مطالعه تاثیر حفاظتی نارینژنین بر آسیب پیش رس کبد در موش‌های صحرایی دیابتی شده با آلوکسان

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 4، دوره 10، 1 (37) بهار، خرداد 1395، صفحه 39-52   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

داریوش مهاجری^{* 1}؛ غفور موسوی²؛ رامین کفاشی الهی²؛ مهرداد نشاط قراملکی²

¹استاد گروه پاتوبیولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

²استادیار گروه علوم درمانگاهی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

چکیده

چکیده
   دیابت ملیتوس اختلالی متابولیکی است که از شیوع بالایی در سراسر جهان برخوردار می‌باشد. نارسایی کبدی از عوارض عمده بیماری دیابت می­باشد. داروهای بسیاری از سراسر جهان جهت مداوای افراد دیابتی توصیه شده‌اند. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات محافظتی نارینژنین بر آسیب پیش­رس کبدی در موش­های صحرایی دیابتی شده با آلوکسان می­باشد. تعداد 40 سر موش صحرایی نر ویستار به طور تصادفی در 4 گروه 10تایی شامل: 1- گروه شاهد سالم، 2-گروه سالم تیمار با نارینژنین، 3- گروه کنترل دیابتی و 4- گروه دیابتی تیمار با نارینژنین تقسیم شدند. دیابت تجربی نیز با تزریق داخل صفاقی تک دز آلوکسان (mg/kg 120) ایجاد گردید. موش­های گروه‌های 2 و 4 نارینژنین را به میزان mg/kg50 از راه خوراکی به صورت گاواژ، روزانه و به مدت 3 هفته دریافت کردند. به موش­های گروه­های شاهد متناظر (گروه‌های 1 و 3) نیز نرمال سالن  با حجمی برابر تزریق شد. در پایان دوره آزمایش، شاخص­های بیوشیمیایی عملکرد کبد در خون شامل آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز و آلکالین فسفاتاز و آلبومین، پروتئین تام و بیلی‌روبین تام و همچنین ماحصل پراکسیداسیون لیپیدی (مالون‌دی‌آلدئید) و فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در هموژنات بافت کبد موش­ها اندازه­گیری شد. همچنین، آسیب­شناسی بافتی جهت ارزیابی درجات مختلف آسیب کبد انجام شد. در موش‌های دیابتی، نارینژنین به‌ طور معنی‌داری میزان آنزیم‌های شاخص آسیب کبد و بیلی‌روبین تام را کاهش و سطوح آلبومین و پروتئین تام سرم را افزایش داد. همچنین، نارینژنین به ‌طور معنی‌داری میزان پراکسیداسیون لیپیدی را در موش‌های دیابتی کاهش و سطوح آنزیم­های آنتی‌اکسیدان ‌را در آنها افزایش داد. نتایج هیستوپاتولوژی کبد نیز با یافته‌های بیوشیمیایی در توافق بودند. نتایج بررسی حاضر نشان داد که نارینژنین با خاصیت آنتی­اکسیدانی خود از بروز آسیب‌های زود هنگام دیابتی کبد در موش­های صحرایی جلوگیری می­کند.

کلیدواژه‌ها

نارینژنین؛ استرس اکسیداتیو؛ دیابت؛ آلوکسان؛ کبد؛ موش صحرایی

اصل مقاله

مقدمه

   دیابت نوع 2 به­عنوان یک مسئله بهداشت جهانی همچنان رو به افزایش بوده و  شایع­ترین نوع دیابت به‌شمار می­آید (Alberti and Zimmet, 1998). بیماری دیابت یک اختلال مزمن در متابولیسم کربوهیدرات‌ها، چربی و پروتئین بوده و باعث افزایش سطح قند خون می‌شود که در پی آن آسیب‌های جدی را در عروق و بافت های مختلف بدن سبب می‌گردد (Kesari et al., 2006). اگرچه پاتوژنز دیابت نوع 2 به­طور دقیق مشخص نشده است، لکن مدارک موجود اختلال در متابولیسم گلوکز و چربی را در این امر دخیل می­دانند (McGarry, 1992). در بیماران دیابتی، هیپرگلیسمی باعث آزادشدن گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) می‌شود. بنابراین، بیماری دیابت با تولید رادیکال­های آزاد و از طریق افزایش استرس­های اکسیداتیو باعث آسیب سلول­ها و بافت­های مختلف بدن می­شود (Signorini et al., 2002; Mc Coll et al., 1997).‌ پرواضح است که عوارض ناشی از دیابت توسط فاکتورهای متعددی ایجاد می‌گردد. بنابراین، این عوارض تنها از طریق کنترل هیپرگلیسمی و فشار خون قابل پیشگیری نیستند (Liu et al, 2008). اگرچه در مراحل اولیه بیماری، آسیب بافت­ها توسط هیپرگلیسمی القاء می‌شود، اما پیشرفت آسیب به ابقاء هیپرگلیسمی ارتباط ندارد (Vestra and Fioretto, 2003). از این­رو، کنترل گلوکز خون به تنهایی برای به‌تعویق انداختن روند عوارض دیابت کافی نیست. شواهد زیادی حاکی از نقش استرس اکسیداتیو و به دنبال آن تولید رادیکال‌های آزاد در بیماران دیابتی و دخالت این عوامل در پاتولوژی دیابت است (Cerielo et al., 1997; Kaneto et al., 2007; Bulter et al., 2000).

   کبد، اندامی موثر در متابولیسم، حفظ و برقراری سطح گلوکز خون در محدوده طبیعی بوده و افزایش قند خون منجر به عدم تعادل در واکنش­های اکسیداسیون- احیاء در درون هپاتوسیت­ها می­شود به این­ صورت ­که، هیپرگلیسمی از طریق افزایش تولید (AGEs advanced glycation end products;) باعث تسهیل در تولید رادیکال‌های آزاد (reactive oxygen species; ROS) از طریق اختلال در تولید زداینده‌های درونزاد رادیکال­های آزاد مثل سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز می­گردد که به آسیب سلول منجر می­شود.

