترین آلودگی مربوط به ایکترهموراژیه (44/44 درصد) بود و بعد از آن به ترتیب گریپوتیفوزا (62/29 درصد)، کانیکولا (22/22 درصد)، پومونا (7/3 درصد) و هارجو (صفر درصد) قرار داشتند. بررسی­های آماری با استفاده از روش مربع­کای نشان داد که بین آلودگی و فاکتور­­هایی مانند جنس و سن هیچ ارتباط معنی­داری وجود ندارد. اسب­های آلوده دارای تیتر سرمی 1:100 (19 رأس) و 1:200 (8 رأس) بودند. نتایج این مطالعه نشان داد که لپتوسپیرا اینتروگانس سروتیپ ایکترهموراژیه به عنوان سروتیپ غالب در بین اسب­های تهران می­باشد. 

کلیدواژه‌ها

لپتوسپیرا اینتروگانس؛ اسب؛ آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپی؛ شیوع سرمی؛ تهران

اصل مقاله

مقدمه

   لپتوسپیروز بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که توسط سروتیپ­های مختلف لپتوسپیرا اینتروگانس ایجاد می­شود. این بیماری انتشار جهانی دارد و بیشتر در مناطق آب­و­هوایی گرم و مرطوب به‌خصوص در فصول بارانی اتفاق می­افتد.

   نشانه­های بالینی بیماری در اسب سقط، چشم­درد راجعه (Equine recurrent uveitis; ERU)، تب به‌همراه بی‌اشتهایی، بی­حالی، زردی، اختلال در عملکرد کبد و نارسایی شدید کلیوی می­باشد. در کره اسب­ها لپتوسپیروز حاد عموماً با همولیز و التهاب عروق همراه با خونریزی­های پتشی در مخاطات، هموگلوبینوری، آنمی، زردی، افسردگی و بی­حالی همراه می­باشد. در مرحله حاد بیماری، لکوسیتوز و نوتروفیلی و افزایش بیلی­روبین مشاهده می­شود (Sellon and Long 2007; Bolin 2010; Radostits et al., 2007). سروتیپ­های متعددی ممکن است عامل سقط باشند. به‌طوری­که سروتیپ­های پومونا، گریپوتیفوزا، کنویکی و براتیسلاوا از جنین­های سقط شده در اسب­های ایالت کنتاکی در کشور آمریکا گزارش شده است (Radostitis et al., 2007). معمولاً سقط 1 الی 3 هفته پس از علائم خفیف و غیر­اختصاصی در مادیان مشاهده می­شود. مادیان سقط کرده دارای تیتر بسیار بالای پادتن علیه لپتوسپیرا اینتروگانس در زمان سقط می­باشند (Bolin, 2010).از مهم­ترین نشانه­های بالینی اسب­های مبتلا به این بیماری چشم­درد راجعه است که دارای اسامی دیگر مانند چشم­درد دوره­ای (Periodic ophtalmia)، شب­کوری (Moon blindness)، التهاب راجعه عنبیه و جسم مژگانی (Recurrent iridocyclitis) می­باشد. در اسب به نظر می­رسد پادتن­های تولیدی علیه لپتوسپیرا اینتروگانس با آنتی­ژن­های بافت چشم (پروتئین 52-k-Da) واکنش متقاطع داشته و باعث بروز چشم دردهای دوره­ای می­شوند. در اسب­هایی که درگیر بیماری به صورت سیستمیک هستند، پس از ماه­ها حتی تا سال­ها بعد از آن رخ می­دهد. حمله دوباره به چشم معمولاً باعث کوری در هر دو چشم می­گردد. علائم بالینی در اسب شامل ترس از نور، ریزش اشک به صورت غیرطبیعی و اسپاسم پلک می­باشد. پرخونی ملتحمه چشم، ادم قرنیه، بسته­شدن مردمک چشم و تورم عنبیه وجود دارد. در صورت ادامه یافتن بیماری، خونریزی و چرک در اتاقک قدامی چشم، تجمع فیبرین در اتاقک قدامی چشم، میوزیس و چسبندگی عنبیه به قرنیه یا عدسی و پرخون شدن و رگ­زایی قرنیه مشاهده می­گردد. در صورت رنگ­آمیزی چشم با فلورسئین، قرنیه قابلیت نگه­داشتن رنگ را نخواهد داشت (Radostitis et al., 2007). اسب­هایی که دارای پادتن ضد لپتوسپیرا اینتروگانس بودند، 4/4 برابر بیشتر در معرض ابتلا به چشم درد دوره­ای قرار داشتند (Sellon and Longs 2007).

