تأثیر آلومینیوم و فسفر بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، محتوای لیگنین و برخی از پارامترهای فیزیولوژیک گیاه Eustoma grandiflora L.

زیست شناسی تکوینی

مقاله 2، دوره 8، شماره 1 - شماره پیاپی 29، اسفند 1394، صفحه 11-22   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

سمیت آلومینیوم یکی از مهمترین عوامل محدود کننده­ رشد گیاهان در خاک­های اسیدی است. بین سمیتآلومینیوموکمبودفسفردرخاک‌هایاسیدیارتباطمستقیمیوجوددارد وبه نظر می­رسد که درگیاهانتیمارشدهبافسفرکافی،مقاومتبهآلومینیومافزایشمی­یابد. در تحقیق حاضر تأثیر آلومینیوم و فسفر بر فعالیت آنزیم پراکسیداز و لیگنیفیکاسیون در گیاهچه­های جوان لیسیانتوس (Eustoma grandiflora L. ) مورد بررسی قرار گرفت. گیاهچه­های جوان به مدت 10 روز در کشت هیدروپونیک با محلول غذایی هوگلند4/1 قرار گرفته و در چهار گروه کنترل(بدون آلومینیوم و فسفر اضافی)، 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P تیمار شدند. به دنبال این مراحل مقدار جذب آلومینیوم و فسفر، فعالیت آنزیم پراکسیداز ( محلول، یونی و کووالانی) در ریشه و چوبی شدن و برخی دیگر از پارامترهای فیزیولوژیکی گیاه بررسی شد. تیمار گیاهچه­ها با آلومینیوم کاهش معنی دار فعالیت آنزیم پراکسیداز محلول، یونی و کووالانی در ریشه و تیمار با فسفر، افزایش معنی دار فعالیت پراکسیدازهای محلول و کووالانی و تیمار توأم این دو، کاهش معنی­دار پراکسیدازهای محلول و یونی را نسبت به گروه شاهد به همراه داشت. در هر سه گروه از گیاهان تیمار شده، تغییر معنی داری در پراکسیداسیون لیپید غشا مشاهده نشد. در گیاهان تحت تیمار آلومینیوم، کاهش لیگنیفیکاسیون رخ دادکه نشان دهنده اثر تحریک کننده آلومینیوم در رشد و اثر مثبت آن در تعدیل سمیت فسفر زیاد می باشد.

کلیدواژه‌ها

آلومینیوم؛ پراکسیداز؛ فسفر؛ لیسیانتوس؛ لیگنین

اصل مقاله

آلومینیوم بعد از اکسیژن و سیلیکون، سومین عنصر فراوان موجود در پوسته زمین می­باشد.³⁺ Alیون پیچیده­ای است که فرم شیمیایی و عملکرد زیستی پیچیده‌ای دارد و در خاک‌های خنثی یا با اسیدیته‌ ضعیف به شکل اکسید یا آلومینیوسیلیکات غیر‌ قابل حل وجود دارد. با کاهش pHخاک (کمتر از 5)، انحلال پذیری فرم­های سمی آلومینیوم (Al³⁺)افزایش یافته و باعث ایجاد سمیت در گیاه می­شود.غلظت آلومینیوم در محلول خاک­های معدنی در pHبالاتر از 5 کمتر از یک میلی گرم بر لیتر است ولی با کاهش pH این غلظت به شدت افزایش می­یابد[1]. علاوه برpHمحیط، غلظت آلومینیوم، دما و غلظت سایر کاتیون­ها و آنیون­ها در محیط، از عوامل موثر در سمیت آلومینیوم می­باشند [2]. سمیت آلومینیوم به عنوان عامل محدود کننده­ پتانسیل رشد برای گیاهان رشد یافته در خاک­های اسیدی در بخش­های مختلف جهان به شمار می­رود [6،7،8].  از آنجا که میزان آلومینیوم در هر گرم بافت خشک گیاه (^5-10 - ^9-10) گرم می­باشد، مقادیرزیاد آن در خاک، سبب ایجاد سمیت و اختلال در بسیاری از فرآیند­های بیوشیمیایی گیاه می­شود.فسفر بعد از نیتروژن، مهم‌ترین عنصر‌غذایی ضروری و پرمصرف گیاه بوده و به دو شکل آلی (اسیدهای نوکلئیک، فسفولیپید، اینوزیتول ‌فسفات و قندهای فسفری) و معدنی (عمدتاً فسفات‌کلسیم، منیزیم،آهن وآلومینیوم) در خاک یافت شده و تقریبا 5 درصد از وزن خشک گیاه را تشکیل می­دهد. فسفر به شکل­های HPO₄^-و H₂PO₄^- از خاک جذب می­شود. از آنجا که فسفر جزئی از ساختار نوکلئیک اسید است، در تنظیم سنتز پروتئین نیز نقش دارد. همچنین اهمیت این عنصر در فتوسنتز، تقسیم سلولی، تکوین بافت جدید، انتقال نشاسته و قند، در ساختار غشای سلول و کمپلکس‌های انرژی مانند ATP شناخته شده است [21]. درآزمایشیکهبررویدانه‌یسویاانجامگرفتمشخصشدکهبینسمیتآلومینیوموکمبودفسفردرخاک‌هایاسیدیارتباطمستقیمیوجوددارد.هم‌چنیننتایجحاصلازاینآزمایشبیانکننده‌یآنبودکهارقامتیمارشدهبافسفرکافی،احتمالاًافزایشمقاومتبهآلومینیومرانهتنهاازطریقبر‌هم‌کنشمستقیم (Al-P)،بلکهازطریقتعاملغیرمستقیمدرارتباطباتحریکترشحاسیدهایآلیهمبندباآلومینیومبهمنظورکاهشاثرسمیتآندرریشه،نشانمی‌دهند[16]. 