   با توجه به نقش رادیکال­های آزاد در دیابت، یکی از عرصه‌های مورد تحقیق در درمان این بیماری، کاستن تولید رادیکال­های آزاد است (Bulter et al., 2000). در این راستا، اثر آنتی‌اکسیدان­ها در پیشگیری و یا کاهش صدمات وارده از طریق رادیکال­های آزاد در دیابت مورد بررسی قرار گرفته است (El-Bassiouni et al., 2005; Peerapatdit et al., 2006). میزان پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از تنش­های اکسیداتیو در سلول‌ها، توسط مکانیسم‌های تدافعی متنوعی شامل سیستم‌های زداینده آنزیماتیک و غیر آنزیماتیک رادیکال‌های آزاد که سطوح آنها در دیابت تغییر می‌یابد، کنترل می‌گردد (Wohaieb and Godin, 1987). بنابراین، ترکیباتی که بتوانند به هر طریق از آسیب­های اکسیداتیو پیشگیری کنند، مقاومت سلول­ها را در برابر آسیب ناشی از رادیکا­ل­های آزاد در بیماری دیابت افزایش می­دهند. مدیریت و کنترل بیماری دیابت بدون هیچ‌گونه عوارض جانبی، هنوز مورد چالش علم پزشکی می‌باشد و تقاضای بیماران دیابتی برای استفاده از محصولات طبیعی با خواص ضددیابتی رو به افزایش است چرا که انسولین و داروهای کاهنده قند خون خوراکی دارای اثرات جانبی نامطلوب زیادی هستند (Kameswara Rao and Appa Rao, 2001). پیشرفت­های قابل توجهی در زمینه کنترل دیابت نوع 2 توسط داروهای صناعی حاصل شده است، ولی تلاش برای یافتن عوامل طبیعی برای مقابله با این بیماری همچنان ادامه دارد. در سال‌های اخیر دستیابی به انواع جدید آنتی‌اکسیدان‌ها با منشأ گیاهی به‌طور جدی مورد توجه محققین بوده است (Srivastava et al., 1993).

   فلاوونوئیدها ترکیبات پلی­فنلی با خصوصیات فارماکولوژیک متعدد هستند و به عنوان زداینده رادیکا­ل­های آزاد عمل می­کنند (Arul and Subramanian, 2013; Keser et al., 2013). بر اساس تفاوت در ساختار مولکولی این ترکیبات، شش گروه عمده از فلاوونوئیدها وجود دارند که شامل: فلاوونول­ها (flavonols)، فلاوون­ها (flavones)، فلاوانون­ها (flavanones)، کاتچین­ها (catechins)، آنتوسیانیدین­ها (anthocyanidins) و ایزوفلاوون­ها (isoflavones) هستند (Kinoshita et al., 2006). نارینژنین (Naringenin)، 7،5،4-تری­هیدروکسی-تری­هیدروکسی­فلاوانون (4,5,7-trihydroxyflavanone) فلاوانونی هست که به­وفور در میوه خانواده مرکبات مثل پرتغال و نارنگی، گریپ فروت و همچنین گوجه فرنگی و گیلاس و کاکائو وجود دارد (Jain et al., 2011; Kawaii et al., 1999). به­طور طبیعی، این فلاوانون به شکل گلیکوزید (glycoside) درآمده و جذب روده­ای خود را افزایش می­دهد (Haidari et al., 2009).

   مطالعات نشان داده­است که نارینژنین دارای اثرات ضد التهابی، آنتی اکسیدانی، ضد سرطانی و حفاظت از سیستم عصبی می­باشد (Choi and Ahn, 2008; Nalini et al., 2012; Lee and Kim, 2010; Miyake et al., 2003). نارینژنین ترکیبی با سه گروه هیدروکسیل بوده و بنابراین نسبت به سایر فلاوانون­ها توانایی و قدرت آنتی­اکسیدانی بسیار بالایی داشته و قادر است آنزیم­های آنتی­اکسیدانی سلول­ها را تحریک کند (Chiou and Xu, 2004; Pollard et al., 2006). نشان داده شده است که نارینژنین علاوه بر اثرات بالقوه آنتی­اکسیدانی (Rahigude et al., 2012)، دارای اثرات ضد التهابی (Hirai et al., 2007) برجسته­ای نیز می­باشد.

با توجه به خواص آنتی­اکسیدانی نارینژنین، مطالعه حاضر به ­منظور ارزیابی اثرات حفاظتی این محصول گیاهی بر آسیب زودرس کبدی دیابت در موش‌های صحرایی دیابتی شده توسط آلوکسان انجام شد. 

 

مواد و روش­کار

   مطالعه حاضر از نوع تجربی آزمایشگاهی بوده و در سال 1394 در مرکز تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی تبریز انجام شد. در این مطالعه کلیه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار روی حیوانات آزمایشگاهی مورد تائید کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی بود.

