بررسی نیترات مازاد در آب آشامیدنی بر روی آنزیم‌های کبدی و هیستوپاتولوژی موش سوری باردار نژاد NMRI

زیست شناسی تکوینی

مقاله 2، دوره 7، شماره 3 - شماره پیاپی 27، شهریور 1394، صفحه 9-15   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

هدف از این تحقیق بررسی اثرات نیترات مازاد در آب آشامیدنی بر روی آنزیم‌های کبدی و هیستولوژی کبد موش باردار می‌باشد.تعداد 36 سر موش سوری باردار را در روز صفر بارداری به 3 گروه تقسیم شدند.گروه شاهد هیچ نیتراتی دریافت نکرد. گروه تجربی اول mg/l450 نیترات و گروه دوم تجربی دوم مقدار mg/l900 نیترات در آب آشامیدنی افزوده شد. در روز 17 بارداری موش‌های باردار را با اتر بیهوش و از بطن چپ آن‌ها خونگیری و بافت کبد مورد مطالعه هیستوپاتولوژی قرار گرفت.در این تحقیق از نرم‌افزار spss و آنالیز واریانس یک طرفه  ANOVA و image jجهت شمارش سلولی استفاده شد.در این مطالعه  از نظر ظاهری کاهش وزن موش‌های باردار و از نظر تست‌های بیوشیمیایی افزایش آنزیم‌های کبدی که شامل افزایش معنا‌دار در آسپارتات آمینوترانسفراز و افزایش در آنزیم آلانین آمینوترانسفراز مشاهده شد. هم چنین تغییرات هیستوپاتولوژی در کبد موش باردار سوری نشان داده شد.به نظر می رسد که نیترات مازاد در آب آشامیدنی سبب افزایش آنزیم کبدی و تخریب سلول‌های کبدی می‌شود.