در آزمایش دیگری که بر رویگیاهبرنجانجامشدابتداتعدادیازگیاهچه‌هایبرنجدرمحیطکشتحاویفسفر(P+)وتعدادیدیگردرمحیطبدونفسفر(P-) کشت شدند.سپسگیاهچه‌هابهمحیطدارایآلومینیوموفاقدآنمنتقلشدند. نتایجنشاندادکهگیاهچه‌های(P-) نسبتبهسمیتآلومینیوم،مقاومتنشاندادهوتجمعآلومینیومدراینارقامکمتربود[18]. 

گیاه لیسیانتوس گیاهی زینتی و متعلق به خانواده­ی Gentianaceaeاست که به دلیل داشتن ساقه­های طویل، گل­های درشت، تنوع در رنگ گلبرگ­ها و عمر طولانی پس از برداشت از اهمیت ویژه­ای در بازارهای جهانی برخوردار است[17]. همچنین این گیاهقادر به تحمل آلومینیوم می­باشد[2]. هدف از تحقیق حاضر بررسی نقش فسفر در افزایش مقاومت گیاه لیسیانتوس در مقابل سمیت آلومینیوم و تاثیر بر هم کنش آنها بر برخی از پارامترهای فیزیولوژیکی این گیاه لیسیانتوس می­باشد.

 

مواد و روش­ها

گیاهچه­های جوان لیسیانتوس از بازار گل و گیاه
شهرستان­های اصفهان و ورامین تهیه شد. گیاهچه­هابا آب جاری شسته و به مدت 3 دقیقه در محلول پرمنگنات پتاسیم ضدعفونی سطحی شدند. سپس به محلول غذایی تغییر یافته­ی هوگلند 4/1 (pH 6) با فرمول زیر منتقل و هوادهی شدند:

(عناصر پر مصرفبرحسبمیلیمول):

Ca (NO₃)₂.4H₂O, 2/5; KNO₃, 2/5; MgSO₄.7H₂O, 1; KH₂PO₄, 0/5

 

)عناصر کم مصرفبرحسب(ppm:

Fe-EDTA, 3; H₃BO₃, 0/5; Mn (MnCl₂.), 0/5; Zn (ZnCl₂), 0/05;                 

Cu (CuCl₂.2H₂O), 0/02; Mo (Na₂MoO₄), 0/02

 

گیاهچه­ها به مدت 14 روز در این محیط قرار داشته و هر 3-5 روز یکبار محیط تعویض می­شد تا ضمن سازگاری گیاهان با شرایط هیدروپونیک مواد جذب شده­ی قبلی از خاک، از گیاه خارج شود.رشد گیاهان در اتاق رشد با 3 ̊C±27ودوره نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی، دانسیته­ی نوریفتوسنتزیµM S^-1 m² 151 انجام شد. گیاهچه­های 5 ماهه­ی لیسیانتوس تحت تیمار آلومینیوم (به شکل AlCl₃) در غلظت 300 میکرومولار یا NaH₂PO₄ در غلظت 3 میلی­مولار و تیمار توام  هر دو یون در بازه­ی زمانی 14روز قرار گرفتند. پس از گذشت مدت زمان تیمار، نمونه­های شاهد و تیمار شده (هر یک سه تکرار) برداشت شدند. پس از شستشو با آب مقطر، ساقه و ریشه­ی گیاهچه­ها از محل یقه­ جدا شده و پس از انجماد با نیتروژن مایع، تا زمان انجام آنالیز­های بیوشیمیایی در فریزر با دمای 80 ̊C- نگهداری شدند. آنالیز­های بعدی بر روی نمونه­ها نیز در سه تکرار مستقل صورت گرفت.