 برای انجام این مطالعه،  تعداد 40 سر موش صحرایی  نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 20±200 گرم، به طور تصادفی در 4 گروه 10تایی شامل: 1- گروه شاهد سالم، 2- گروه سالم تیمار با نارینژنین، 3- گروه کنترل دیابتی و 4- گروه دیابتی تیمار با نارینژنین تقسیم شدند. شرایط تغذیه و نگه­داری برای تمام گروه‌ها یکسان و به صورت 12 ساعت روشنایی/تاریکی و دمای 2±21 درجه سلسیوس در نظر گرفته شد. جیره غذایی استاندارد و آب به‌طور آزاد در دسترس قرار گرفت. یک هفته پس از عادت کردن موش­ها به محیط جدید، برای دیابتی کردن موش‌ها محلول تازه تهیه شده آلوکسان با دز  mg/kg120 به‌صورت محلول در آب مقطر (5%)، بعد از 15 ساعت پرهیز غذایی، به‌صورت داخل صفاقی به موش‌های گروه‌های 3 و 4 تزریق شد. موش‌های با قند خون بالای mg/dl240 به عنوان دیابتی در نظر گرفته شد (Gupta et al., 2005). از کیت سنجش گلوکز، ساخت شرکت زیست شیمی ایران (Ziest chem) نیز برای سنجش قند خون استفاده شد. موش­های گروه‌های 2 و 4 نارینژنین را که از شرکت سیگما (Sigma-Aldrich Chemical Co., United Kingdom) به شکل پودر آماده در ویال­های مخصوص خریداری شده بود، به طور تازه با حل کردن پودر در حلال دی­متیل­سولفوکسید، به میزان mg/kg50 از راه خوراکی به صورت گاواژ، روزانه و به مدت 3 هفته دریافت کردند. میزان و روش مصرف نارینژنین بر اساس مطالعات آنادوری و همکاران در سال­های 2012 و 2013 انتخاب شد (Annadurai et al., 2012; Annadurai et al., 2013). به موش­های گروه­های شاهد متناظر (گروه‌های 1 و 3) نیز نرمال سالین  با حجمی برابر تزریق شد.

   پس از 3 هفته، جهت اندازه‌گیری برخی فاکتور‌های بیوشیمیایی  سرمی شامل آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، آسپاراتات آمینوترانسفراز (AST) (Reitman and Frankel, 1957)، آلکالین فسفاتاز (ALP) (Kind and King, 1954)، آلبومین (Alb) و پروتئین تام (TP) (Lowry et al., 1951) و بیلی‌روبین تام (Malloy and Evelyn, 1937)، نمونه‌ خون نیز از دم موش­ها تهیه گردید. سرم نمونه‌های خون توسط سانتریفیوژ با سرعت 2500 دور در دقیقه و به مدت 15 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد جدا شد. هم‌زمان همه موش‌‌ها با قطع سر  (decapitation) به راحتی کشته شدند. کبد موش‌ها به سرعت خارج شده و قطعاتی از آنها جدا  گردید و پس از شستشو در سالین بسیار سرد، توزین و هموژنات 10%  در 15/1% (w/v) کلرور پتاسیم تهیه شد. هموژنات با سرعت ×g7000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شده و محلول شناور (supernatant) جهت سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی (lipid peroxidation; LPO) و فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز (superoxide dismutase; SOD)، کاتالاز (catalase; CAT)، گلوتاتیون پراکسیداز (glutathione peroxidase; GPX) و گلوتاتیون ردوکتاز (glutathione reductase: GR) مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مورد مطالعه و میزان مالون­دی­آلدئید (malondialdehyde; MDA) و پروتئین شناور در محلول با استفاده از کیت­های تجاری در دسترس  (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) و طبق دستور­العمل شرکت تولیدکننده کیت انجام شد. پراکسیداسیون چربی با اندازه­گیری غلظت MDA سنجیده شد. مقدار MDA بافتی به صورت نانومول مالون­دی­آلدئید در میلی­گرم پروتئین و فعالیت آنتی­اکسیدانی به صورت واحدهای قراردادی در میلی­گرم پروتئین عنوان گردید.

پراکسیداسیون چربی در کبد با روش رنگ­سنجی (colorimetrically) به وسیله اندازه­گیری TBARS (Thiobarbituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران در سال 1988 (Fraga et al., 1988) انجام شد. به طور خلاصه، 1/0 میلی­لیتر هموژنات بافتی با 2 میلی­لیتر رآژین TBA-trichloroacetic acid- Hcl reagent (TBA 37%، HCL 25/0 مول و TCA 15%، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از 15 دقیقه حمام بخار، خنک گردیده و در g×3500 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب محلول شناور شفاف در 535 نانومتر در مقابل بلانک اندازه­گیری شد. مقادیر به صورت نانومول در 100 گرم بافت بیان شد.

فعالیت سوپراکسید دیسموتاز توسط روش نیشیکیمی در سال 1972  اندازه­گیری شد (Nishikimi et al., 1972). در حدود 5 میکروگرم از پروتئین­های تام هر یک از هموژنات­های کبدی با بافر پیروفسفات سدیم، PMT (phenazine methosulfate) و NBT (nitro-blue terazolium) مخلوط گردید. واکنش با افزودن NADH  (Nicotinamide-adenine dinucleotide) آغاز گردید. مخلوط واکنش در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه انکوبه و با افزودن 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال متوقف گردید. شدت جذب مخلوط رنگ­زای تشکیل شده در 560 نانومتر اندازه گیری شد. هر واحد از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا 50 درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین گردید.

   فعالیت کاتالاز توسط روش کلایبورن در سال 1985  براساس تجزیه پراکسید هیدروژن در 240 نانومتر، مورد سنجش قرار گرفت (Claiborne, 1985). به طور خلاصه، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلی­لیتر بافرفسفات (7 pH= و 05/0 مول)، 1 میلی­لیتر پرکسید هیدروژن (019/0 مول) و 05/0 میلی­لیتر PMS (10%) در حجم نهایی 3 میلی‌لیتر بود. تغییرات در جذب، در 240 نانومتر اندازه‌گیری گردید. در نهایت نتیجه به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه شد.

فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز طبق روش روتراک و همکاران در سال 1973 بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت (Rotruck et al., 1973).