   لپتوسپیرا اینتروگانس به عنوان عامل خون­ریزی ریه در اسب نیز مطرح است. بررسی­ها نشان داده­است که خطر ابتلا به خون­ریزی ریه در اسب­های واجد پادتن ضد لپتوسپیرا اینتروگانس، 26/4 برابر بیشتر است (Hamond et al., 2011).

   سویه­های لپتوسپیرا اینتروگانس  تمایل زیادی برای چسبیدن به سلول­های اپتیلیال کلیه دارند. سویه­های لپتوسپیرا اینتروگانس نسبت به عوامل کمپلمان و کشته­شدن توسط نوتروفیل­ها در میزبان غیر­ایمن مقاومت دارند، ولی در حضور آنتی­بادی اختصاصی به سرعت از بین می­روند. به­دلیل این­که لپتوسپیرا اینتروگانس پس از ورود، از طریق جریان خون به سرعت در بدن منتشر می­شود و در محل ورود تجمع نمی­یابد، پاسخ التهابی در موضع به­وجود نمی­آید. در ابتدای ورود، بدن با سیستم هومورال سعی به مقابله با بیماری می­کند و به همین دلیل در دام­هایی که سیستم ایمنی هومورال آن­ها تکامل نیافته­است، نسبت به عفونت حساسیت بیشتری دارند (Fain et al., 1999).

   از روش­های مختلفی برای تشخیص لپتوسپیروز استفاده می­شود. از روش رنگ­آمیزی باکتری بیشتر به منظور نشان دادن باکتری در نمونه ادرار، خون و بافت‌های دام­های تلف شده استفاده می­شود. از این بافت­ها به­خصوص به کبد و کلیه می­توان اشاره کرد (Walker, 2004).کشت باکتری روشی پرهزینه و مشکل بوده و مدت زمان طولانی احتیاج دارد. علاوه بر این، به فرد ماهری جهت انجام آزمایش نیاز دارد. حساسیت این آزمایش پایین و ویژگی آن بالا است. نمونه­گیری بایستی از خون، مایع مغزی-نخاعی، ادرار و بافت­های بدن مثل کلیه، البته قبل از تجویز آنتی­بیوتیک، انجام شود (WHO, 2003). رشد لپتوسپیرا اینتروگانس به­خصوص آن­هایی که از دام­های بیمار جدا شده­اند، بسیار آهسته می‌باشد، به­طوری که حدود 3 تا 13 هفته بسته به شرایط محیط کشت به طول می­انجامد (Faine et al., 1999).

تست آگلوتیناسیون میکروسکوپی(Microscopic agglutination test; MAT)

   رایج­ترین روش سرولوژیکی مورد استفاده جهت تشخیص لپتوسپیرا اینتروگانس می­باشد. در حیواناتی که از بیماری جان سالم به­در می­برند، فرم حاد لپتوسپیروز می­تواند با افزایش تیتر پادتن در سرم تشخیص داده شود. معمولاً 2 نمونه سرمی جهت ردیابی افزایش تیتر مورد نیاز است. در موارد سقط و مرده­زایی آلودگی معمولاً 1 تا 4 هفته قبل از سقط رخ می­دهد که در آن زمان تیتر آزمایش MAT ممکن است کاهش یابد. در ابتدای بیماری افزایش IgM و سپس IgG افزایش می‌یابد که IgG بقای بیشتری دارد. آزمایش MAT هم IgM و هم IgG را ردیابی می­کند. تیتر MAT‌ بیشتر از صد، مثبت می­باشد. حساسیت این تست برای تشخیص IgM از IgG بیشتر است. این تست جهت اندازه­گیری ایمنی علیه واکسیناسیون مناسب نمی­باشد، به این علت که بیشتر پاسخ IgG وجود دارد. تیتر MAT‌ در موارد میزبان­های اتفاقی و تصادفی مثل پومونا، بسیار بالا حتی تا 3000 و بیشتر از آن است (Radostitis et al., 2007).از روش­های دیگری مانند ELISA، تست پادتن درخشان (Florescent antibody test; FAT)، آگلوتیناسیون بر روی لام (Slide agglutination test; SAT)، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (Polymerase Chain Reaction; PCR) نیز برای تشخیص آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس استفاده می­شود (Radostitis et al., 2007).