کلیدواژه‌ها

بارداری؛ نیترات؛ آب آشامیدنی؛ کبد؛ AST؛ ALT

اصل مقاله

یکیازمهم‌تریننگرانی‌هایبشردرمحیط‌زیست مسئلهافزایشموادآلایندهبهآب‌هامی‌باشدکهبهصورتفاضلاب،نشتنفت،پساب‌هایموادآلیومعدنیکارخانجات،موادشیمیاییگوناگوناعمازفلزاتوشبهفلزاتاست، کهموجبآلودگیآب‌هایجهانبهاشکالمختلفمی‌شوند. ترکیباتنیتروژنی یکیازمهم‌ترینآلاینده‌هایمحیط‌زیستمی‌باشدکهازجملهمهم‌ترینوخطرناک‌ترینآن‌هاآمونیاکاست. بهطورکلیدرتقسیم‌بندیآلاینده‌هایآبوجودنیتریت،نیتراتوآمونیاکدلالتبروجودآلاینده‌هایشیمیاییمعدنیدرداخلمنابعآبیدارد[21].نیتراتبا ورود بهبدنازطریقبزاقواردجریانمایعدهانیمی‌گردد[11].تقریباً 25 درصدنیتراتبعد از جذب دربدنانسان،واردغددبزاقیشدهودربزاقبهطورفعالیتا 20 برابرتغلیظمی‌گردند. باکتری‌هایهم زیستبررویسطحتحتانیزبان، موجب احیای نیتراتتوسطآنزیم‌هاینیتراتردوکتاز می‌شود[17,18] با افزایش غلظت نیترات در آب آشامیدنی بیماری‌هایی ماننداثراتسوءکوتاهوبلندمدتنیتراتبرانسان دیده شده استکهمی‌توانبهایجادبیماریمتهموگلوبینما،اثربرجنینوبهویژهسرطاناشارهکرد[1] .برمبنایهمیناثراتنیتراتبرانسانبهخصوصایجادبیماریمت هموگلوبینما، دراکثرسازمان‌هاوکشورهاحدودمجازیازغلظتنیتراتدرآب‌ آشامیدنیوضعکردند[6] کبدبزرگ‌ترینغدهداخلیبدناستکهدربسیاریازفرایندهایاساسیفیزیولوژیکازجملهتنظیمقند،سنتزپروتئینپلاسما،سنتزلیپیدولیپوپروتئینوسنتزترشحاسید‌ صفراویوذخیرهویتامین‌های(b12.a.d.e.k)نقشمحوریدارد [7] اینارگاندرتغییرشکلبیولوژیک،سم‌زداییوترشحتعدادزیادیازترکیباتدرون‌زاداراینقشحیاتیاست[9]شاخصبالینیآسیبدیدگیکبد،انجامآزمایش‌هایکبدیاست،اگرچهاغلبآن‌هابرایکبداختصاصینیستند،اما در صورت تغییر در مقدار آن امکان اختلال در عملکرد کبد را نشان می‌دهد.اینآزمایش‌هاشاملASTALTسرمیبودهکهدرنکروزسلول هایکبدیافزایشمییابند[7].آلانینآمینوترانسفراز ALTیکآنزیمترانسآمینازاستکهعمدتاًدرکبدیافتمی‌شودوبهنسبتکمتریدرکلیه‌ها،قلب،عضلاتاسکلتی،خون وپانکراسوجوددارد. درصورتآسیبیانکروزسلول‌هایکبدیآنزیمALTسیتوپلاسمراترککردهوازغشاعبورمی‌کندوواردسرممی‌شود.[4,19]آسپارتاتآمینوترانسفرازASTیکآنزیمترانسآمینازاستکهعمدتاًدرکبد، هم چنبن درقلبنیز مقداریزیاد از این آنزیم موجوداست[19].قسمتعمده AST درداخلسلول‌هایکبدیدرمیتوکندریهپاتوسیت‌هاقراردارد. وقتیکهآسیبخفیفالتهابیانکروزدرسلول‌هایکبدیایجادشود ASTازطریقغشایسلول‌هایآسیبدیدهآزادمی‌شودوواردسرمخونمی‌شود.درآسیب‌هایشدیدمیتوکندری‌هایسلول‌هایکبدیتخریبمی‌شوندومقادیربیشتریاز AST آزادمی‌شود[19]. آلکالینفسفاتاز ALP آنزیمیاستکهدرسلول‌هایاستئوبلاستاستخوان،اپیتلومراه‌هایصفراوی،سلول‌هایکبدیونیزدرمخاطروده‌ها،کلیهوجفتقراردارد[19]. اهمیت انجام این تحقیق به دلیل نقش مهم کبد در بدن و خاصیت سمزدایی آن و هم چنین خطرات ناشی از نیترات مازاد در آب بر روی کبد و بافت آن است.

 