 

سنجش محتوای کلروفیل بافت برگ

200میلی­گرمازنمونه­هابا3 میلی­لیتراستون80درصدبهطورکاملساییدهشد.عصارهحاصلباقیفحاویکاغذصافیدربالنژوژه 25 میلی­لیتریصافشد.بهمنظورجمع­آوریکاملکلروفیلنمونه،کاغذصافیبااستون80درصدچندینبارشستشودادهشدوسپسمحتوایبالنبااستونبهحجم25میلی­لیتررسانده­شد.عصارهکلروفیلدرطولموج­های663و645نانومترخواندهشد[11]. 

مقدارکلروفیلa,b نمونه­هامطابقمعادله­هایزیرمحاسبهگردید:

12/7(D663) - 2/69(D645)] V/1000W}= میلی گرم کلروفیلa  در هر گرم وزن تر نمونه

{22/9(D645) - 4/68(D663)} V/1000W= میلی گرم کلروفیلb  در هر گرم وزن تر نمونه

 

در معادلات فوق D نمایانگر جذب عصاره­ی کلروفیل در طول موج ویژه­ی مذکور، V حجم نهایی عصاره­ی کلروفیل و W وزن تر بافت برگ بر حسب گرم می­باشد.

 

اندازه­گیری قند محلول کل

100 میلی­گرم از نمونه­ها در آب مقطر ساییده شده و پس از صاف کردن، محلول حاصل جهت سنجش قند کل استفاده شد. به لوله­های آزمایش محتوی 5/0 میلی لیتر محلول قندی، 5/0 میلی لیتر فنل 5 درصد و 5/2 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ افزوده شد. لوله­ها به مدت دهدقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند و پس از خنک شدن لوله­ها، جذب نمونه­ها در طول موج 490 نانومتر خوانده شد[5]. 

 

سنجش شدت پراکسیداسیون لیپید­های غشا

200 میلی­گرمازریشهنمونه­هایگیاهیدر3میلی­لیترمحلول10درصد(حجم/ وزن)تریکلرواستیکاسیدساییدهشد.سپسنمونه­هادر10000دوربهمدت15دقیقهسانتریفیوژشدند.به 1میلی­لیترازبخشبرروشناورحاصل،1میلیلیتر تیوباربیتوریکاسید 5/0 درصد افزودهشد.مخلوطحاصلدردمای70درجهسانتی­گرادبهمدت 30 دقیقهقرارگرفتوبلافاصلهدریخسردشد. جذب نمونه­هادرطولموج532نانومترو 600 نانومترتعیینشد[4]. 

 

سنجش محتوای پراکسید هیدروژن

به منظور سنجش مقدار H₂O₂ 100 میلی­گرم از هریک از نمونه­های ریشه و برگ گیاه لیسیانتوس در 3 میلی لیتر بافر TCA 1/0 درصد (وزن/حجم) سابیده شد. سپس نمونه­ها سانتریفیوژ شدند (rpm 12000 به مدت 15 دقیقه ) سپس به 1 میلی­لیتر از مایع بر روشناور حاصل 1 میلی­لیتر بافر پتاسیم فسفات و 2 میلی لیتر پتاسیم یدید ( (KI1 مولار اضافه شد و جذب نمونه­ها در طول موج 390 نانومتر تعیین شد[14]. 

 

استخراج و اندازه­گیری فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)

به­منظور استخراج PAL، 200 میلی­گرم از
نمونه­های منجمد شده با 3 میلی­لیتر بافر تریس- HCl  (50 میلی مولار، 2/8(pH ، حاوی بتا- مرکاپتواتانول (15 میلی مولار) در هاون روی یخ ساییده شد. سپس نمونه­ها پس از همگن­سازی، سانتریفیوژ (rpm 15000به مدت 30 دقیقه ) شدند و مایع بر رو شناور حاصل برای سنجش فعالیت PAL مورد استفاده قرار گرفت. به منظورسنجش فعالیت این آنزیم، مخلوط واکنش شامل یک میلی لیتر بافر استخراج، 5/0 میلی لیتر از L- فنیل آلانین 10 میلی مولار و 1/0 میلی لیتر ازعصاره آنزیم به مدت یک ساعت در حمام آب گرم قرار گرفت. واکنش با افزودن 1/0 میلی لیترHCl 6 مولار متوقف شد و فرآورده­ی آن به کمک اتیل استات استخراج شد. اتیل استات مورد تبخیر قرار گرفت و باقیمانده در 3 میلی لیتر سدیم هیدروکسید 05/0 مولار حل شد. غلظت سینامیک اسید با اندازه­گیری مقدار جذب در طول موج 290 نانومتر و به کمک استاندارد سینامیک اسید تعیین شد[20].