   لپتوسپیرا اینتروگانس دارای بیش از 200 سروتیپ می­باشد که در 23 سروگروپ دسته­بندی شده­اند. این سروتیپ­ها نسبت به همدیگر ایمنی متقاطع ایجاد نمی­کنند. پاسخ ایمنی بدن در برابر یک سروتیپ مختص همان سروتیپ می‌باشد (Radostitis et al., 2007). با توجه به تنوع سروتیپ­ها و اینکه در هر منطقه سروتیپ­های خاصی حضور دارند که باعث ایجاد بیماری در دام­های همان منطقه می­شوند، لذا جهت شناسایی این سروتیپ­ها باید مطالعات اولیه­ای صورت گیرد تا بر مبنای آن اقدامات مقتضی جهت کنترل و پیشگیری مانند طراحی واکسن حاوی سروتیپ­های شایع به­عمل آید. هدف از انجام این مطالعه بررسی آلودگی اسب­های تعدادی از اسب­داری­های اطراف تهران به لپتوسپیرا اینتروگانس و تعیین سویه­های غالب آن بوده است.

 

مواد و روش­ها

نمونه­برداری: نمونه خون از تعداد 152 رأس اسب متعلق به 7 واحد اسب­داری واقع در اطراف تهران اخذ شد که اطلاعات این اسب‌داری­ها در جدول 1 ارائه شده است.

 

 

   جدول 1- تعداد اسب­داری­های تحت مطالعه، تعداد اسب­های موجود در آن­ها و تعداد اسب­های تحت مطالعه در هر اسب­داری

شماره اسب­داری	تعداد اسب­های نمونه­گیری شده	تعداد کل اسب­ها	درصد نمونه­گیری
1	37	45	22/82
2	20	35	14/57
3	23	400	75/5
4	10	10	100
5	35	38	1/92
6	23	30	66/76
7	4	15	66/26

  

 

   هنگام خون­گیری، اسب­های تحت مطالعه درون باکس­های انفرادی مخصوص معاینات اسب قرار گرفته و توسط لواشه بر روی گوش مقید می­گشتند. پس از ضد­عفونی کردن موضع خون­گیری (ورید وداج) توسط الکل، خون­گیری به­وسیله لوله­های ونوجکت انجام می‌شد. پس از اخذ نمونه خون، لوله مورد نظر کدگذاری شده و کد آن در فرم مخصوص ثبت مشخصات درج می­شد. آن­گاه نمونه­ها داخل فلاسک حاوی یخ قرار داده شده و به آزمایشگاه منتقل گشته پس از گذشت 1 الی 2 ساعت توسط سواب، اتصالات لخته از جدار لوله­ها جدا و لوله­ها با 2500 دور در دقیقه به مدت 8 دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس سرم آن توسط سمپلر به آرامی از قسمت رویی برداشت شده و به میکروتیوبی که قبلاً‌ کدگذاری و کد آن ثبت شده بود، منتقل می­شد. به­منظور نگه­داری کوتاه مدت، میکروتیوب­ها به یخچال 4 درجه سلسیوس و به­منظور نگه­داری بلند مدت، به فریزر 20- درجه سلسیوس منتقل و چند ساعت قبل از انجام آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپیک (MAT) که در آزمایشگاه تحقیقات لپتوسپیروز در دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران انجام گرفت، میکروتیوب­ها در دمای محیط قرار داده می‌شدند، تا نمونه­های سرمی از حالت جامد به حالت مایع تبدیل شوند.

آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپیک (MAT)

   اولین قدم به­منظور انجام آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپیک، ‌آماده­سازی آنتی­ژن­ها می­باشد. برای این منظور از کشت خالص و زنده 5 تا 7 روزه باکتری که در محیط EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) به­طور منظم هر هفته کشت فرعی داده می­شد، استفاده شد. از 5 ‌سروتیپ رایج در ایران شامل گریپوتیفوزا، پومونا، ایکترهموراژیه، کانیکولا و هارجو با تراکم استاندارد 10⁸×2 در هر میلی­لیتر استفاده شد. تراکم باکتری با استفاده از لام مخصوص شمارش لپتوسپیرا اینتروگانس  محاسبه گردیده و رقت آنالیز با اضافه کردن محلول PBS (Phosphate-buffered saline) در حد مورد نظر تنظیم شد.

   قبل از شروع آزمایش بایستی هر نمونه سرم به رقت 1:50 می­رسید که برای این منظور ابتدا با استفاده از سمپلر 1000 میکرولیتر از محلول PBS‌ در یک میکروتیوب ریخته و همچنین از نمونه سرمی اولیه به میزان 20 میکرولیتر برداشته و به میکروتیوب جدید اضافه و با هم مخلوط ­شدند.