H2O2 + 2GSH (گلوتاتیون احیاء) → 2H2O + GSSG(گلوتاتیون اکسید)

گلوتاتیون پراکسیداز، در هموژنات بافتی، گلوتاتیون را اکسیده کرده که به طور هم­زمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء می­گردد. این واکنش پس از 10 دقیقه توسط تری‌کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقی­مانده توسط محلول DTNB (dithiobis nitrobenzoic acid) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی می­گردد که با اسپکتروفتومتر در 420 نانومتر اندازه­گیری می­شود. مخلوط واکنش­گر متشکل از 2/0 میلی‌لیتر EDTA (ethylenediamine tetra-acetic acid) 8/0 میلی­مولار، 1/0 میلی­لیتر آزید سدیم (sodium azide) 10 میلی­مولار، 1/0 میلی­لیتر پراکسید هیدروژن 5/2 میلی­مولار و 2/0 میلی­لیتر هموژنات بود که در 37 درجه ‌سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه گردید. واکنش با افزودن 5/0 میلی­لیتر تری‌کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لوله­ها با 2000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مقدار 3 میلی­لیتر دی­سدیم هیدروژن 8/0 میلی­مولار و 1/0 میلی­لیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شده و بلافاصله رنگ حاصله در 420 نانومتر اندازه­گیری شد. فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میکرومول گلوتاتیون اکسید/دقیقه/میلی گرم پروتئین بیان گردید.

فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز با استفاده از روش مهنداس و همکاران در سال 1984 بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت (Mohandas et al., 1984).

NADPH + H⁺ + GSSG → NADP⁺ + 2GSH

در حضور گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون اکسیده، احیاء گردیده و هم­زمان، NADPH به NADP⁺ اکسیده می­شود. فعالیت آنزیم در دمای اتاق توسط سنجش میزان ناپدید شدن NADPH/ دقیقه در 340 نانومتر، با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری گردید.

برای آسیب­شناسی بافتی، از کبد تمامی موش‌ها نمونه‌هایی اخذ و در فرمالین بافری 10 درصد پایدار شدند. از نمونه‌های فوق با استفاده از شیوه‌های رایج پاساژ بافت و تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی، برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون و با روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین تهیه شد (Lee and Luna, 1988). تغییرات هیستوپاتولوژی کبد به صورت تغییر چربی (fatty Change) هپاتوسیت­ها بر اساس شدت ضایعه، از صفر تا 3 (صفر: حالت طبیعی، 1: استئاتوز خفیف، 2: استئاتوز متوسط و 3: استئاتوز شدید) رتبه‌بندی شد. کلّیه درجه‌‌بندی‌ها با بزرگنمایی 100×  و در 5 میدان میکروسکوپی از هر برش ، به‌طور تصادفی، انجام شد.    

تحلیل آماری داده­ها

   داده‌های به‌دست آمده کمی، به صورت mean±S.E.M ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون تحلیل واریانس یک­طرفه (ANOVA)و آزمون تعقیبی توکی (Tukey) در سطح معنی‌داری 05/0p<  توسط نرم‌افزار آماری SPSS ویرایش 17 مورد واکاوی قرار گرفت.

 

یافته­ها

   نتایج تاثیر تیمار روزانه با نارینژنین با دز 50 میلی­گرم بر کیلوگرم به مدت 3 هفته بر میزان قند خون موش­های مورد مطالعه در نمودار 1 آورده شده است. نارینژنین اثر هیپوگلیسمیک معنی­داری در موش­های سالم (05/0p<) و دیابتی (01/0p<) بعد از 3 هفته استفاده ایجاد کرد.

   جدول 1، تاثیر نارینژنین بر سطوح سرمی شاخص­های آسیب کبدی را در موش­های دیابتی نشان می­دهد. مقادیر سرمی آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز و آلکالین فسفاتاز و بیلی­روبین در گروه دیابتی به طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه شاهد سالم افزایش یافت.  این پارامترها در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین به­طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه دیابتی کاهش نشان دادند. میزان آلبومین و پروتئین تام سرم در گروه دیابتی به طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه شاهد سالم کاهش یافت. این پارامترها در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین به طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه دیابتی افزایش نشان دادند.

   جدول 2، تاثیر  آنتی­اکسیدانی نارینژنین را در بافت کبد موش­های دیابتی نشان می­دهد. محتوای مالون­دی‌آلدئید کبد در گروه دیابتی به طور معنی‌داری (05/0p<) در مقایسه با گروه شاهد سالم افزایش یافت و در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین به طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه دیابتی کاهش یافت. محتوای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز کبد در گروه دیابتی به طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه شاهد کاهش یافت. این پارامترها در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین به طور معنی­داری (05/0p<) در مقایسه با گروه دیابتی افزایش نشان دادند.

   در مشاهدات ریزبینی، ساختار بافت کبد در گروه شاهد طبیعی بود (شکل 1- الف). در گروه سالم تیمار با نارینژنین نیز تغییر پاتولوژیک خاصی مشاهده نشد (شکل 1- ب). در بافت کبد موش­های گروه دیابتی تغییر چربی در ناحیه مرکزی لوبول­های کبد مشاهده شد (شکل 1- ج). در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین، نارینژنین از بروز آسیب در بافت کبد جلوگیری کرد به­طوری که، تغییر چربی قابل ملاحظه­ای در هپاتوسیت­ها مشاهده نشد (شکل 1- د). نتایج کمی مشاهدات ریزبینی بافت کبد موش­های مورد مطالعه در جدول 3 نشان داده شده است.

 

نمودار 1- مقایسه تاثیر نارینژنین بر میزان قند خون در موش­های صحرایی مورد مطالعه (mean±SEM)

a,b: در مقایسه با گروه 1 (شاهد سالم)، c: در مقایسه با گروه 3 (دیابتی) (05/0p<).

