بهینه‌سازی کشت سلولی و افزایش تولید برخی متابولیت‌های ثانویه دارویی تحت تاثیر امواج فراصوت درکشت سلولی فندق (Corylus avellana L.)

زیست شناسی تکوینی

مقاله 3، دوره 7، شماره 3 - شماره پیاپی 27، شهریور 1394، صفحه 17-26   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

فراصوت می­تواند اثرات گوناگونی برسیستم‌های زنده بر جای گذارد. از مهم‌ترین این اثرات افزایش تولید متابولیت­های ثانویه دارویی در سیستم­های کشت سلولی می­باشد. امروزه تاکسان ها به عنوان یک دسته از متابولیت­های ثانویه مهم دارویی در درمان بسیاری از سرطان ها شناخته شده اند.این ترکیبات دارویی ابتدا از گیاه سرخدار استخراج گردیدند .در تحقیق اخیر کشت سلولی گیاه فندق در محیط بهینه  LSبه عنوان منبع مناسب تولید تاکسان ها معرفی می‌شود. همچنین در این تحقیق سلول­های جداکشت فندق در معرض امواج با توان خروجی mW/ cm²4 با فرکانس ثابتkHz 44/29در زمان­های متفاوت4،20،8و40 دقیقه قرار گرفتند. بر اساس نتایج بدست آمده امواج فراصوت با انرژی پایین در زمان­های کوتاه تابش،باعث افزایش زیتوده و تاکسان­های مورد مطالعه (تاکسول، باکاتین و 10- داستیل باکاتین III) گردید. با توجه به افزایش قابل توجه میزان تاکسان­های درون سلولی می توان گفت که امواج فراصوت با القای مسیرهای بیوسنتزی آنها باعث افزایش سنتز این ترکیبات در سلول­های فندق گردیده است. افزایش میزان فعالیت آنزیم فنیل آمونیالیاز ( ژن مرتبط با بیوسنتز تاکسان ها) تحت تاثیر فراصوت موید این  فرض می باشد.

کلیدواژه‌ها

امواج فراصوت؛ باکاتین III؛ تاکسول؛ 10- داستیل باکاتین III؛ فندق؛ فنیل آمونیالیاز

اصل مقاله

فراصوت (Ultrasound) به عنوان یک محرک فیزیکی شناخته می­شود که می­تواند سیستم­های زنده را تحت تاثیر قراردهد. این امواج می­توانند باعث تغییر ساختارها و چرخه‌های مختلف متابولیسمی شوند.استفاده از امواج فراصوت با انرژی بالا می­تواند اثرات مخربی ازجملهتخریب غشاهای سلول و مولکول­های مهم زیستی مانند آنزیم­ها و مولکول DNAداشته باشد.در حالیکه امواج با شدت و انرژی پایین می‌تواند اثرات مفیدی در این سیستم‌ها بر جای گذارد]3[. مطالعات نشان داده است که استفاده از امواج با توان‌های کمتر از  mW/cm²100می‌تواند باعث افزایش سرعت ترمیم استخوان آسیب دیده شود که با تحریک فرایند استخوان­سازی این عمل اتفاق می‌افتد ]6[. همچنین در سیستم­های کشت سلولی گیاهی نیز افزایش رشد کالوس و همچنین افزایش رشد سلول­ها در سیستم کشت تعلیقی در برنج و هویج تحت تاثیر امواج فرا صوت با انرژی پایین گزارش شده است]1و10.[ بر اساس این مطالعات می‌توان گفت اثرات امواج فراصوت بر سیستم­های زنده از یک سو به نوع سلول و پاسخ آن به این محرک فیزیکی و از سوی دیگر به انرژی این امواج بستگی دارد. عقیده بر این است که اتفاقات هیدرودینامیک از قبیل جریانات گردابی و پدیده cavitation که بدنبال اثر فراصوت در محیط­های مایع صورت می­گیرد باعث باعث القای تغییرات در سلول­ها می­شود]13[ تاکسان ها به عنوان یک دسته از متابولیت­های ثانویه مهم داروییدردرمانبسیاری از سرطان‌ها از جمله سرطان سینه و تخمدان شناخته شده‌اند]4[. امروزه منبع اصلی تولید تاکسول گیاه سرخدار و به ویژه لاین‌های سلولی آن می‌باشد. با توجه به اینکه گیاه و همچنین لاین‌های سلولی گیاه سرخدار بسیار کند رشد می باشد، جایگزینی یک منبع جدید گیاهی با توان ایجاد لاین‌های سلولی با رشد بالا، و همچنین استفاده از ابزاری مناسب برای افزایش راندمان تولید سلول‌های جداکشت و متعاقبا تولید تاکسان‌ها می‌تواند بسیار ارزشمند باشد. تحقیقاتاخیرنشانداده استکهگیاهفندقوکشتسلولی آننیزمی­تواند منبع جایگزین و مهمی برای تولید این ترکیبات می‌باشند]12[. بنابر این بهینه سازی محیط کشت سلولی و افزایش رشد سلول‌ها و تولید تاکسان‌ها در کشت سلولی فندق از اهداف اصلی این تحقیق می‌باشد.بدین منظور انتخاب محیط‌کشت بهینه و تاثیرامواج فراصوتبا توان­های متفاوت و زمان­های مختلف تابش، در محیط کشت تعلیقیبر برخی از پارامترهای فیزیولوژیک، مانند رشد سلول و تولید برخی تاکسان­های مهم(تاکسول و باکاتین و داستیل باکاتین III)و فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز PALبه عنوان یک آنزیم مهم در مسیرهاترارسانیپیامکه منجر به تولید متابولیت‌های ثانویه می‌‌شودمورد بررسی قرار می­گیرد.