   به منظور آزمایش MAT ابتدا توسط یک سمپلر، 10 میکرولیتر از آنتی­ژن با 10 میکرولیتر از هر یک از سرم­های رقیق شده بر روی لام ریخته شده سپس با هم­دیگر مخلوط شدند. رقت نهایی در این مرحله برای هر سرم 1:100 به­دست آمد. به منظور جلوگیری از خشک شدن مخلوط آنتی­ژن-سرم، هر لام سریعاً پس از پایان مراحل کار در بواتی که داخل آن کاغذ مرطوب با آب مقطر وجود داشت، بر روی 2 پایه شیشه­ای قرار ­گرفته و درب بوات بسته ­شد. بوات دوپتری به­مدت 90 دقیقه در گرم­خانه­ای که دمای آن 30 درجه سلسیوس بود، قرار داده ­شد. پس از گذشت زمان لازم، بوات از گرم­خانه خارج گشته و لام درون آن خارج شده و سطح زیرین آن توسط پارچه­ای تمیز خشک شده و لام زیر میکروسکوپ زمینه تاریک قرار ­گرفت. هر نمونه آنتی­ژن- سرم با استفاده از کندانسور زمینه تاریک و با بزرگ­نمایی ×100 بررسی ­شد. به­منظور کنترل آزمایش، در ابتدای ‌آزمون کنترل مثبت و منفی تهیه ­شد. کنترل منفی سرم حاوی 10 میکرولیتر آنتی­ژن و 10 میکرولیتر سرم کاملاً منفی، کنترل مثبت حاوی 10 میکرولیتر آنتی­ژن و 10 میکرولیتر سرم کاملاً مثبت و کنترل آنتی­ژن حاوی 10 میکرولیتر آنتی­ژن و 10 میکرولیتر محلول بافر فسفات بود که جهت کنترل آگلوتیناسیون خود­به­خودی به کار می­رفت. قبل از تفسیر نتایج، نمونه­ها کنترل مورد بررسی قرار ­گرفت.

   در تفسیر آزمایش از +1 تا +4 امتیازدهی ­گردید که به شرح زیر می­باشد: در صورتی که 25 درصد اجرام باکتریایی آگلوتینه و 75 درصد دیگر به صورت آزاد و متحرک بودند درجه آگلوتیناسیون +1 در نظر گرفته ­شد. در صورتی که 50 درصد اجرام باکتریایی آگلوتینه و 50 درصد دیگر به صورت آزاد و متحرک بودند، درجه آگلوتیناسیون +2 در نظر گرفته ­شد. در صورتی که 75 درصد اجرام باکتریایی آگلوتینه و 25 درصد دیگر به صورت آزاد و متحرک بودند، درجه آگلوتیناسیون +3 در نظر گرفته ­شد. در صورتی که تمامی اجرام باکتریایی آگلوتینه و هیچ باکتری آزادی وجود نداشت درجه آگلوتیناسیون +4 در نظر گرفته ­شد. براساس استاندارد درجه +1 منفی، +2 مشکوک، +3 و +4 نیز در رقت 1:100 مثبت در نظر گرفته شدند. بعد از این مرحله نمونه­هایی که مثبت بودند، عیارسنجی و تیتر آنتی­بادی آن­ها تعیین ­شد. به­منظور تهیه رقت­های سرمی دو برابر از 1:100 تا 1:800 در مورد نمونه­هایی که در مرحله اول مثبت بودند، به روش زیر عمل شد:

   در یک پلیت 96 گوده­ای ته گرد در 4 ردیف آن، در هر گوده 100 میکرولیتر محلول PBS ریخته ­شد. سپس از سرم اولیه با رقت 1:50 به میزان 100 میکرولیتر در گوده اول ریخته و مخلوط ­گردید. سپس از گوده اول نیز 100 میکرولیتر برداشته و به گوده دوم اضافه و مخلوط ­گردید. این عمل تا گوده چهارم ادامه پیدا کرد تا از گوده چهارم نیز پس از مخلوط کردن، میزان 100 میکرولیتر را برداشته و دور ریخته شد. با این عمل در گوده­ها به ترتیب رقت های 1:100، 1:200، 1:400 و 1:800 به­دست ­آمد. به­منظور انجام آزمایش MAT روی هر کدام از این رقت­ها، مشابه مرحله اول رفتار شد. بالاترین رقتی که در آن حداقل واکنش +3 مشاهده ­شد، تیتر نهایی پادتن در آن نمونه سرم در نظر گرفته شد.