 

جدول 1- مقایسه تاثیر نارینژنین بر میزان شاخص­های سرمی آسیب کبد در موش­های صحرایی مورد مطالعه (mean±SEM)

گروه‌ها	فراسنجه­ها
	آلانین ‌آمینوترانسفراز (U/L)	آسپارتات ‌آمینوترانسفراز (U/L)	لاکتات دهیدروژناز (U/L)	بیلی‌روبین تام (mg/dl)	پروتئین ‌تام‌ (g/dl)	آلبومین (g/dl)
شاهد سالم	67/3±32/55	35/2±72/73	71/8±15/193	02/0±83/0	52/0±98/7	38/0±22/4
سالم تیمار با نارینژنین	11/3±90/53	66/3±42/71	25/10±44/196	04/0±88/0	41/0±12/8	41/0±35/4
دیابتی	a65/4±84/68	a15/4±73/95	a33/9±65/271	a07/0±62/1	a38/0±43/5	a38/0±17/3
دیابتی تیمار با نارینژنین	b71/3±42/59	b72/4±11/82	b47/8±84/225	b05/0±94/0	b23/0±92/6	b22/0±01/4

a       : در مقایسه با گروه 1 (شاهد سالم)، b: در مقایسه با گروه 3 (دیابتی) (05/0p<).

 

 

جدول 2- مقایسه تاثیر نارینژنین بر میزان مالون­دی­آلدئید و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در موش­های صحرایی مورد مطالعه (mean±SEM)

گروه‌ها		فراسنجه‌ها
		مالون‌دی‌آلدئید (nmol/g protein)	سوپراکسید دیسموتاز (U/mg protein)	کاتالاز (U/mg protein)	گلوتاتیون پراکسیداز (U/mg protein)	گلوتاتیون ردوکتاز (U/mg protein)
شاهد		14/0±39/3	48/0±64/13	18/3±11/64	2/1±84/20	85/4±37/120
سالم تیمار با نارینژنین		18/0±25/3	67/0±85/13	15/2±73/65	6/1±14/22	76/3±14/127
دیابتی		a24/0±19/5	a70/0±91/8	a44/1±74/53	a4/1±33/17	a51/2±26/104
دیابتی تیمار با نارینژنین		b31/0±29/4	b42/0±25/11	b12/1±12/60	b3/1±85/19	b17/3±45/119

a                        : در مقایسه با گروه 1 (شاهد سالم)، b: در مقایسه با گروه 3 (دیابتی) (05/0p<).

 

 

 

شکل 1- نمای ریز‌بینی از کبد موش­های صحرایی مورد مطالعه (هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمایی 400×). در نمای ریزبینی ساختار بافت کبد در گروه شاهد سالم طبیعی می­باشد (الف). در گروه سالم تیمار با نارینژنین نیز تغییر پاتولوژیک خاصی مشاهده نمی­شود (ب). در گروه دیابتی در بافت کبد موش­های دیابتی تغییر چربی (پیکان­ها) در ناحیه مرکز لوبولی مشاهده می­شود (ج). در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین، نارینژنین از بروز تغییرات پاتولوژیک جلوگیری کرده و تغییر چربی قابل ملاحظه­ای در هپاتوسیت­ها مشاهده نمی­شود (د).

 

 

 

جدول 3- تاثیر نارینژنین بر آسیب کبد در موش­های صحرایی دیابتی شده با آلوکسان (mean±SEM)

گروه	تیمار	درجه آسیب بافت	نتیجه­آزمون کروسکال والیس
1	شاهد	0/0±0/0	001/0>p
2	سالم تیمار با نارینژنین	0/0±0/0
3	دیابتی	a18/0±56/2
4	دیابتی تیمار با نارینژنین	b21/0±53/0

                                               0= بدون آسیب، 1= آسیب حداقل، 2- آسیب ملایم، 3- آسیب متوسط، 4- آسیب شدید

a                                                                : در مقایسه با گروه 1 (شاهد)، b: در مقایسه با گروه 3 (دیابتی)

 

 

بحث و نتیجه­گیری

   در این مطالعه مصرف خوراکی نارینژنین به میزان mg/kg 50 و به مدت 3 هفته باعث کاهش قند خون در موش­های صحرایی سالم و دیابتی شده توسط آلوکسان گردید. نتایج بیوشیمیایی و هیستوپاتولوژی نیز حاکی از آسیب بافت کبد در موش­های صحرایی دیابتی شده توسط آلوکسان بود ­طوری­که، در موش­های دیابتی شده با آلوکسان افزایش معنی‌دار سطوح آنزیم‌های آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز، و آلکالین فسفاتاز و بیلی‌روبین و کاهش معنی‌دار آلبومین سرم در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد.  نتایج بررسی حاضر نشان می‌دهد که مصرف نارینژنین، پارامتر‌های شاخص آسیب کبدی را تا حد قابل قبولی بهبود می­بخشد. در ارزیابی آسیب کبد، سنجش سطوح آنزیم‌هایی نظیر آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز، و آلکالین فسفاتاز به‌طور وسیع مورد استفاده قرار می‌گیرد. وقوع نکروز یا آسیب غشاء سلول باعث رها شدن آین آنزیم‌ها به گردش خون می‌شود. افزایش سطح آسپارتات آمینوترانسفراز در سرم، آسیب کبد نظیر هپاتیت‌های ویروسی، انفارکتوس قلبی و صدمات عضلانی را نشان می‌دهد. آلانین آمینوترانسفراز که تبدیل آلانین را به پیرووات و گلوتامات کاتالیز می‌کند، برای کبد اختصاصی‌تر بوده و پارامتر مناسب‌تری برای تشخیص آسیب کبد می‌باشد. سطوح افزایش یافته آنزیم‌های سرمی فوق حاکی از نشت سلولی بوده و نشانگر آسیب ساختار و اختلال عملکرد غشاء‌های سلولی در کبد می‌باشد (Drotman and Lawhan, 1978). از سوی دیگر، سطح سرمی آلکالین فسفاتاز، بیلی‌روبین، آلبومین و پروتئین تام  با عملکرد سلول‌های کبدی در ارتباط می‌باشد. افزایش سطح سرمی آلکالین فسفاتاز به‌دلیل افزایش تولید در حضور فشار فزاینده صفراوی می‌باشد (Muriel et al., 1992). بازگشت سطوح افزایش یافته آنزیم‌های سرمی فوق به‌حالت طبیعی با مصرف نارینژنین در موش­های دیابتی، می‌تواند در اثر ممانعت از نشت آنزیم‌های داخل سلولی به‌دلیل برقراری تمامیت و پایداری سلامت غشاء سلول و یا نوزایش سلول‌های آسیب دیده کبد باشد (Thabrew and Joice, 1987).  کنترل موثر سطوح آلکالین فسفاتاز، بیلی‌روبین و آلبومین، بهبود زودهنگام مکانیسم‌های عملکردی و ترشحی سلول‌های کبدی را نشان می‌دهد.  در این بررسی، تغییرات چربی در نواحی مرکز لوبولی در کبد موش­های دیابتی مشاهده گردید. با تجویز نارینژنین به موش­های دیابتی، تغییر پاتولوژیکی در بافت کبد مشاهده نشد که این خود اثرات محافظتی نارینژنین را در مقابل عوارض کبدی دیابت نشان می‌دهد. در هر صورت، یافته‌های  آسیب‌شناسی این مطالعه با نتایج بیوشیمیایی به‌دست آمده همسو بوده و آن‌ها‌ را مورد تائید قرار می‌دهد. 