 

موادوروش‌ها

انتخاب محیط بهینه برای رشد و نگهداری لاین سلولی موجودجهت انتخاب محیط بهینه،از لاین سلولی موجود که از بذرهای فندق رقم گرد اشکوردرمحیط MS با ترکیبات هورمونی (1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D  و 5/0 میلی‌گرم در لیترBA) بنیانگذاری شده بود استفاده گردید]12[.این سلول‌ها سپس در چهار محیط با ترکیبات هورمونی متفاوت انتخاب گردید (جدول1).پس از نگهداریسلول‌ها در این محیط‌ها وچند بار واکشت آنها، وزن کالوس­ها اندازه‌گیری شد و نتایج بدست آمده با هم مقایسه گردید.بر اساس نتایج بدست آمده، محیط LSبه عنوان بهترین محیط انتخاب گردید. بعد از چند نسل واکشت در این محیط، کشت تعلیقی (با همان فرمول ولی فاقد آگار) بنیان‌گذاری شد. سلول ها در محیط کشت تعلیقی در دمای C^° 25 در تاریکی و بر روی شیکر با سرعت 123 دور در دقیقه نگهداری شده و بعد از چندین واکشت، منحنی رشد سلول­ها رسم گردید (شکل1). بر اساس منحنی رشد، سلول‌ها هر بار در روز هفتم (در اوایل فاز لگاریتمی رشد) واکشت گردیدند.

 

جدول 1  محیط­های کشت بکار گرفته شده با غلظت­های متفاوت هورمونی

نام محیط	ترکیبات هورمونی
LS	IAA وNAA  3میلی‌گرم در لیتر+ Kinetin1/0 میلی‌گرم در لیتر
B5	BA وNAA22/0و86/1میلی گرم در لیتر
MS1	2,4-D  1 میلی‌گرم در لیتر و BA 5/0 میلی‌گرم در لیتر
MS2	BA 5/0 میلی‌گرم در لیتر+  NAA 3 میلی‌گرم در لیتر

 

 

شکل 1- منحنی رشد سلول های فندق در محیط کشت تعلیقی

 