تحلیل آماری داده­ها

       نتایج با استفاده از آزمون مربع کای (Chi-Square) و آزمون دقیق فیشر (Fisher's Exact Test) با درجه اطمینان 95 درصد مورد واکاوی آماری قرار گرفتند.

 

یافته­ها

   از مجموع 152 رأس اسب مورد مطالعه متعلق به 7 واحد اسب­داری از اطراف تهران، که به منظور ردیابی پادتن علیه 5 سروتیپ لپتوسپیرا اینتروگانس مورد آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپی قرار گرفتند، 23 نمونه (13/15 درصد) مثبت و عیار سرمی برابر یا بیشتر از 1:100 داشتند. پراکندگی آلودگی به سروتیپ­های مختلف نشان داد که ایکترهموراژیه با 44/44 درصد دارای بیشترین پراکندگی و پس از آن به­ترتیب گریپوتیفوزا با 62/29 درصد، کانیکولا با 22/22 درصد و پومونا با 7/3 درصد دارای پراکندگی بودند. پادتن ضد سروتیپ هارجو در سرم هیچ­کدام از اسب­ها وجود نداشت. هم‌چنین برخی از نمونه­ها به چند سروتیپ آلوده بودند، به­طوری­که 4 نمونه به 2 سروتیپ و 19 نمونه به 1 سروتیپ آلودگی داشتند. نتایج عیار سنجی نشان داد که عیار سرمی 1:100 به میزان 35/70 درصد و 1:200 به میزان 61/29 درصد بود (جدول 2).

 

 

جدول 2- نتایج عیارسنجی پادتن علیه سروتیپ­های مختلف در سرم اسب­های مورد مطالعه با روش MAT

	عیار پادتن سروتیپ	1:100		1:200		جمع
		تعداد	درصد	تعداد	درصد	تعداد	درصد
	گریپوتیفوزا	5	51/18	3	10/11	8	62/29
	پومونا	-	-	1	7/3	1	7/3
	ایکترهموراژیه	8	62/29	4	81/14	12	44/44
	کانیکولا	6	22/22	-	-	6	22/22
	هارجو	-	-	-	-	0	0
	جمع	19	35/70	8	61/29	27	100

 

  

 

فراوانی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­داری­های شماره 1 الی 7 به ترتیب 8/10، 10، 39/17، 08/26، 30، 42/11 و صفر درصد بود. بررسی­های آماری نشان داد بین اسب­داری­های مختلف از نظر میزان آلودگی سرمی به لپتوسپیرا اینتروگانس اختلاف معنی‌داری وجود ندارد (423/0p=). فراوانی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­ها بر حسب جنس نشان داد که اسب­های نر و ماده به ترتیب 3/12 و 7/15 درصد آلوده می­باشند (جدول 3). تحلیل آماری داده­ها نشان داد بین این دو گروه سنی اختلاف آماری معنی‌داری وجود ندارد (498/0p=).

 

 

جدول 3- مقایسه آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های نر و ماده اسب­داری­های اطراف تهران

آلودگی       جنس	مثبت (درصد)	منفی(درصد)	جمع کل
نر	(3/12%)9	(7/87%)54	63
ماده	(7/15%)14	(3/84%)75	89
جمع کل	(13/15%)23	(86/84%)129	152

 

 

   بررسی فراوانی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­ها در سنین مختلف نشان داد که در گروه­های مختلف سنی زیر 1 سال، 5-1 سال، 10-6 سال و بالاتر از 10 سال به ترتیب 4/15، 6/14، 8/18 و 4/7 درصد است (جدول 4). مقایسه فراوانی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس بر حسب سن نشان داد که بین میزان آلودگی و سن ارتباط معنی­داری وجود ندارد (589/0p=).

 

 

جدول 4- مقایسه فراوانی آلودگی به  لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های اسب­داری های اطراف تهران بر حسب سن

جمع	منفی (درصد)	مثبت (درصد)	آلودگی سن
13	(6/84%)11	(4/15%)2	زیر 1 سال
48	(4/85%)41	(6/14%)7	5-1 سال
64	(3/81%)52	(8/18%)12	10-6 سال
27	(6/92%)25	(4/7%)2	بالاتر از 10 سال
152	(86/84%)129	(13/15%)23	جمع

 

 

 

 

 