 

سنجش محتوای ترکیبات فنلی کل، آنتوسیانین و فلاونوئید

100 میلی­گرمازساقهوریشهنمونه­هایگیاهیشاهدوتیماربا3میلی­لیترمحلول متانولاسیدی) بهنسبت 99/1متانول در HCl) همگن شده و به مدت یک شب در مکانی تاریک قرار گرفتند. سپس نمونه­ها، سانتریفیوژ (rpm 15000به مدت 30 دقیقه ) شدند. محتوایکل ترکیباتفنلیبا اندازه­گیری  مقدار جذب در طول موج 280 نانومتر و به کمک استاندارد گالیک اسید، تعیین شد.

به منظور سنجش آنتوسیانین به مایع بر رو شناور حاصل از مرحله قبل 100 میلی­گرم PVP (Polyvinylpyrrolidone) اضافه شده و پس از یک دقیقه، مقدار جذب در طول موج 535 نانومتر تعیین شد.

200میلی­گرمازنمونه­هایمنجمدشدهبا3میلی­لیترمحلولاتانلاسیدی) بهنسبت 1/99 اتانل در استیک اسید) همگن شد. سپسنمونه­هادر5000دوربهمدت10 دقیقهسانتریفیوژشدند.پسازاینمراحلدرحمامآبگرمبادمای80درجهسانتیگرادبهمدتدهدقیقهقرارگرفتهوجذبآندرطولموج­های 270، 300 و 330 نانومتر اندازه­گیری شد[15].

 

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز

پس از استخراج آنزیم، فعالیت آن در سه حالت محلول، یونی و کووالانی متصل به دیواره مورد بررسی قرار گرفت. نمونه­های منجمد شده (400 میلی­گرم وزن تر) در 3 میلی­لیتر بافر (Tris–maleat) 50
میلی­مول) 6( pH  ساییده و با دور × g 12000بهمدت20دقیقهسانتریفیوژشد. بخش بر رو شناور حاصل برای سنجش پراکسیداز محلول (SPO) و رسوب آن برای سنجش پراکسیداز یونی و کووالانی استفاده شد.

 

پراکسیداز محلول (SPO)

3میلیلیترمخلوطواکنششاملبافرفسفات پتاسیم 60 میلی­مول (1/6(pH ، 28 میلیمولگایاکولو5میلیمولپراکسیدهیدروژن (H₂O₂)تهیهشدوجذبنوریآندر470نانومتراندازه­گیری شد.

 

پراکسیداز یونی (IPO) و کووالانی (CPO)

3 میلی­لیترمخلوطواکنشحاوی:بافرسدیمفسفات60میلیمولاربا(6(pH ، 6/41 نانو مول سیرین­گالدازین و 16 میلی­مول پراکسید هیدروژن وعصارهآنزیمیتهیهشدو جذب آن در 530 نانومتر خوانده شد[10]. 

محتوای پروتئین با متد برادفورد تعیین شد که در آن از BSA[1]با غلظت­های 50 تا 100 میکروگرم در میکرولیتر به عنوان استاندارد استفاده شد.

 

تعیین محتوای لیگنین

برای تعیین محتوای لیگنین ابتدا دیواره­ی سلولی، استخراج شد، به این منظور، ریشهوبرگنمونه­هایمنجمدشده (یک گرم) درآبمقطرساییدهوسپسبادور× g 1000 بهمدت ده دقیقه سانتریفیوژ شد.رسوبحاصل2باربااتانولمطلقوهرباربهمدت30دقیقهشستشودادهشدوپسازهربارشستشوبااستفادهازخلاء،رویقیفبوخنر،کاغذصافیونایلونمشصافشد.رسوبحاصلیکشبدر10حجمکلروفرم – متانول) 2:1 ( قرارگرفتوپسازصافکردن،رسوببا10حجماستونشستهوخشکشد.مادهخشکدیوارهحاصلساییدهوازالک 150میکرومتریرد شد.پودرحاصلبهمنظورتعیینمحتوایلیگنینباروشاستیلبرومایدهمراهباسیلیکاژل در دسیکاتورنگهداریشد[13]. به 6میلیگرمپودرساییدهشده­یدیوارهسلولی، 5/2 میلیلیترمخلوطاستیلبروماید25درصددراستیکاسیدو 1/0 میلیلیتراسیدپرکلریک70درصدافزودهشدوسپسبهمدت30دقیقهدرحمامآبگرمبادمای70درجهسانتیگرادقرارگرفتودرفواصل 10 دقیقهایتکاندادهشد.مخلوطلولههاپسازسردشدندریخبهبالنژوژههای25میلیلیترحاوی5میلیلیترهیدروکسیدسدیم(NaOH) 2 نرمالو6میلیلیتراستیکاسیداضافه شده و با استیک اسید به حجم 25 میلی لیتر رسانده شد.محتوای لیگنین با اندازه­­گیری جذب در 280 نانومتر و ضریب جذب مخصوص معادل g L^-1cm-1 20  تعیین شد.