ویژگی‌ها و کالیبراسیون سیستم مولد امواج فراصوت

برای ایجاد امواج فراصوت در دامنه‌های کیلوهرتز پایین، از یک سیستم طراحی شده داخلی استفاده گردید. این دستگاه از دو ترنسدیوسر(ناقل) با خاصیت پیزوالکتریک با سطح مقطع mm1/12و به طولmm20 تشکیل شده است که به طرفین بالن شیشه‌ای با حجمmL100 متصل شده است ]1[. نیروی لازم برای تولید امواج، توسط یک تثبیت کننده ولتاژ (جویا الکتریک،ایران) فراهم شد (شکل 2). کالیبراسیون آکوستیک برای توان و شدت دستگاه اولتراسوند در محیط آبی فاقد گاز با استفاده از بالانس نیروی تابشی (Radiation force balance) (Shrewsbury Medical Co, Shropshire, UK,±10%)و روش هیدروفون در فضای مکعبی PA124, Precision Acoustics Ltd, Dorchester) Dorset, UK, calibration range: 10 kHz - 20 (MHz, with a sensor diameter of 25 mm صورت گرفت. لازم به ذکر است که تمام مقادیر شدت تجربی گزارش شده همان شدت بیشینه (I_max)می­باشد. بر اساس نتایج کالیبراسیون، فرکانس واقعیدستگاه اولتراسوند 44/29 کیلوهرتز و کمترین و بیشترین شدت تولید شده توسط دستگاه، به ترتیب mW/cm²4و455بود.

 

شکل 2- دستگاه مولد امواج فراصوت

 

تیمار سلول ها با امواج فراصوت

سلول­های جداکشت فندق در معرض امواج با توان خروجی mW/ cm²4 با فرکانس ثابتkHz 44/22در زمان­های متفاوت 20،8،4 و40 دقیقه قرار گرفتند. سلول­ها در روز هفتم بعد از واکشت یعنی در فاز لگاریتمی تیمار شدند و بلافاصله وارد محیط جدید گردیدند و 6، 12، 24 ساعت و هفت روز بعد از تیمار، سلول­ها جمع‌آوری شده،و ابتدا با ازت مایع منجمد، سپس در دمای C^°80- جهت انجام آنالیزهای بیو شیمیایی نگهداری شدند.

 

آنالیزهای بیوشیمیایی

استخراج تاکسان‌های موجود در سلول و محیط کشت در روز هفتم بعد از تیمار سلول­ها با امواج فرا صوت صورت گرفت. سلول‌ها به کمک فیلتر از محیط کشت جدا شده و به وسیله ازت مایع پودر شدند. در خصوص تاکسان­های درون سلولی، ابتدابه سلول­های کاملاً پودر شده، mL10 متانول اضافه شد و به مدت 40 دقیقه مخلوط حاصله در سونیکاتور قرار گرفت. سپس مخلوط حاصله فیلتر شده و عصاره متانولی تبخیر گردید. به بخش باقیمانده mL2 آب دیونیزه و mL2 دی کلرومتان اضافه شد و به شدت تکان داده شد. فاز دی کلرومتان که حاوی تاکسول می‌باشد از آب جدا شده و مورد تبخیر قرار گرفت. باقیمانده حاصله در lµ150 متانول حل شد. سپس جهت انجام HPLC توسط فیلتر 45/0 میکرومتر فیلتر شد. برای اندازه‌گیری مقدار تاکسان­های مورد نظر از HPLC(Knauer, Germany) استفاده شد. ستون مورد استفاده(C18, 25 Cm x 4.6 mm I.D., 5 µm)، فاز متحرک متانول و آب ( v/v 40:60) هر یک حاوی 1/0 %
اسید استیک به صورت گرادیان با جریان (flow rate)mL1در دقیقه و طول موج مورد استفاده 227 نانومتر بود. شناسایی و اندازه گیری تاکسان­ها به کمک مقایسه Retention time نمونه ها با استاندارد تاکسول و باکاتین و داستیل باکاتین III استاندارد (سیگما) صورت گرفت ]12[. به منظور بررسی فعالیت آنزیمPAL، 200 میلی‌گرم سلول منجمد شده با 5/6 میلی‌لیتر بافر Tris-HCl(50 میلی مولار، 8/8 pH)حاوی بتا- مرکاپتواتانول (15 میلی مولار) درهاون روی یخ به مدت 2 دقیقه ساییده شد. سپس نمونه ها پس از همگن سازی، سانتریفوژ (rpm15000 به مدت 30 دقیقه) شدند و بخش رو شناور برای سنجش فعالیت PAL مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت PAL بر اساس مقدار تولید اسید سینامیک اندازه گیری شد.غلظت پروتئینکل نمونه‌ها نیز به روش برادفورد تعیین گردید]12[.