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

   لپتوسپیروز یکی از بیماری­های زئونوز با پراکندگی جهانی می­باشد که توسط سروتیپ­های  لپتوسپیرا اینتروگانس ایجاد می­شود. این بیماری تقریباً تمام پستانداران را آلوده می­کند و طیف وسیعی از نشانه­های تحت بالینی تا فوق حاد را ایجاد می­کند و می­تواند منجر به مرگ شود (Radostits et al., 2007). مطالعات صورت گرفته روی این بیماری عمدتاً بر پایه سرولوژی می­باشد. این مطالعه نیز با استفاده از آزمایش سرولوژی به ارزیابی میزان فراوانی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های اسب­داری­های اطراف تهران پرداخته است. از بین آزمایشاتی که برای پی بردن به آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس با استفاده از ردیابی پادتن ضد آن در سرم خون انجام می­گیرد، آزمایش MAT به عنوان آزمایش استاندارد یا طلایی مطرح است و سایر روش­ها نیز در مقایسه با این روش مورد ارزیابی قرار می­گیرند. در این روش از سروتیپ­های زنده لپتوسپیرا اینتروگانس استفاده می­شود. به­دلیل وجود انواع مختلف سروتیپ­های این باکتری، معمولاً در ارزیابی آلودگی دام­های هر منطقه از سروتیپ­های شایع آن منطقه استفاده می­گردد. با توجه به مطالعات گذشته که روی دام­های مختلف در ایران انجام گرفته ­است، پنج سروتیپ گریپوتیفوزا، پومونا، ایکترهموراژیه، کانیکولا و هارجو از شایع­ترین آن­ها می­باشند. لذا در این مطالعه از این پنج سروتیپ زنده استفاده گردید. نتایج حاصل از مطالعه حاضر که با استفاده از روش MAT و پنج سروتیپ زنده لپتوسپیرا اینتروگانس انجام گرفت، مشخص گردید که 13/15 درصد اسب‌های تحت مطالعه از 7 اسب­داری اطراف تهران به لپتوسپیرا اینتروگانس آلوده و دارای پادتن ضد حداقل یک سروتیپ از 5 سروتیپ مورد آزمایش می­باشند. در این بررسی 6/82 درصد نمونه‌های مثبت اسب­ها تنها به یک سروتیپ و 4/17 درصد به دو سروتیپ آلوده بودند. بررسی آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های سایر نقاط ایران نشان می­دهد که آلودگی در اسب­های اردبیل، آذربایجان شرقی، گنبد، ارومیه و خرم­آباد به ترتیب 7/7، 23/39، 12، 3/16 و 62/7 درصد گزارش شده است (رامین و همکاران، 1392؛Hassanpour and Safarmashaei, 2012; Jahed Dashliboron et al., 2013; Maleki et al., 2015; Haji Hajikolaei et al., 2006; Khousheh et al., 2012).

بررسی­های صورت گرفته در سایر کشورها نشان می­دهد که آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های آرژانتین 6/74 درصد، ایرلند 2/72 درصد، برزیل 54 درصد، کره جنوبی 25 درصد، کرواسی 2/37 درصد، مغولستان 7/16 درصد، لهستان 39 درصد و هندوستان 5/13 درصد می­باشد (Mayers 1976; Langoni et al., 2004; Rao et al., 1985; Jung et al., 2010; Turk et al., 2013; Arent and Kedzierska-Mieszkowska, 2013). این مطالعات نشان می­دهند که بین مناطق مختلف ایران و همچنین با سایر کشورها از نظر آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس تفاوت وجود دارد. این تفاوت را می­توان به وضعیت آب ­و ­هوای این مناطق، نگه­داری توام با سایر دام­ها، تعداد سروتیپ­هایی که در آزمایش MAT مورد استفاده قرار گرفتند و عوامل مدیریتی و بهداشتی محل نگه­داری اسب ها نسبت داد. بررسی­ها نشان می­دهند که بالا بودن میزان آلودگی سرمی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های یک منطقه جغرافیایی که در کنار حیوانات دیگر زندگی می­کنند، به­این علت است که  این حیوانات آلوده به سروتیپ­های عادت یافته­اند و باعث انتقال بیماری به اسب­ها می­شوند. عوامل مدیریتی و بهداشتی محل نگه­داری اسب­ها مهم­ترین نقش را در جلوگیری از ابتلا به لپتوسپیرا اینتروگانس ایفا می­کنند. اسب­هایی که با خاک و آب آلوده در تماس هستند، ریسک بالاتری در ابتلا به بیماری دارند (Barwick et al., 1998).