 

سنجش محتوای آلومینیوم و فسفر

200 میلیگرمازساقهوریشهنمونه­هایگیاهیشاهدوتیمارشدهدرکروزه­هایچینی وزن شد ودرداخلکوره ابتدا 2 ساعت دردمای 350 و سپس بهمدت2ساعت در550 درجهسانتی­گرادخاکستر شدند.پسازسردشدنبهنمونه­ها،یک میلیلیترازمخلوطآبمقطر-HCl غلیظ )1:1)اضافهشد.سپسنمونه­هادرحمامشندردمای110درجهقرارگرفتهوپسازخشکشدن،5میلی لیتر HCl یک نرمال بهآن­هاافزودهشد.سنجشمحتوای آلومینیوم نمونه­ها با دستگاه جذب اتمی (V8, Shimadzu, JapanAA-670/G) و با استفاده ازاستانداردآلومینیوم(AlCl₃)درغلظت­های (500-50 ) میکرومولار انجام شد [9]. 

برای سنجش فسفر به محلول اسیدی حاصل از هضم خاکستر از هریک از محلول­های 1و2و3 به مقدار 5/2 میلی­لیتر اضافه شد. محلول 1 شامل HNO₃ و H₂O با نسبت 2:1 و محلول2 شامل NH₄NO₃ و HNO₃ و محلول 3 شامل آمونیوم مولیبدات بود. با افزودن آب دیونیزه به نمونه­ها، حجم نهایی به 25 میلی­لیتر رسید. پس از مدت 5 دقیقه، محتوای فسفر نمونه­ها با اندازه­گیری جذب نوری در 450 نانومتر، تعیین شد.

 

نتایج

محتوای کلروفیل بافت برگ

در گیاهان تیمار شده با فسفر و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر نسبت به گروه شاهد، مقدار کلروفیل a برگ افزایش معنی داری داشت. محتوای کلروفیل b برگ در تیمارهای توأم و مجزای آلومینیوم و فسفر در مقایسه با گیاهان شاهد، از نظر آماری معنی­دار نبود (شکل2و1).

 

شکل 1. تاثیرتیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای کلروفیل a در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.­

 

 

شکل 2. تاثیرتیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای کلروفیل b در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

محتوای قند محلول کل

محتوای قند کل ریشه در تیمار آلومینیوم و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر و محتوای قند کل برگ در تیمار فسفر نسبت به گیاهان شاهد افزایش داشت.اما تغییرات آن درتیمار توأم آلومینیوم و فسفر و تیمار مجزای آنها از نظر آماری تفاوت معنی داری با گروه شاهد نداشت(شکل 4 و3).

 

 

شکل 3. تاثیر تیمار300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر محتوای قند کل محلول اندام هوایی در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

شکل 4. تاثیر تیمار300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر محتوای قند کل محلول ریشه در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و محتوای پراکسید هیدروژن

در ریشه گیاهان لیسیانتوس تیمار شده با آلومینیوم، فسفر و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر غلظت مالون دآلدهید در مقایسه با گیاهان شاهد تغییر معنی داری نشان نداد (شکل 5).

 

 

 

شکل 5. تاثیر تیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر میزان پراکسیداسیون لیپیدی در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

مقدار هیدروژن پراکسید ریشه در تیمار آلومینیوم و تیمار توام آلومینیوم و فسفر در مقایسه با گروه شاهد به افزایش داشت و در تیمار فسفر از نظر آماری معنی دار نبود. محتوای H₂O₂در برگ گیاه لیسیانتوس در مقایسه با گیاهان شاهد تحت تیمار آلومینیوم، فسفر و تیمار توأم این دو، کاهش داشت (شکل 7 و6).

 

شکل 6. تاثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای هیدروژن پراکسید ریشه در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

شکل 7. تاثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای هیدروژن پراکسید اندام هوایی در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

فعالیت فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL)

در تیمار گیاهان لیسیانتوس با آلومینیوم و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر نسبت به گروه شاهد افزایش داشت ، در حالیکه فعالیت این آنزیم تحت تیمار فسفر تغییر معنی داری نداشت (شکل 8).