 

تجزیه و تحلیل آماری

کلیه آزمایشات با سه تکرار از حداقل 3 نمونه مستقل انجام گرفت. مقایسه میانگین ها با استفاده از نرم افزارSPSS نسخه 16 آزمونLSD  جهت تعیین معنی دار بودن تفاوت ها در سطح P≤ 0.05 انجام شد.

 

نتایج

رشد سلول­های فندق در محیط­های مختلف کشت

مقایسه رشد نسبی کالوس­ها در چند محیط با غلظت وترکیبات هورمونی متفاوت نشان داد که محیط LS با ترکیبات هورمونی درج شده در جدول1 از میان محیط­های مورد آزمایش، مناسب ترین محیط می­باشد.بطوریکه میزان رشد کالوس­ها به شکل معنی داری در این محیط در مقایسه با سایر محیط­های بکار گرفته شده افزایش یافت (شکل 3). بر اساس این نتایج کالوس‌ها به محیط کشت LS فاقد هورمون 2,4-D انتقال یافته و پس از چند نسل واکشت متوالی کشت مایع از این کالوس­ها پایه گذاری گردید.

 

 

(الف)

 

(ب)

شکل 3- اثر غلظت و ترکیب هورمون­های مختلف بررشد کالوس‌های فندق (اعداد داخل پرانتز مقدار تنظیم کننده رشد بر حسب میلی گرم در لیتر می باشد). مقادیر نشان داده شده میانگین 5 تکرار و حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت­ها در سطح 05/0  p ≤است.

 

اثر امواج فراصوت بر رشد و محتوای پروتئین

بررسی تغییرات رشد سلولی (وزن خشک) نشان داد که تیمار سلول­ها با امواج فراصوت با توان mW4 تا زمان 20 دقیقه نه تنها باعث کاهش رشد سلول­ها نگردید بلکه در زمان­های 8 و 20 دقیقه افزایش معنی‌دار رشد در مقایسه با شاهد مشاهده گردید. در این توان از امواج فراصوات، زمان تابش 40 دقیقه به صورت معنی‌داری باعث کاهش رشد سلول­هاگردید(شکل 4).تغییرات میزان پروتئین کل به صورت وابسته به زمان در سلول­ها تحت اثرامواج فراصوت، در شکل 5 نشان داده شده است. 6 ساعت بعد از اعمال تیمار در سلول‌هایی که 8 و20 دقیقه توسط امواج فراصوت تیمار شده بودند افزایش معنی‌دار میزان پروتئین کل در مقایسه با شاهد مشاهده شد در صورتیکه در سلول‌هایی که 40 دقیقه تیمار شده بودند کاهش معنی‌دار پروتئین در مقایسه با شاهد مشاهده شد. همچنین 24 ساعت بعد از اعمال تیمارافزایش معنی‌دار میزان پروتئین در 8 دقیقه تابش مشاهده گردید. 48 ساعت بعد از اعمال تیمار نیز افزایش معنی‌دار پروتئین در زمان­های 8 و20 تابش در مقایسه با شاهد مشاهده گردید (شکل 5). 

 

 

 

شکل 4- تاثیر امواج فراصوت با توان mW 4 در زمان‌های مختلف برمیزان رشد سلول‌های جداکشت فندق Corylus avellana L.)). مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSD ± (انحراف‌ معیار)می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت‌ها در سطح05/0 p ≤است.