   در این مطالعه از بین سروتیپ­هایی که مورد آزمایش قرار گرفتند، ایکترهموراژیه با 44/44 درصد دارای بیشترین و پس از آن به ترتیب گریپوتیفوزا با 62/29 درصد، کانیکولا با 22/22 درصد و پومونا با 7/3 درصد پراکندگی بوده­اند. پادتن ضد سروتیپ هارجو در سرم هیچ­کدام از اسب­ها وجود نداشت.

سروتیپ غالب در اسب‌های خرم­آباد کانیکولا، اردبیل هارجو، آذربایجان­شرقی پومونا، گنبد کانیکولا، اهواز گریپوتیفوزا و ارومیه هارجو گزارش شده است (رامین و همکاران، 1392؛Haji Hajikolaei et al., 2006; Khousheh et al., 2012; Hassanpour and Safarmashaei, 2012; Jahed Dashliboron et al., 2013; Maleki et al., 2015). در مطالعات صورت گرفته در سایر کشورها نیز به سروتیپ غالب در اسب­های تحت مطالعه اشاره شده است، به­طوری­که سروتیپ غالب در اسب­های ایرلند براتیسلاوا، آرژانتین پومونا، برزیل ایکتروهموراژیه، کره جنوبی سجرو، کرواسی براتیسلاوا، مغولستان براتیسلاوا و هارجو، لهستان گریپوتیفوزا و هندوستان پومونا گزارش شده­اند (Ellis, 1983; Mayers, 1976; Langoni et al., 2004; Rao et al., 1985; Jung et al., 2010; Turk et al., 2013; Odontsetseg et al., 2005; Arent and Kedzierska-Mieszkowska, 2013). از بین سروتیپ­هایی که در آزمایش MAT مورد استفاده قرار می­گیرند، سروتیپی که دارای بیشترین فراوانی است را معمولاً به عنوان سروتیپ غالب در نظر می­گیرند و عمدتاً سروتیپ غالب یک منطقه با منطقه دیگر یا یک کشور با کشور دیگر متفاوت است و این بیانگر آن است که این سروتیپ به دام­های آن منطقه بیشتر عادت پیدا کرده است. میزبان­های لپتوسپیرا اینتروگانس را به دو دسته عادت­یافته و تصادفی دسته­بندی می­کنند. با آزمایشات سرولوژیکی یا MAT به­تنهایی نمی­توان به­طور قطع اعلام نمود که سروتیپ غالب در یک منطقه در میزبانی خاص عادت­یافته است، لذا نیاز به جداسازی باکتری از بافت کلیه و یا ادرار آن می­باشد چراکه، در میزبان­های عادت­یافته باکتری به مدت طولانی در بافت کلیه باقی­مانده و از طریق ادرار دفع می­شود (Radostits et al., 2007).

   با توجه به فراوانی آلودگی 13/15 درصدی اسب­های اسب­داری­های تهران به لپتوسپیرا اینتروگانس و با توجه به اینکه 35/70 درصد اسب­های آلوده تیتر پادتن برابر با 1:100 داشتند و حداکثر تیتر 1:200 بوده است، چنین نتیجه­گیری می‌شود که آلودگی به لپتوسپیرا اینتروگانس در اسب­های تهران اندمیک بوده و اسب­ها می­توانند در جا­به­جایی و انتقال آن به سایر دام­های اهلی و انسان نقش داشته باشند. از طرف دیگر، با توجه به­این­که از بین 5 سروتیپ  لپتوسپیرا اینتروگانس که مورد استفاده قرار گرفتند، آلودگی سرمی به 4 سروتیپ گریپوتیفوزا، پومونا، ایکترهموراژیه و کانیکولا وجود داشته است، لذا به­منظور کنترل و پیشگیری از شیوع لپتوسپیروز در اسب­ها پیشنهاد می­شود از واکسن­هایی استفاده شود که حتماً دارای این 4 سروتیپ باشند.