موادوروش‌ها

دراینمطالعه که در بهار سال 1393انجام گرفت،بهمنظوربررسیاثرنیتراتسدیممحلولدرآب آشامیدنی برروی کبدازموش‌هایبالغمادهسوریبامیانگینسنی8هفتهاستفادهشدکهدراتاقپرورشحیواناتدانشکدهزیست‌شناسیدانشگاهخوارزمیتکثیرشدهبودند،حیواناتقبلوطولآزمایشدرقفس‌هایاستانداردباسیکلروشناییوتاریکی12 ساعتبدونمحدودیت آبوغذادردرجهحرارت 20-24 سانتیگرادنگهداریشدند. دراینآزمایش 36 سرموشبعدازتعییناستروسوجفت‌گیریومشاهدهپلاکواژینالبه سهگروه12 تایی تقسیمشدند. گروهاولگروهکنترل،هیچنیتراتیدریافتنکردوگروه‌هایدوم وسومبهترتیب 450و 900 میلی‌گرمنیتراتسدیمدر 5/1لیتردرآبآشامیدنیدریافتکردند،لازم به ذکر است که آب مصرفی مورد استفاده در این تحقیق آب معدنی دماوند با مقدار مشخص و ناچیز  نیترات است. درروز17 بارداریموشوزنشدهوسپسبااستفادهازاتربیهوششدهو با سرنگ انسولین از بطن چپ قلب موش مادر خون‌گیری شد و کبد را از بدن موش خارج و مورد بررسی مورفولوژیکی قرار گرفتند، سپس کبدها را با سرم فیزیولوژی شستشو نموده و درفیکساتیوفرمالین 10% فیکسشدند. نمونه‌هایفیکسشدهبهالکل‌های 30 تا 100 % درهرکدامیکساعتبهجهتآب‌گیریمنتقلشدهوسپسنمونه‌هارادرتولوئنشفاف‌سازیکردهوبعدازحمامپارافیننهایتادرپارافینقالبگیریانجامشد. ازنمونه‌هابااستفادهازدستگاهمیکروتومبرش‌های 7 میکرونیتهیهشدوبهروشرنگ‌آمیزیهماتوکسیلینوائوزینبرش‌هایحاصلهرنگ‌آمیزیشدندومطالعهمیکروسکوپیصورتگرفتو جهت انجام شمارش‌ سلولی از نرم‌افزارimage j، جهت تجزیه تحلیل آماری از نرم‌افزار spss و هم چنین برایتحلیلومقایسهنتایجداده‌هایمربوطبهکبدموش بالغ باردار،ازآزمونآنالیز( ANOVA) واریانسیکطرفهمقایسهوجوداختلافمعنیداربینمشخصه‌هایمختلفازاستفادهشد. داده‌هابهشکلمیانگینو (Tukey) آزمونتوکیخطایمعیارنشاندادهشدهوسطحمعنی‌دارآنهادرحدP<0.05))درنظرگرفتهشد.

 

نتایج

در بررسی انجام شده در قسمت مورفولوژی کاهش وزن موش‌های مادر را نشان می‌دهد که این تغییرات در گروه‌هایی که دوز نیترات بالاتری دریافت کرده بودند- گروه‌های دریافت کننده نیترات (450و900 میلی‌گرم در لیتر)- تفاوت بیشتری مشاهده شد

(جدول1)

 

جدول 1: مطالعهمیانگینوزنموش‌هایباردارموردمطالعه

تجربیدوم	تجربیاول	کنترل	گروه‌ها
51	8/52	5/61	میانگینوزنموش‌هایباردارموردبررسی

 

درمطالعاتمیکروسکوپیموش‌هاییگروه اول و دوم تغییراتبافتیشدیدیدرساختارشانمشاهده شدوهمچنینسلول‌های کوپفر که سلول‌های دفاعی کبد هستند،درگروه‌‌های تجربی اول و دوم با مصرف نیترات بیشتر افزایش نشان داده که این افزایش در گروه تجربی اول بیشتر از گروه تجربی دوم است.

سلول‌هایهپاتوسیت در کبدباافزایشنیتراتکاهشمی‌یابد، کهاینکاهشدربینگروه‌هایکنترلوتجربیاولوهمچنینتجربیدوماختلافمعنی‌دارنمی‌باشدامابینگروهتجربیاولودوماختلافمعنی‌دارمیباشد.(نمودار 1)

 

نمودار 1: مقایسهمیزانسلول‌هایهپاتوسیت‌هایکبدیدرموشباردار

 

 

اختلاف معنی‌دار گروه تجربی دوم نسبت به گروه شاهد (P<0.05)همچنینباافزایشنیتراتفضایسینوزوئیدی نیزافزایشیافتهاست. همانطورکهدرشکلمشاهدهمی‌شودآرایشوبی‌نظمیسلولیدربافتکبدیدرگروه‌هایتجربیاولودومافزایشمی‌یابد.(شکل 1)

شکل 1 : مقطع بافتی از کبد موش باردار سوری. رنگ‌آمیزی هپاتوکسیلین ائوزین.با بزرگنمایی (100×)

 

 

نوک فلش: تغییرات هپاتوسیتی و فلش تغییرات سلول‌های کوپفر و افزایش آن را در سلول‌های کبدی نشان می‌دهد.