 

شکل 8. تاثیر تیمار300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر فعالیت آنزیم PAL در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارور هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

محتوای آنتوسیانین ، ترکیبات فنلی کل و فلاونوئید

محتوای آنتوسیانین ریشه در گیاهان لیسیانتوس تیمارشده آلومینیوم و تیمار توآم آلومینیوم و فسفر کاهش و در تیمار فسفر، افزایش معنی­دار داشت. همچنین مقدارآنتوسیانین اندام هوایی نسبت به گیاهان شاهد در تیمار آلومینیوم و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر افزایش داشت و در تیمار فسفر از نظر آماری معنی­دار نبود (شکل 10و9).

 

شکل 9. تاثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای آنتوسیانین ریشه در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

 

شکل 10. تاثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای آنتوسیانین اندام هوایی در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

محتوای ترکیباتفنلیمحلول ریشه نسبت به گروه شاهد در تیمار با آلومینیوم افزایش و در تیمار فسفر و تیمار توأم این دو، کاهش معنی دار داشت. محتوای ترکیبات فنلی برگ در تیمار فسفر افزایش معنی دار و در تیمار آلومینیوم و تیمار توأم این دو کاهش معنی­دار داشت (شکل 12و11).

 

 

شکل 11. تاثیرتیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر محتوای فنل ریشه در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

 

شکل 12. تاثیرتیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر محتوای فنل ریشه در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

نتایج حاصل از سنجش محتوای فلاونوئیدهای ریشه در سه طول موج 270و300و330 نانومتر، نشان داد که محتوای فلاونوئید در طول موج 270 نانومتر درگیاهان تحت تیمار آلومینیوم در مقایسه با گیاهان شاهد و در طول موج 300 نانومتر در ریشه گیاهان تیمار شده با آلومینیوم و فسفر نسبت به گیاهان شاهد افزایش داشت.

همچنین محتوای فلاونوئید در طول موج 330 نانومتر در ریشه گیاهان تیمارشده با آلومینیوم نسبت به گیاهان شاهد افزایش داشت، اما تغییرات آن در تیمار فسفر و توأم آلومینیوم و فسفر از نظر آماری معنی دار نبود (شکل 13).

 

شکل 13. تاثیر تیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای فلاونوئید در مقایسه با گروه شاهد.

 

فعالیت آنزیم پراکسیداز و محتوای لیگنین

فعالیت پراکسیداز محلول (SPO) و یونی IPO)) در ریشه گیاهان لیسیانتوس تیمار شده با آلومینیوم و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر در مقایسه با گیاهان شاهد کاهش ­یافت. در تیمار با فسفر فعالیت SPO در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش معنی دار و IPO تغییر معنی­داری نداشت(شکل 15و14). نتایج حاصل از سنجش فعالیت پراکسیداز کووالانی(CPO) کاهش فعالیت این آنزیم را در تیمار با آلومینیوم و افزایش را در تیمار فسفر نسبت به گیاهان شاهد نشان داد. تغییرات فعالیت CPO در تیمار توام آلومینیوم و فسفر معنی دار نبود (شکل 16).

محتوای لیگنین در ریشه­ی گیاهان لیسیانتوس تیمار شده با آلومینیوم  و تیمار توأم آلومینیوم  و فسفر کاهش و در تیمار فسفر افزایش معنی داری را نسبت به گیاهان شاهد نشان داد (شکل 17).

 

 

شکل 14. تأثیر تیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر فعالیت آنزیم­SPO در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهندهتفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 می­باشد.

 

 

شکل 15. تأثیر تیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر فعالیت آنزیم­IPO در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهندهتفاوت معنی­دار در سطح
p ≤ 0.05 می­باشد.

 

 

شکل 16. تأثیر تیمار 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر فعالیت آنزیم­CPO در مقایسه با گروه شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهندهتفاوت معنی­دار در سطح
p ≤ 0.05 می­باشد.

 

 

شکل 17. تاثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر چوبی شدن دیواره (محتوای لیگنین) در مقایسه با گروه شاهد.
داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

مقدار جذب آلومینیوم و فسفر

مقدار جذب آلومینیوم در ریشه­ و اندام هواییگیاهان تیمار شده با آلومینیوم افزایش و در تیمار توأم آلومینیوم و فسفر نسبت به گیاهان شاهد کاهش معنی­دار داشت. همچنین  محتوای آلومینیوم در اندام هوایی گیاهان تیمار شده با آلومینیوم و فسفرنسبت به شاهد کاهش داشت. محتوای آلومینیوم در ریشه و اندام هواییگیاهان لیسیانتوس تیمار شده با فسفر معنی­دار نبود (شکل 19و18).