   در بررسی حاضر به­نظر می­رسد که رادیکال­های آزاد باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و همچنین اسیدهای چرب غیراشباع توری داخل سیتوپلاسمی گردیده است که منجر به تشکیل پراکسیدهای لیپیدی (مالون­دی­آلدئید) و از بین رفتن تمامیت غشاء سلول و در نهایت آسیب کبد شده است. افزایش میزان مالون­دی­آلدئید در موش­های دیابتی، نشان­دهنده افزایش واکنش­های پراکسیداسیونی است­که به ضعف مکانیسم­های تدافعی آنتی­اکسیدانی نیز منجر گردیده و بدین­ترتیب ممانعت از تولید مفرط رادیکال­های آزاد هم مقدور نخواهد بود (Naik, 2003). به عبارتی دیگر، افزایش میزان مالون­دی­آلدئید در کبد حاکی از افزایش پراکسیداسیون لیپیدی است که منجر به آسیب بافت کبد و همچنین ناتوانی مکانیسم­های تدافعی آنتی­اکسیدانی در ممانعت از تولید بی­رویه رادیکال­های آزاد می­گردد.

   سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز  آنزیم­های آنتی­اکسیدانی هستند که یک سیستم تدافعی را علیه گونه­های فعال اکسیژن تشکیل داده­اند (Lil et al., 1988). کاهش فعالیت سوپراکسیددیسموتاز شاخصی حساس در مورد آسیب سلول­های کبدی می­باشد. این آنزیم یکی از مهم­ترین عوامل در سیستم تدافعی آنتی­اکسیدانی آنزیماتیک می­باشد. سوپراکسید دیسموتاز آنیون سوپراکسید را از طریق تبدیل آن به پراکسید هیدروژن مورد پاک­سازی قرار داده و بدین ترتیب اثرات سمی آن­را کاهش می­دهد (Curtis et al., 1972). در بررسی حاضر، میزان سوپراکسید دیسموتاز در موش­های دیابتی به­دلیل تشکیل فراوان آنیون­های سوپراکسید، به­طور معنی­داری کاهش یافت. همچنین فعالیت آنزیم­های زداینده پراکسید هیدروژن یعنی کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز در این موش­ها به­طور معنی­داری کاهش یافت. به­نظر می­رسد که غیرفعال شدن سوپراکسید دیسموتاز توسط آنیون­های افزایش­یافته سوپراکسید، منجر به غیرفعال شدن آنزیم­های کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز می­شود. در این مطالعه، مصرف نارینژنین مانع از کاهش سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز شده است که این اثر ممکن است به­دلیل پاک­سازی رادیکال­ها توسط نارینژنین باشد که منجر به حفظ و بقاء این آنزیم­ها شده است.      

   کاتالاز آنزیم آنتی­اکسیدانی است که در بافت­های حیوانی به­طور گسترده منتشر شده و دارای بیشترین فعالیت در کبد و گلبول­های قرمز می­باشد. کاتالاز پراکسید هیدروژن را تجزیه کرده و بافت­ها را از رادیکال­های بسیار فعال هیدروکسیل محافظت می‌کند (Chance et al., 1952). بنابراین، کاهش فعالیت کاتالاز ممکن است منجر به بروز برخی اثرات مخرب ناشی از رادیکال­های سوپراکسید و پراکسید هیدروژن گردد.

   گلوتاتیون ردوکتاز یک آنزیم سیتوزولی کبدی است که در کاهش گلوتاتیون اکسید، به عنوان محصول نهایی فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز علیه گلوتاتیون احیاء، دخالت دارد (Suresh and Vandana, 2008). متعاقب القاء دیابت کاهش قابل توجهی در میزان گلوتاتیون پراکسیداز حاصل می­گردد که منجر به دسترسی گلوتاتیون ردوکتاز به سوبسترا خواهد شد که بدین ترتیب فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز کاهش می­یابد. مصرف نارینژنین در موش­های دیابتی فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز را مجدداً برقرار کرده که مصرف گلوتاتیون اکسید را جهت تشکیل گلوتاتیون احیاء و افزایش سم­زدایی متابولیت­های فعال توسط کونژوکاسیون با گلوتاتیون احیاء برقرار می­کند.