گروه A : گروه کنترل

گروه B : گروه تجربی اول

گروه C : گروه تجربی دوم

پیکان‌ها:نشان دهنده سلول‌های کوپفر و نوک پیکان‌ها نشان‌دهنده هپاتوسیت‌ها می‌باشد.

 

در بررسی بیوشیمیایی انجام شده تغییراتی در سلول‌های کبدی مشاهده شد که با افزایش مقدار نیترات آنزیم کبدی آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)، آمینو ترانسفرازALT)) نیز افزایش می‌یابد، که این افزایش در AST به صورت معنا دار است.(نمودار 2)

 

جدول 2:مقایسه آنزیم های کبدی در بین گروه های مورد بررسی

گروهتجربیدوم	گروهتجربیاول	گروهکنترل	گروه‌ها تست‌ها
306	214	109	AST
78	54	25	ALT
125	112	129	ALK

 

نمودار 2: مقایسه میزان آنزیم‌های کبدی در بین گروه‌های مورد بررسی

 

بحث:

نیتراتیکیازآنیون‌هایمعدنیمتشکلازسهاتماکسیژنو یکاتمنیتروژناستودرطبیعتازطریقترکیبشدنباکاتیون‌هابهحالتخنثیتبدیلمی‌شود.[2]نیتراتهمراهبانیتریتعمدتاًبهصورتمحلولدرمحیطزیستوجوددارند[16].نیترات‌هابه طورطبیعیدرموادطبیعیدرموادمعدنییافتمی‌شوند. آبآشامیدنیتنهادرمناطقیکهبهنیتراتآلودهباشدمیتواندنقشعمدهدرورودنیتراتبهبدنانسانداشتهباشد[1]. اگرغلظتنیتراتبالاترازحداستاندارد 45 میلی‌گرمدرلیترباشد،مصرفچنینآبیخطرناکمی‌باشد[3].

تحقیقاتزیادینشاندادندکهنیتراتبهخودیخودبرایسلامتانسانخطری ندارد،امابهدلیلوجودباکتری‌هایاحیاکنندهدرسیستمگوارشیوهمچنینوجود PH مناسبدرسیستمگوارشیمی‌تواندبهفرماحیاشدهوخطرناکنیتریتتبدیلگردد. نیتریتنیزمی‌تواندباآمین‌ها،آمیدهاوآمینواسیدهاترکیبشودوتشکیل N-nitroso دهد. بنابراینفرمخطرناکترکیباتنیتروژنهدربدن،نیتریتوترکیباتN-nitrosoمی‌باشد[5,6,10,11]کهازلحاظبیولوژیکیدربدنجاندارانپستاندارفعالهستندواثراتمرتبطباترکیباتنیتروژنهوبهخصوصنیتراتدرانسانبیشترمتوجهایندوترکیبمی‌شود[5]. هم چنیننیتروزآمینماده‌ایسرطان‌زامی‌باشدومی‌تواندمشکلاتیرادرسلامتیافرادبهوجودآورد. ازطرفیدیگرنیتروتریاکسیدهادرصورتواکنش‌هاباسوپراکسیدهادرداخلبدنمنجربهتشکیلپراکسینیتریت‌هامی‌شوندکهاینترکیباتموجبشکسترشته DNA واختلالدرتقسیمسلولیونهایتاً

خساراتبافتیخواهدشد[12,14,20].

طبقمطالعهRaat et al 2009نشاندادهشدهکهمصرفآبحاوینیتراتونیتریتسدیمباعثافزایشغلظتنیتراتونیتریتدرمعدهوپلاسمامی‌گرددوگزارششدهکهمصرفآبحاوینیتراتونیتریتسدیمباعثکم شدنغلظتنیتریتدربافتکبدوقلبمی‌شود[15] که در یافته‌های به دست آمده است با نیتراتمیتواندتغییراتیدربافتکبدمادرباردارایجادکند.اینتغییراتبهصورتاتساعدرسیاهرگمرکزلبولیبودهکهمی‌توانددراثراختلالدرعملکردبافتکبدباشد.