 

شکل 18. تاثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای آلومینیوم ریشه در مقایسه با گروه­ شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی ­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

 

شکل 19. تأثیر تیمارهای 300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+P بر محتوای آلومینیوم اندام هوایی در مقایسه با گروه­ شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی ­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

جذب فسفر ریشه در تیمار مجزای آلومینیوم و فسفر و تیمار توأم این دو در مقایسه با گیاهان شاهد، افزایش داشت. همچنین محتوای فسفر در اندام هوایی گیاهان تحت تیمار مجزای آلومینیوم و فسفر در مقایسه با گیاهان شاهد کاهش داشت. محتوای فسفر اندام هوایی در تیمار توام آلومینیوم و فسفر نسبت به گروه شاهد تفاوتمعنی داری نداشت (شکل 21و20).

 

شکل 20. تأثیر تیمارهای300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر محتوای فسفر ریشه در مقایسه با گروه­ شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

 

شکل 21. تأثیر تیمارهای300 µM)) Al، P (3 mM) و Al+Pبر محتوای فسفر اندام هوایی در مقایسه با گروه­ شاهد. داده­هامیانگینسهتکرارودر هرگروه، حروف غیریکسان نشان دهنده تفاوت معنی­دار در سطح p ≤ 0.05 است.

 

بحث

ترکیبات فنلی از آنتی اکسیدا­ن­های دفاعی در مقابل تنش اکسیداتیو هستند. گروه­های هیدروکسیل آزاد متصل به حلقه­ی آروماتیک فنل از طریق حذف رادیکال­ها و دیگر مکانیسم­های دفاعی از آسیب­های اکسیداتیو به ساختار سلول می­کاهد. این ترکیبات با قابلیت آنتی اکسیدانی و سمیت­زدایی رادیکال­های اکسیژن، باعث افزایش مقاومت گیاه می­شوند.فلاونوئید یکی از بزرگ­ترین گروه­های ترکیبات فنلی با نقش دفاعی در مقابل تنش است. آنتوسیانین از رنگدانه­های محلول در آب و مسئول رنگ قرمز، بنفش و آبی در بسیاری از گل­ها، میوه­ها و دیگر بافت­های گیاه است. آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز ((PAL، آنزیم تنظیم کننده کلیدی در بیوسنتز ترکیبات فنلی (مانند فلاونوئید و آنتوسیانین) می­باشد[3]. این آنزیم، در تنظیم ژن­های رمز کننده آنزیم­های درگیر در بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها نقش داشته و سوبسترای لازم برای آنزیم پراکسیداز را نیز فراهم می­کند[19]. پراکسیدازها از آنزیم­های مهم در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان هستند. آنزیم پراکسیداز محلول ((SPOدر پاسخ به تنشو پراکسیدازهای کووالانی((CPO و یونی (IPO)آنزیم­های مهم دخیل در فرآیند سخت شدن دیواره سلول هستند که در تشکیل اتصالات کووالان بین کربوهیدرات و پلیمرهای فنلی و پلیمریزاسیون مونومرهای فنلی و تشکیل لیگنین دخالت دارند.در تحقیق حاضر آلومینیوم جذب شده درگیاهان لیسیانتوس باعث کاهش درصد چوبی شدن دیواره و در نتیجه افزایش انعطاف پذیری آن می­شود. در حالیکه فسفر در افزایش درصد چوبی شدن دیواره و در نتیجه افزایش سختی ریشه­ی گیاهان لیسیانتوس تیمار شده با فسفر، نقش دارد.آسیب به اسیدهای چرب غشا می­تواند منجر به تولید قطعات کوچک هیدروکربن از جمله مالون دی آلدهید(MDA)
می­شود.MDA محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غیر اشباع سلول می­باشد. از این­رو به عنوان یک نشانگر زیستی مناسب جهت تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از تنش اکسیداتیو در سلول­های حساس به کار برده _­­شده است[12]. در تحقیق حاضر مقدار MDA تغییر معنی­داری در گیاهان تیمار شده با آلومینیوم و تیمار توأم آلومینیوم و فسفر مشاهده نشده که نشان دهنده­ی عدم آسیب غشای سلولی است. می­توان نتیجه گرفت که آلومینیوم نه تنها منجر به ایجاد تنش و آسیب شدید در گیاه لیسیانتوس نشده بلکه با تأثیر بر افزایش انعطاف پذیری دیواره، در رشد طولی نیز نقش مثبت دارد. (آلومینیوم با غلظت 300 میکرومولار سیستم دفاعی گیاه را به طور محسوسی فعال نکرده و در نتیجه برای گیاه ایجاد تنش و سمیت نکرده است.