   نتایج بررسی حاضر اثرات مفید نارینژنین را در مقابل عوارض کبدی دیابت نشان می­دهد. بنابراین، نارینژنین می‌تواند پس از انجام کارآزمایی‌های شاهدار اتفاقی و حصول نتایج مثبت، به‌عنوان یک داروی با منشأ گیاهی جهت پیشگیری از آسیب­های کبدی ناشی از استرس اکسیداتیو در بیماری دیابت، در مورد انسان نیز توصیه گردد. تعیین تاثیر دزهای مختلف نارینژنین و شناخت دقیق، مکان و مکانیسم یا مکانیسم‌های مولکولی و سلولی مؤثر در عملکرد فارماکولوژیکی آن نیاز به مطالعات آتی دارد.

مراجع

• Alberti, K.G.M.M. and Zimmet, P.Z. (1998). Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabetes Medivine, 13: 539-553.
• Annadurai, T., Muralidharan, A.R., Joseph, T., Hsu, M.J., Thomas, P.A. and Geraldine, P. (2012). Antihyperglycemic and antioxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry, 68(3): 307-318.
• Annadurai, T., Thomas, P.A. and Geraldine, P. (2013). Ameliorative effect of naringenin on hyperglycemia-mediated inflammation in hepatic and pancreatic tissues of Wistar rats with streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetes mellitus. Free Radical Research, 47(10): 793-803.
• Arul, D. and Subramanian, P. (2013). Inhibitory effect of naringenin (citrus flavonone) on N-nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis in rats. Biochemical and Biophysical Research Communications, 434: 203-209.
• Bulter, R., Morris, A.D., Belch, J.J.E., Hill, A. and Struthers, A.D. (2000). Allopurinol normalizes endothelial dysfunction in type 2 diabetes with mild hypertension. Hypertension, 35: 746-751.
• Cerielo, A., Motz, E., Cavarape, A., Lizzio, S., Russo, A., Quatararo, A. and Giugliano, D. (1997). Hyperglycemia counterbalances the antihypertensive effect of glutathione in diabetes patients: evidence linking hypertension and glycemia through the oxidative stress in diabetes mellitus. Journal of Diabetes and its Complications, 11: 250-255.
• Chance, B., Greenstein, D.S. and Roughton, R.J.W.  (1952). The mechanism of catalase action. 1. Steady-state analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 37(2): 301-321.
• Chiou, G.C.Y. and Xu, X. (2004). Effects of some natural flavonoids on retinal function recovery after ischemic insult in the rat. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 20(2): 107-113.
• Choi, E.J. and Ahn, W. S. (2008). Neuroprotective effects of chronic hesperetin administration in mice. Archives of Pharmacological Research, 31(11): 1457-1462.
• Claiborne, A. (1985). Catalase activity. In: Boca Raton FL, editor. CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, Boca Raton, pp: 283-284.
• Curtis, S.J., Mortiz, M. and Sondgrass, P.J. (1972). Serum enzyme derived from liver cell fraction and the response of carbon tetrachloride intoxication in rats. Gastroentrology, 62(1): 84-92.
• Drotman, R. and Lawhan, G. (1978). Serum enzymes are indications of chemical induced liver damage. Drug and Chemical Toxicology, 1(2): 163-171.
• El-Bassiouni, E.A., Helmy, M.H., Abou Rawash, N., El-Zoghby, S.M., Kamel, M.A. and Abou Rayah, A.N. (2005). Embryopathy in experimental diabetic gestation: assessment of oxidative stress and antioxidant defense. British Journal of Biomedical Science, 62: 71-76.
• Fraga, C.G., Leibouitz, B.E. and Toppel, A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as TBARS in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes. Free Radical Biology and Medicine, 4: 155-161.
• Gupta, R.K., Kesari, A.N., Murthy, P.S., Chandra, R., Tandon, V. and Watal, G. (2005). Hypoglycemic and antidiabetic effect of ethanolic extract of leaves of Annona squamosa L. in experimental animals. Journal of Ethnopharmacology, 99(1): 75-81.
• Haidari, F., Keshavarz, S.A., Rashidi, M.R. and Shahi, M.M. (2009). Orange juice and hesperetin supplementation to hyperuricemic rats alter oxidative stress markers and xanthine oxidoreductase activity. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 45(3): 285-291.
• Hirai, S., Kim, Y.I., Goto, T., Kang, M.S., Yoshimura, M., Obata, A., et al. (2007). Inhibitory effect of naringenin chalcone on inflammatory changes in the interaction between adipocytes and macrophages. Life Science Journal, 81: 1272-1279.
• Jain, A., Yadav, A., Bozhkov, A.I., Padalko, V.I. and Flora, S.J. (2011). Therapeutic efficacy of silymarin and naringenin in reducing arsenic-induced hepatic damage in young rats. Ecotoxicology and Environmental Safety, 74: 607-614.
• Kameswara Rao, B. and Appa Rao, C.H. (2001). Hypoglycemic and antihyperglycemic activity of alternifolium (Wt.) Walp. Seed extracts in normal and diabetic rats. Phytomedicine, 8: 88-93.
• Kaneto, H., Katakami, N., Kawamori, D., Miyatsoka, T., Sakamoto, K., Matsuoka, T.A., et al. (2007): Involvement of oxidative stress in the pathogenesis of diabetes. Antioxide Redox Signal, 9: 355-366.
• Kawaii, S., Tomono, Y., Katase, E., Ogawa, F. and Yano M. (1999). Quantitation of flavonoid constituents in Citrus fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(9): 3565-3571.
• ·      Kesari, A.N., Gupta, R.K., Singh, S.K., Diwakar, S. and Watal,G. (2006). Hypoglycemic and antihyperglycemic activity of Aegle marmelos seed extract in normal and diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, 107(3): 374-379.
• Keser, S., Celik, S. and Turkoglu, S. (2013). Total phenolic contents and free-radical scavenging activities of grape (Vitis vinifera L.) and grape products. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 64: 210-216.
• Kind, P.R. and King, E.J. (1954). Estimation of plasma phosphates by determination of hydrolyzed phenol with antipyrin. Journal of Clinical Pathology, 7: 322-326.