مراجع

• رامین، ع.ق.، ایران نژاد، س. و  عبداله­پور، غ. (1392). تعیین ابتلا سرمی تک سمی­ها به گونه­های لپتوسپیرا در ارومیه. نشریه علوم درمانگاهی دامپزشکی ایران، دوره 7، شماره 1، صفحات: 65-59.
  • Arent, Z.J. and Kedzierska-Mieszkowska, S. (2013). Seroprevalence study of leptospirosis in northern Poland. Veterinary Record, 172: 269-270.
  • Barwicka, R.S., Mohammeda, H.O., McDonoughb, P.L. and Whitea, M.E. (1998). Epidemiologic features of equine Leptospira interrogans of human significance. Preventive Veterinary Medicine, 36(2): 153-165.
  • Bolin, C. (2010). Generalized condition. In: The Merck Veterinary Manual. Kahn, C.M. editors. 10th ed., USA: Merck and CO., pp: 590-596.
  • Ellis, W.A., O'brien, J.J., Cassels, J.A. and Montgomery, J. (1983). Leptospiral infection in horses in Northern Ireland: Serological and microbiological findings. Equine Veterinary Journal, 15(4): 317-320.
  • Faine, S., Adler, B., Bolin, C. and Perolat, P. (1999). Leptospira and Leptospirosis. 2nd ed., Australia: Melbourne, MediSci, pp: 272-276.
  • Haji Hajikolaei1, M.R., Gorbanpour, M., Haidari, M. and Abdollapour, G.R. (2005). Comparison of leptospiral infection in the horse and donkey. Bulletin Veterinary Institute in Pulawy, 49: 175-178.
  • Hamond, C., Martins, M., Reis, J., Kraus, E., Pinna, A. and Lilenbaum, W. (2011). Pulmonary hemorrhage in horses seropositive to leptospirosis. Pesquisa Veterinária Brasileira (Brazilian Journal of Veterinary Research),31(5): 413-415.
  • Hassanpour, A. and Safarmashaei, S. (2012). Seroprevalence of leptospiral infection in horses, donkeys and mules in East Azerbaijan province. African Journal of Microbiology Research, 6(20): 4384-4387.
  • Jahed Dashliboron, O., Hassanpour, A. and Abdollahpour, G.R. (2013). Serological Study of Leptospirosis in Horses in Gonbad, Iran. Global Veterinaria, 10(1): 51-54.
  • Joung, B.Y., Lee, K.W. and Ha, T.Y. (2009). Seroprevalence of Leptospira spp. in clinically healthy racing horses in Korea. Journal of Veterinary Medicine Sciences, 72(2): 197-201.
  • Khousheh, Y., Hassanpour, A., Abdollahpour, G.R. and Moghaddam, S. (2012). Seroprevalence of Leptospira Infection in Horses in Ardabil-Iran. Global Veterinaria, 9(5): 586-589.
  • Langoni, H., Da Silva, A.V., Pezerico, S.B. and De Lima, V.Y. (2004). Anti-leptospirose agglutinins in equine sera, from São Paulo, Goias and Mato Grosso do Sul, Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 10(3): 207-218.
  • Maleki, S., Sookhtehzari, A. and Abdollahpour, G.R. (2015).  Seroepidemiologic Study of Horses Leptospirosis in Khorramabad, west Iran. Buletin Teknology Tanaman Bil, 12(1): 135-138.
  • Mayers, D.M. (1976). Serological studies and isolations of serotype hardjo and Leptospira biflexa strains from horses of Argentina. Journal of Clinical Microbiology, 3(6): 975-984.
  • Murray, P.R., Baron, E.J., Jorgenson, H.J., Pfaller, M.A. and Yolken, R.H. (2003). Manual of Clinical Microbiology. 8th ed., USA: Washington, D.C., ASM Press, pp: 809-823.
  • Odontsetseg, N., Boldbaatar, D., Mweene, A.S. and Kida, H. (2005). Serological prevalence of Leptospira interrogans serovar bratislava in horses in Mongolia. Veterinary Record, 157: 518-519.
  • Radostitis, O.M., Gay, C.C., Hinchcliff, K.W. And Constable, P.D. (2007). Diseases Associated With Bacteria. In: Veterinary Medicine, 10th ed., W.B. London: Saunders, pp: 1094-1123.
  • Rao, S.A., Rao, K.R., Ramakrishna, K. and Reddy, K.B. (1985). Serological and clinical evidence of leptospiral infection in horses. Indian Veterinary Journal, 62: 273-277.
  • Sellon, D.C. and Long, M.T. (2007). Equine Infectious Diseases. 2nd ed., USA: Saunders, pp: 301-309.
  • Turk, N., Milas, Z., Habus, J., Stritof Majetic, Z., Mojcec Perko, V., Barbic, Lj., et al. (2013). Equine leptospirosis in Croatia - occurrence of subclinical infections and abortions. Veterinarski Arhiv, 83: 253-262.
  • Walker, R.L. (2004).Veterinary Microbiology. 2nd ed., USA: Saunders, pp: 148-169.
  • World Health Organization. (2003). Human Leptospirosis: Guidance for diagnosis, surveillance and control. Printed in Malta, pp: 1-52.