خطراتسلامتیبامصرفنیتراتسمیبهتواناییآندرتغییرهموگلوبینواکسیدهشدنآنوایجادمتهموگلوبینوابستهاست[8]. احتمالاً کاهشدرتعدادسلول‌هایهپاتوسیتبه علتتولیدرادیکال‌هایآزادازقبیلسوپراکسیدوانواعاکسیژن‌هایواکنشپذیریاستکهباعثپراکسیداسیونلیپیدهایغشاییوهمچنیناسیدهای‌ چربغیراشباعداخلسیتوپلاسمیمی‌شوند.اینعملدرنهایتموجبازبینرفتنغشاسلولوآسیببهسلول‌هایکبدیخواهدشد[22]در مطالعه حاضر کاهش سلول‌های هپاتوسیت مشاهده شد.

همچنیندراینمطالعهبزرگ‌ شدنهستههپاتوسیت‌ها،افزایشسلول‌هایدوهسته‌ایوبی‌نظمیدرلوبولاسیون،دالبراختلالومرگسلول‌هایکبدیومتعاقبآنبازسازیبافتکبدمی‌باشد.

البتهافزایشحجمسلول‌ها (هایپرتروفیشدنهپاتوسیت‌ها) احتمالاجهتجبرانکاهشذخیرهانرژیدرطیکمبوداکسیژن است،کاهش میزان اکسیژن امکان تاخیر در رشد و نمو بافت‌ها را سببمی‌شود. درتحقیقاتاولیهکهتوسطAsChina et alدرسال 1971 انجامگرفت،نشاندادکهترکیبسدیمنیتراتودیمتیلآمینسببنکروزدرکبدوتجمعوگرفتگیپورتالمرکزیدرموشمی‌گردد[22] بهطورمشابهدرمطالعه‌ایتخریبسلولکبدیوتخریبسلول‌هایکلیویبهخصوصدرحیواناتیکهبهمقدار 20mg\kg\day NaNo2 دریافتکردندمشاهدهشد .[13]

مانیز دراینمطالعهدربافتیمکهباافزایشمقدارنیتراتسلول‌هایکبدیدرحالتخریبشدنوبهعبارتیسلول‌هایکبدیدرحالنکروزهشدنمی‌رود. فاکتورهای بالینی سرم که نشان دهنده تخریب و اختلال در عملکرد کبد است که شامل آنزیم‌های کبدی که شامل ASTوALT استکهدرنکروزسلول‌هایکبدیافزایشمی‌یابندکهدراینمطالعهباافزایشنیتراتمقدارآنزیم‌هاافزایشمی‌یابد [19]. بهنظرمی‌رسدکهخساراتبافتیکبدیایجادشدهبهخاطروجوداینترکیباتدربافتمیباشد.

 

نتیجه‌گیری

نتایج حاضر از اینتحقیقنشانمی‌دهدکهمصرفنیتراتسدیممحلولدرآببهمیزان 450 و 900 میلی‌گرمدر لیتردرطولدورهبارداریسببتغییراتمورفولوژیکیوهیستوپاتولوزیکیکبدازجملهکاهشوزن، افزایش آنزیم‌های کبدی وآسیببافتیمی‌شودوتغییرات مشاهده شده،وابستهبهمیزاننیتراتسدیمدریافتیاستوازآن جاییکهکبدنقشحیاتیدرمسمومیت‌زداییدارداینمادهسبباختلالدرعملکرد کبدمی‌شود.

مراجع

[1]   DES. (2006), Nitrate and Nitrite. Health Information Summary.  Environmental Fact Sheet. New Hampshire Department of Environmental Services.; ARD-EHP-16.

[2]   EVS. (2005), Nitrate and Nitrite. Human Health Fact Sheet. Argonne National Laboratory; EVS.