 

• Kinoshita, T., Lepp, Z., Kawai, Y., Terao, J. and Chuman, H. (2006). An integrated database of flavonoids. BioFactors, 26(3): 179-188.
• Lee, J. and Kim, G. (2010). Evaluation of antioxidant and inhibitory activities for different subclasses flavonoids on enzymes for rheumatoid arthritis. Journal of Food Science, 75(7): H212-H217.
• Lee, G., Luna, H.T. (1988). Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. 3rd ed., New York: Mc Graw-Hill Book Company, pp: 32-107.
• Lil, J.L., Stantman, F.W. and Lardy, H.A. (1988). Antioxidant enzyme systems in rat liver and skeletal muscle. Influences of selenium deficiency, chronic training, and acute exercise. Archives of Biochemistry and Biophysics, 263(1): 150-160.
• Liu, H.R., Tang, X.Y., Dai, D.Z. and Dai, Y. (2008). Ethanol extracts of Rehmannia complex (Di Huang) containing no Corni fructus improve early diabetic nephropathy by combining suppression on the ET-ROS axis with modulate hypoglycemic effect in rats. Journal of Ethnopharmacology,  118(3): 466-472.
• Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry, 193: 265-275.
• Malloy, H.T. and Evelyn, K.A. (1937). The determination of bilirubin level with the photoelectric colorimeter. Journal of Biological Chemistry, 119: 481-484.
• Mc Coll, A.J., Kong, C., Collins, J., Ellkeles, R. and Richmond, W. (1997). Total antioxidant status, protein glycation, lipid hydroperoxides in non-insulin dependent diabetes mellitus. Biochemistry Society Transplantation, 25: 132-137.
• McGarry, J.D. (1992). What if Minkowski had been ageusic? An alternative angle on diabetes. Science, 258: 766-770.
• Miyake, Y., Minato, K., Fukumoto, S., Yamamoto, K., Oya-Ito, T., Kawakishi, S., et al. (2003). New potent antioxidative hydroxyflavanones produced with Aspergillus saitoi from flavanone glycoside in citrus fruit. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 67(7): 1443-1450.
• Mohandas, J., Marshall, J.J., Duggin, G.G., Horvath, J.S.L. and Tiller, D.G. (1984). Low activities of glutathione-related enzymes as factors in the genesis of urinary bladder cancer. Cancer Research, 44: 5086-5091.
• Muriel, P., Garcipiana, T., Perez-Adverez, V. and Mourelle, M. (1992). Silymarin protects against paracetamol-induced lipid peroxidation and liver damage. Journal of Applied Toxicology, 12(6): 439-342.
• Naik, S.R. (2003). Antioxidants and their role in biological functions: An overview. Indian Drugs; 40(9): 501-512.
• Nalini, N., Aranganathan, S. and Kabalimurthy, J. (2012). Chemopreventive efficacy of hesperetin (citrus flavonone) against 1, 2-dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Toxicology Mechanisms and Methods, 22: 397-408.
• Nishikimi, M., Rao, N.A. and Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulphate and molecular oxygen. Biochemical and Biophysical Research communications, 46: 849-854.
• Peerapatdit, T., Patchanas, N., Likidlilid, A., Poldee, S. and Sriratanasathavorn, C. (2006). Plasma lipid peroxidation and antioxidant nutrients in type 2 diabetic patient. Journal of the Medical Association of Thailand, 89: Suppl 5: S147-155.
• Pollard, S.E., Whiteman, M. and Spencer, J.P.E. (2006). Modulation of peroxynitrite-induced fibroblast injury by hesperetin: a role for intracellular scavenging and modulation of ERK signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications, 347(4): 916-923.

 

• Rahigude, A., Bhutada, P., Kaulaskar, S., Aswar, M. and Otari K. (2012). Participation of antioxidant and cholinergic system in protective effect of naringenin against type-2 diabetes-induced memory dysfunction in rats. Neuroscience, 226: 62-72.
• Reitman, S. and Frankel, S. (1957). A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminase. American Journal of Clinical Pathology, 28: 56-63.
• Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. and Hoekstra, W.G. (1973). Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179: 588-590.
• Signorini, A.M., Fondelli, C., Renzoni, E., Puccetti, C., Gragnoli, G. and Giorgi, G. (2002). Antioxidant effect of gliclazide, glibenclamide and metformin in patients with type 2 diabetes mellitus. Current Therapeutic Research, 63: 411-420.
• Srivastava, Y., Bhat, H.V., Verma, Y. and Venkaidh, K. (1993). Antidiabetic and adaptogenic properties of Momordica charantia extract: an experimental and clinical evaluation. Phytotherapy Research, 7: 285-288.
• Suresh, R.N. and Vandana, S.P. (2008). Hepatoprotective effect of Ginkgoselect Phytosome® in rifampicin induced liver injurym in rats: Evidence of antioxidant activity. Fititerapia, 79(6): 439-445.
• Thabrew, M. and Joice P. (1987). A comparative study of the efficacy of Pavetta indica and Osbeckia octanda in the treatment of liver dysfunction. Planta Medica, 53(3): 239-241.
• Vestra, M.D. and Fioretto, P. (2003). Diabetic nephropathy: renal structural studies in type 1 and type 2 diabetic patients. International Congress Series, 1253: 163-169.
• Wohaieb, S.A. and Godin, D.V. (1987). Alterations in free radical tissue defense mechanism in STZ induced diabetes in rat, effects of insulin treatment. Diabetes, 36: 1014-1018.