 

 

شکل 5- تاثیر امواج فراصوت با توان mW 4 در زمانهای مختلف برمیزان پروتئین کل درسلول­های جداکشت فندق Corylusavellana L.)). مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSD ± (انحراف معیار) می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت­ها در سطح
05/0 p ≤است.

 

 

میزان تولید تاکسان‌ها (تاکسول،داستیل باکاتین و باکاتینIII) تحت تاثیر امواج فراصوتوجود سه تاکسان مهم (تاکسول، داستیل باکاتینDAB  و باکاتین III) در سلول­های جداکشت فندق به کمکESI/MS مورد تایید قرار گرفت (شکل 6).

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6- آنالیز عصاره کشت سلولی فندق و همچنین استاندارد تاکسول توسط LC-MS.A و C: طیفهای جریان یونی به ترتیب عصاره سلولی و محلول استاندارد و B و D: طیفهای جرمی بدست آمده به روش +ESI product ion مربوط به تاکسول موجود در نمونه و استاندارد. علامت ستاره پیک تاکسول را نشان می‌دهد.

مقادیر این تاکسان‌ها در سلولبهوسیلهHPLCو با استفاده از استانداردهای مربوطه اندازهگیری شد (شکل 7 الف). بر اساس این نتایج مشاهده می شود که میزان تاکسول درون سلولی در مقایسه با سایر تاکسان­ها بیشتر می‌باشد بطوریکه میزان آن در سلول‌های شاهد 5/1برابر میزان داستیل باکاتینDABو 8 برابر میزان باکاتین III کل در این سلول­ها بود. اندازه گیری میزان تاکسان­های درون سلول­های جداکشت فندق نشان داد که میزان تاکسان­ها در همه سلول­هایی که با دو توان mW4 و با زمان­های 4 الی 40 دقیقه توسط امواج فراصوت تیمار شده بودند در مقایسه با شاهد افزایش معنی‌داری داشت.متناسب با افزایش زمان تابش، تجمع تاکسان­ها به تدریج در درون سلول به صورت معنی‌داری افزایش یافت. بیشترین میزان تاکسول در سلول­هایی اندازه‌گیری شد که به مدت 20 دقیقه در معرض امواج فراصوت قرار گرفته بودند (5 برابر میزان تاکسول در سلول­های شاهد). میزان تغییرات 10-داستیل باکاتین و باکاتین III در سلول‌های تیمار شده با امواج فراصوت وضعیتی همانند تغییرات تاکسول نشان داد بطوریکه با افزایش زمان تابش، میزان این پیش‌سازهای تاکسول افزایش یافت. بیشترین میزان تولیدDAB  و باکاتین III درون سلولی، در کشت­های تیمار شده با فراصوت، با در زمان 20 دقیقه (به ترتیب 8/4 و 8/3 برابر سلول­های شاهد) (شکل 7 ب).

 

 

الف

 

ب

شکل 7- الف: کروماتوگرام های مربوط به HPLC عصاره سلولی فندق و استاندارد تاکسول. بالا) عصاره سلولی (زمان بازداری 83/15 دقیقه)، وسط) عصاره سلولی به اضافه استاندارد تاکسول (زمان بازداری 78/15 دقیقه) و پایین) استاندارد تاکسول (زمان بازداری 88/15 دقیقه). حرف T پیک تاکسول را نشان می‌دهد.

ب: تغییر درمیزان تاکسول، باکاتین III و داستیل باکاتین  III(DABIII)تحت تاثیر امواج فراصوت در سلول­های جداکشت فندق Corylus avellana L.)). مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSD ± (انحراف معیار) می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی دار بودن تفاوت­ها در سطح 05/0  p ≤است.

 

تاثیرامواج فراصوتبرفعالیتآنزیمفنیل‌آلانینآمونیالیاز(PAL)

فعالیت آنزیمPAL در تمامی سلول­هایی که تحت تاثیر امواج فراصوت قرار گرفته بودند 6 الی 48 ساعت بعد از تیمار به شکل معنی‌داری در مقایسه با شاهد افزایش یافت. بیشترین میزان فعالیت آنزیم 24 ساعت بعد از اعمال تیمار در سلول­هایی مشاهده می‌شود که به مدت 20 دقیقه در معرض امواج فراصوت قرار گرفته بودند بطوریکه در مقایسه با سلول­های شاهد 3 برابر افزایش فعالیت این آنزیم دیده شد (شکل 8).