 

مراجع

[1]      شکوهی خدیجه، قناتی فائزه، (1386). تاثیر آلومینیوم بر کاهش رشد و تغییر در ترکیبات دیواره سلول­های توتون، نشریه علوم (دانشگاه خوارزمی) 864-855.

[2]      قناتی، ف.، نعمتی، ف. 1389 .تاثیرمثبتآلومینیمدرفعالکردنسیستمآنتی‌اکسیدانریشه‌هایگیاهلیسیانتوس(Eustoma grandiflora L.).زیست­شناسیگیاهیایران،سالدوم،شمارهدوم،41-53.

[3]      Chen, J. Y., Wen, P. F., Kong, W. F., Pan, Q. H., Zhan, J. C., Li, J. M., ... & Huang, W. D. (2006). Effect of salicylic acid on phenylpropanoids and phenylalanine ammonia-lyase in harvested grape berries. Postharvest Biology and Technology, 40(1), 64-72.

[4]      De Vos C.H.R., Schat H., De Waal M.A.D., Vooijs R., Ernst W.H.O. (1991). Increased resistance to copper-induced damage of root plasma membranein copper tolerant Cilene cucubalus. Plant Physiology, 82, 523-528.

[5]      Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Annual Chemistry, 28,350-356.

[6]      Fleming, A. L. (1983). Ammonium uptake by wheat varieties differing in Al tolerance. Agronomy Journal, 75(5), 726-730.

[7]      Foy, C. D. (1983). Physiological effects of hydrogen, aluminum, and manganese toxicities in acid soil. Soil acidity and liming, (soilacidityandl), 57-97.

 

[8]      Foy, C. D., Carter Jr, T. E., Duke, J. A., & Devine, T. E. (1993). Correlation of shoot and root growth and its role in selecting for aluminum tolerance in soybean. Journal of Plant Nutrition, 16(2), 305-325.

[9]      Ghanati, F., Morita, A., & Yokota, H. (2005). Effects of aluminum on the growth of tea plant and activation of antioxidant system. Plant and soil, 276(1-2), 133-141.

[10]  Ghanati, F., Morita, A., & Yokota, H. (2002). Induction of suberin and increase of lignin content by excess boron in tobacco cells. Soil Sci. Plant Nur48(3): 357-364.

[11]  Helrich, K. (1990) Official Method of Analysis of the AOAC. 15th Edition, Association of Official Analytical Chemists, Rockville.

[12]  Horst, W. J., Asher, C. J., Cakmak, I., Szulkiewicz, P., & Wissemeier, A. H. (1992). Short-term responses of soybean roots to aluminum. Journal of Plant Physiology,140(2), 174-178.

[13]  Iiyama K. and Wallis A.F.A. (1990). Determination of lignin in herbaceous plants by an improved acetyl bromide procedure, Journal of the science of food and agriculture,51,145- 161.

[14]  Jana, S., & Choudhuri, M. A. (1982). Glycolate metabolism of three submersed aquatic angiosperms during ageing. Aquatic Botany, 12, 345-354.

[15]  Krizek, D. T., Britz, S. J., Mirecki, R. M. (1998). Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv. New Red Fire lettuce, PhysiologiaPlantarum,103,1-7.

[16]  Liao, H., Wan, H., Shaff, J., Wang, X., Yan, X., & Kochian, L. V. (2006). Phosphorus and aluminum interactions in soybean in relation to aluminum tolerance. Exudation of specific48(3): 357-364.

[17]  Liao I.J., Lin Y.H., Huang K.L., Chen W.S. (2001). Vase life of Eustoma grandiflora as affected by aluminum.

[18]  Maejima,E., Watanabe, T., Osaki, M., Wagastuma, T. (2014). Phosphorus deficiency enhances Al tolerance of rice (oryza sativa) by changing the physiochemical characteristics of root plasma membranes and cell walls. Plant Physiology,171, 9-15.

[19]  MacDonald, M. J., & D'Cunha, G. B. (2007). A modern view of phenylalanine ammonia lyase. Biochemistry and Cell Biology, 85(3), 273-282.

[20]  Ochoa-Alejo, N., & Gómez-Peralta, J. E. (1993). Activity of enzymes involved in capsaicin biosynthesis in callus tissue and fruits of chili pepper (Capsicum annuum L.). Journal of Plant Physiology, 141(2), 147-152.

[21]  Shenoy, V. V., & Kalagudi, G. M. (2005). Enhancing plant phosphorus use efficiency for sustainable cropping. Biotechnology advances, 23(7), 501-513.

[22]  Wang, B., Wang, J., Zhao, H., & Zhao, H. (2006). Stress induced plant resistance and enzyme activity varying in cucumber. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 48(2), 138-142.