[3]   Fewtrell, L. (2004), Drinking-water Nitrate, methemoglobinemia, and global burden of disease. Environ Health Perspec; 112(14): 1371–1374.

[4]   Finkelstein Y. Rezvani M. Garcia-Bournissen F. Nurmohamed L. (2007), Inactive pharmaceutical ingredients: implications for pregnancy; Can J Clin Pharmacol; 14: 17-28.

[5]   Gangolli SD et al. (1994), Assessment; Nitrate, nitrite and N-nitroso compounds.  European Journal of Pharmacology Environmental Toxicology and Pharmacology Section; 292: 1-38.

[6]   Gilchrist M. Winyard PG. Benjamin N. (2010), Review; Dietary nitrate – Good or bad? Nitric Oxide. 22:104– 109.

[7]   Hall JE. Editor. (2010), Guyton and Hall textbook of medical physiology. 12th ed; New York: Saunders; 999-1006.

[8]   Lundberg J.O. Weitzberg E. Gladwin M.T. (2008), The nitrate – nitrite – nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery; 7(2):156-167.

[9]   Majd A. Shariatzade M.(1998), Cellular and molecular biology. Arak: Arak University Publisher; 12-18 .

[10]Merusi C. Corradini C. Cavazza A. Borromei C.et al .(2010),Analytical Methods; Determination of nitrates, nitrites and oxalates in food products by capillary electrophoresis with pH-dependent electroosmotic flow reversal. Food Chemistry. 120: 615–620.

[11]Mitsui T. Kondo T.(2002), Assessing nitrate metabolism in the intestinal tract by measuring breath nitric oxide and nitrous oxide, and its clinical significance. ClinicaChimicaActa.; 319: 57–62.

[12]Moon HK. Yang ES.  Park JW. (2006), Protection of peroxynitrite-induced DNA damage by dietary antioxidants; Archives of pharmacal research; 29(3):213-217.

[13]Ozen. Hasan. (2014), Histopathologic, biochemical and genotoxic investigations on chronic sodium nitrite toxicity in mice.  Experimental and Toxicologic Pathology; page 9.

[14]Ozsavc. D. (2006), Oxidative DNA damage and repair system International. Journal of molecular biology, biochemistry and gene technology; 3(2): 57-61.

[15]RaatNJ. NougchiAC. LiuVB.RohrabacherN. et al. (2009), Dietary nitrate and nitrite modulate blood and organ nitrite and the cellular ischemia stress response. Free Radic Bill Med; 47(5): 510-7.

[16]Santamaria P. (2006), Nitrate in vegetables: toxicity, content, intake and EC regulation. J Sci Food Agric. 2006; 86: 10–17.

[17]Shrimali M. and Singh KP. (2001), New Methods of Nitrate Removal from Water. Environmental Pollution. 112(3): 351-359.

[18]Sobko T. Marcus C.Govoni M. Kamiya S. (2010), Dietary nitrate in Japanese traditional foods lowers diastolic blood pressure in healthy volunteers; Nitric Oxide; 22: 136–140.

[19]Soochan D. Keough V. Wanless I. Molinari M. (2012), Intra and extra-hepatic cystadenoma of the biliary duct; Review of literature and radiological and pathological characteristics of a very rare case. BMJ Case Rep.

[20]Szabó C. Ohshima H.(1997), DNA damage induced by peroxynitrite: subsequent biological effects. Official journal of nitric oxide; 1(5):373-385.

[21]Wright, P. A. & Wood, C. M. (1985), An analysis of branchial ammonia excretion in the freshwater rainbow trout: effects of environmental pH change and sodium uptake blockage; J. exp. Biol;11)4: (329-353.

[22]Zhu H, Chang L. Li W. Liu H. (2004), Effect of amygdalin on the proliferation of hyperoxia-exposed type II alveolar epithelial cells isolated from premature rat. J HuazhongUnivSciTechnolog Med Sci; 24(3): 223-5.