 

 

 

شکل 8- تغییر فعالیت فنیل آلانین آمونیا لیاز  (PAL)تحت تاثیرامواج فراصوت با توان mW 4 و با سه زمان متفاوت تابش ،در طول زمان­های مختلف بعد از تیمار سلول­های جدا کشت فندق Corylusavellana L.)). مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSD ± (انحرافمعیار) می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنی‌دار بودن تفاوت ها در سطح 05/0  p  ≤است.

 

بحث

تولید متابولیت­های ثانویة گیاهی با خاصیت دارویی از طریق کشت سلولی در شرایط آزمایشگاهی، مزایای زیادی در مقایسه با استخراج این ترکیبات از گیاهان، تحت شرایط طبیعی دارد. از جمله این مزایا عدم وابستگی به تغییرات جغرافیایی و عوامل محیطی و در عین حال سرعت بالا و هزینه‌های پایین در تولید ذیتوده و متابولیت‌های دارویی را می‌توان نام برد. از دیگر مزایای این سیستم­ها می‌توان به امکان افزایش میزان زیتوده با استفاده از تغییر در محیط‌های کشت و همچنین افزایش توان تولید متابولیت‌های ثانویه توسط سلول‌ها با استفاده از محرک‌های زیستی و غیر زیستی اشاره کرد. نتایج بدست آمده از بهینه‌سازی محیط کشت سلول‌های فندق نشان داد که انتقال سلول‌ها به محیط کشت فاقد هورمون acid (2,4-D)Diphenoxy aceticنه تنها کاهش رشد را به دنبال نداشت بلکه می‌توان گفت بعد از چند نسل واکشت، رشد سلول‌ها در این محیط نسبت به محیطی که در آن پایه گذاری شده بودند بیشتر شده است. برخی مطالعات نشان می‌دهد که وجود هورمون 2,4-D در محیط‌کشت باعث افزایشسرعت رونویسی شده و ممکن است باعث تغییر ساختار کروماتین گردد. این عامل باعث بهم خوردن ثبات ماده ژنتیکی می‌شود ]11.[ بنابراین حذف این هورمون می‌تواند در حفظ ذخیره ژنی لاین­های ایجاد شده موثر باشد.بخشی از پاسخ­های دفاعی گیاهان در کشت­ سلول های گیاهی به شکل تولید متابولیت­های ثانویه است. این مسیرهای دفاعی را می­توان از طریق الیسیتورها القا و فعال کرد. اثر مثبت الیسیتورها وابسته به عوامل مختلفی از جمله رشد، زنده مانی سلول‌ها، ساختارهای درون سلولی و همچنین چگونگی تاثیر آن‌ها بر مسیرهای سیگنالینگ می­باشد. بنابراین درک مکانیسم اثر الیسیتورها و استفاده صحیح از آنها، بطوریکه در ضمن داشتن اثرات قابل توجه بر تولید متابولیت­های ثانویه، کمترین اثر منفی را بر فاکتورهای حیاتی سلول داشته باشند، ضروری است. امواج فراصوت به عنوان یک الیسیتور فیزیکی معرفی می‌شوند که اثرات متنوعی بر سلول‌های زنده دارند. مطالعات قبلی در این زمینه نشان داد که استفاده از امواج فراصوت در زمان­های کوتاه نه تنها باعث کاهش رشد و درصد زنده مانی سلول­ها نشده است بلکه تا حدی میزان زیتوده را نیز افزایش داده است. با توجه به اینکه ارتباط تنگاتنگی بین سنتز پروتئین و میزان رشد در متابولیسم اولیه وجود دارد در تحقیق اخیر میزان پروتئین کل سلول اندازه گیری شد و افزایش میزان پروتئین در زمان‌های 8 و 20 دقیقه تابش در مقایسه با کنترل تاییدی بر افزایش میزان زیتوده در سلول‌های جداکشت فندق می‌باشد. مطالعه بر روی گیاه آلوئه نشان داده است که امواج فراصوت با انرژی کم باعث افزایش فعالیت ATPase واکوئلی می­شود. با فعال شدن ATP aseH⁺به داخل واکوئل پمپ شده و این امر باعث ایجاد شیبPH می­شود و از این طریق انرژی لازم برای فعالیت پمپ­های ثانویه فراهم می­گردد. با افزایش فعالیت این پمپ‌ها، انتقال یون‌ها و متابولیت‌ها افزایش یافته که می تواند اثرات مثبتی بر رشد و متابولیت‌های اولیه داشته باشد.

البته کاهش میزان پروتئین در زمان40 دقیقه تابش حاکی از آن است که استفاده از امواج فراصوت با انرژی بالا می تواند باعث تخریب غشا سلول و در نتیجه مرگ سلولی شود]9[.فعالیت آنزیم PAL به صورت معنی داری در پاسخ به تیمار فراصوت نسبت به کشت‌های شاهد افزایش نشان داد. افزایش فعالیت این آنزیم در در سلول‌های جینسینگ و همچنین در سلول‌های سرخدار (T. yunnanensis) تحت تاثیر امواج فرا صوت گزارش شده است]14و16[.با توجه به اینکه PAL با راه‌اندازی سنتز فنیل پروپانوییدهای مختلف نقش مهمی در واکنش گیاهان به تنش‌های زیستی و غیرزیستی دارد و همچنین نشان داده شده است که الیسیتورهای قارچی، عوامل بیماریزا و ایجاد زخم به عنوان یک محرک مکانیکی باعث القای فعالیت این آنزیم می‌شوند ]7[. بنابراین بنظر می‌رسد با توجه به نتایج بدست آمده تیمار اعمال شده بویژه فراصوت با افزایش فعالیت PAL منجر به تجمع ترکیبات فنلی و القای متابولیسم ثانویه از جمله تاکسان‌ها گردید.. همچنینزنجیرهجانبیمولکولتاکسول،فنیلایزوسرین،ازمسیرفنیلپروپانوییدیبهدستمی‌آید.اندازه‌گیری میزان تاکسان‌ها در سلول‌های جداکشت فندق، افزایش این ترکیبات را در همه سلول­هایی که تحت تاثیر امواج فراصوت قرار داشته اند نسبت به سلول­های شاهد نشان می دهد. این نتایج مطابق با مطالعات قبلی در این زمینه می‌باشد که نشان داده است که تیمار کوتاه مدت سلول‌های گیاهی با امواج فراصوت با انرژی کم، بیوسنتز برخی متابولیت‌های ثانویه ارزشمند نظیر تاکسان‌ها و آلکالوئیدها افزایش داده است]8 و15[. البته این مطالعات بیشتر اشاره به افزایش تاکسول برون سلولی در اثر افزایش میزان نفوذپذیری غشا تحت تاثیر امواج فراصوت دارند. بر اساس نتایج به دست آمده از اندازه گیری میزان تاکسان­های درون سلولی مشاهده می شود که امواج فراصوت با القای بیوسنتز تاکسانها باعث افزایش تاکسانهای درون سلولی شده است. با توجه به حفظ تمامیت غشا سلول­ها در نتیجه تحریک مکانیسم­های نامبرده در طی القا استرس فیزیکی امواج فرا‌صوت و همچنین افزایش قابل توجه میزان تاکسان‌های درون سلولی می‌توان گفت که امواج فراصوت اثر قابل توجهای بر بیوسنتز تاکسان­ها داشته است و بیشتر از اینکه باعث افزایش خروج تاکسان­ها به محیط کشت شود با القای مسیرهای بیوسنتزی آنها باعث افزایش سنتز این ترکیبات در سلول­های فندق شده است. بنظر می‌رسد این محرک صرفاً فقط از طریق اثرات فیزیکی روی سلول ها باعث افزایش تولید تاکسول نشده بلکه القای متابولیسم ثانویه و واکنش­های دفاعی سلولی نیز مزید بر علت بوده است.

 

مراجع

 

[1]    Barber B. P. , R.A. Hiller, R. Lofstedt, S.J. Putterman, and K.R. Weninger (1997) Defining the unknowns of sonoluminescence. Physics Reports, 28: 165-143.

[2]    Bochu W., A. Yoshikoshi, and A. Sakanishi (1998) Carrot cell growth response in a stimulated ultrasonic environment. Colloids Surfaces B: Biointerfaces 12: 89-95.

[3]    Chen B., J. Huang, J. Wang,and L. Huang (2008) Ultrasound effects on the antioxidative defense systems of  Porphyridium cruentum. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 16: 88-92.

[4]    Christen A.A., D.M. Gibson, and J.Bland (1991) Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture, US Patent 5019504.

[5]    DahajipourHeidarabadi, M., F.Ghanati , and T. Fujiwara (2011) Interaction between boron and aluminum and their effects on phenolic metabolism of Linum usitatissimum L. roots. Plant Physiology and Biochemistry, 49: 1377-1383.

 

[6]    Ikeda K., T.Takayama, N.Suzuki, K.Shimada, K.Otsuka, and K.Ito (2006) Effects of low-intensity  pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12. cells Life Sciences, 79 :1936-1943.

[7]    Lawton M.A., and C.J.Lamb (1987) Transcriptional activation of plant defensegenes by fungal elicitor, wounding, and infection. Molecular and Cellular Biology, 7: 335-341.

[8]    Lin L.D., and J.Y.Wu (2002) Enhancement of shikonin production in single- and two- phase suspension cultures of Lithospermum erythrorhizon cells using low-energy ultrasound. Biotechnology and Bioengineering, 78: 81-88.

[9]    Liu Y., H.Takatsuki, A.Yoshikoshi, B.Wang, and A.Sakanishi (2003)  Effects of ultrasound on the growth and vacuolar H₁-ATP ase activity of aloe arborescens callus cells. Colloids Surface B, 32b: 105-116.

[10]Liu Y., Yoshikoshi A.,Wang B., and Sakanish A. (2003) Influence of ultrasonic stimulation on the growth and proliferation of Oryza sativa Nipponbare callus cells. Colloid Surface B, 27:287-293.

[11]Phillips R.L., S.M. Kaepplert, and P. Olhoft )1994) Genetic instability of  plant tissue cultures: Breakdown of normal controls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91: 5222-5226.

[12]Rezaei A., F.Ghanati, M. Behmanesh, and M. Mokhtari dizaji (2011) Ultrasoud –potentiated salicylic acid-induced  physiological effects and  production of Taxol in hazel (Corylus Anellana L.) cell culture. Ultrasound in Medicine and Biology,  37: 1938-1947.

[13]Sundaram J., R.Berlyn, Mellein, and S. Mitragotri(2003)An experimental and theoretical analysis of ultrasound-Induced permeabilization of cell membranes. Biophysical Journal, 84: 3087-3101.

[14]Wang J.W., L.P.Zheng, J.Y.Wu, and R.X.Tan (2006) Involvement of nitric oxide in oxidative burst, phenylalanine ammonia-lyase activation and Taxol production induced by low-energy ultrasound in Taxus yunnanensis cell suspension cultures. Nitric Oxide, 15: 351-358.

[15]Wu J., and  X.Ge (2004) Oxidative burst, jasmonic acid biosynthesis, and taxol production induced by low-energy ultrasound in Taxus chinensis cell suspension cultures. Biotechnology and Bioengineering , 85: 714-721.

[16]Wu J., and L.Lin (2002) Elicitor-like effects of low-energy ultrasound on plant (Panax ginseng) cells: induction of plant defense responses and secondary etabolite production. Applied Microbiology and Biotechnology , 59: 51-57.