تاثیرامواج فروصوت بررشد سلول‌های جداکشت توتون Nicotianatabacum L. cv. barley 21))

زیست شناسی تکوینی

مقاله 3، دوره 7، شماره 4 - شماره پیاپی 28، آذر 1394، صفحه 25-29   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

امواج مکانیکی فرو صوت که دارای فرکانس 0-20 هرتز می باشند توسط مولدهای طبیعی ومصنوعی فراوانیایجاد می‌شوند.تاثیر امواج فروصوت بر سلول‌های جانوری و انسان گزارش شده است.با وجود اینکه گیاهان نیز همچون جانوران به تحریکات مکانیکی حساس هستند و رشد ونمو آنها در پاسخ به سیگنال‌های مکانیکی دستخوش تغییراتی می شود اما تاکنون تاثیر امواج فروصوت برسلول‌های گیاهی بررسی نشده است.هدف مقاله حاضر بررسی تاثیر امواج فروصوت برتغییرات غشا، وزن‌تر،وزن خشک و وزن دیواره سلول‌های جدا کشت توتون Nicotianatabacum می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

امواج فروصوت؛ توتون؛ سیگنالینگ کلسیم؛ لیگنین

اصل مقاله

ازدیاد منابع فشارهای مکانیکی در دنیای امروزی زمینه تحقیق و بررسی اثرات آنها را بر فرآیندهای فیزیولوژیکی موجودات زنده فراهم می‌سازد. جانوران وگیاهان به واسطه حضور کانال‌ها و گیرندهایی در سطح سلول‌های خود قادر به درک و انتقال پیام‌های مکانیکی بوده و متناسب با شدت آن تغییراتی را درفرآیندهای زیستی خود بوجود می‌آورند [4]. رعدو برق، زلزله، بادوطوفان،پرواز پرندگانتوربین‌های بادی، کمپرسورها، قطارها، هواپیما و ادوات جنگی منابع مولد طبیعی و صنعتی امواجی هستند که در محدوده امواج با فرکانس 0-20 هرتز قرار گرفته و فرو صوت نامیده می‌شوند. بدلیل تولید بالقوه امواج فروصوت در بافت‌های جانوری، قرار گرفتن طولانی مدت در معرض این امواج مکانیکی منجر به تغییرات زیستی خواهد شد. تحقیقات نشان داده است که امواج فروصوت در سلول‌های جانوری موجب القاء کانال‌های حساس به تحریکات مکانیکی شده و میزان کلسیم درون سلولی بالا رفته که موجب فعالیت‌های علامت‌رسانی درسلول خواهد شد[1,3,9]محرک‌های مکانیکی در گیاهان با افزایش یون کلسیم موجب بیان ژن‌های دفاعی شده که سنتز متابولیت‌های ثانویه از جمله لیگنین‌ها را در پی دارد[8] با توجه به این که تاثیر امواج مکانیکی در مدل‌های انسان و جانوری بیشتر بررسی شده است، در این تحقیق تلاش شده است که تاثیر آن را بر میزان وزن تر و میزان رشد در گیاه توتون (Nicotianatabacum) که گیاهی دولپه‌ای و علفی واز خانواده بادنجانیان(Solanacoae)می‌باشد، بررسی شود.

 

مواد و روش‌ها

کشت سلولی و تیمار سلول‌ها با امواج فرو صوت

از لاین سلولی موجود در محیط تغییر یافته LS، کشت‌های تعلیقی بنیان گذاری و در دمای ⁰C2± 25 سانتی‌گراد در تاریکی و بر روی شیکر با 123 دور در دقیقه نگهداری شد.واکشت‌های متعدد جهت همگن‌سازی انجام شدو منحنی رشد سلول‌ها رسم گردید. سلول‌ها در ابتدای فاز لگاریتمی، برای مدت 0-15-30-45-75دقیقه در معرض امواج فروصوت بافرکانس ثابت 15 هرتز قرار گرفتند.

 

اندازه‌گیری رشد ووزن دیواره سلولی

از وزن‌تر و خشک به عنوان معیاری برای تعیین رشد سلول‌ها استفاده شد. بدین منظورسلول‌ها در فاز لگاریتمی تیمار شده و3 روز پس از تیمار مورد سنجش قرار گرفتند. سلول‌ها برای سنجش وزن تر روی قیف بوخنر واجد کاغذصافی و نایلون مش (µM42)و با استفاده از فشار منفی (پمپ خلاء) صاف شده و سپس وزن شدند. برای تعیین وزن خشک، سلول‌ها زیر هود خشک شدند و دوباره وزن شدند.برای سنجش وزن دیواره مقدار 5گرم سلول توتون در آب مقطر سائیده وسپس به مدت 30 دقیقه بادور 1000rpm سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل دو بار وهر بار به مدت یک ساعت با اتانل مطلق شستشو داده شدند و پس از هربار شستشو توسط پمپ خلاء ر وی قیف بوخنر، کاغذ صافی ونایلون مش صاف شدند. رسوب حاصل یک شب در محلول دو برابر حجم کلروفرم متانل قرار گرفت (2:1) و پس از صاف کردن، رسوب با استون دو برابر حجم شسته و خشک و وزن شدند.

 

اندازه‌گیری هدایت الکتریکیElectrical Conductivity; EC) ):

سلول‌های تیمار شده را پس از 24 ساعت روی قیف بوخنر با آب دیونیزه شستشو داده وسپس 200میلی‌گرم ازسلول‌ها را با 10 میلی‌لیتر آب دیونیزه
به مدت 30 دقیقه بر روی شیکر قرار گرفت.
هدایت الکتریکی محلول به وسیله دستگاه
(Electrical Conductivity Meter) در دمای 25درحه سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد.سپس نمونه‌ها به مدت یک ساعت در حمام آب 100درجه سانتی‌گراد قرلر داده شد وپس از سرد شدن دوباره EC آن‌ها قرائت شد. نشت الکتریکی غشای سلول‌ها از تقسیم EC اولیه بهECثانویه بدست آمده وبه درصد گزارش شد[8].

 

سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا(LPO):

200میلی‌گرم از نمونه در 3 میلی‌لیتر محلول 10%(حجم/وزن) تری ‌کلرو استیک ‌اسید(TCA)عصاره‌گیری شد. نمون‌ها در 12000rpm به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شدند. به یک میلی‌لیتر ازمحلول رو شناور یک میلی‌لیتر تیوبربیتوریک اسید (TBA) افزوده وبه مدت 20 دقیقه در حمام آب 100درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از سرد سدن لوله‌ها در یخ جذب آن‌ها در طول موج‌های nm532 وnm 600 با اسپکتروفتومتر خوانده شد میزان MDA با استفاده از ضریب ثابت mM^-1cm^-1  155 =є محاسبه گردید.

 

تجزیه و تحلیل آماری

کلیه آزمایشات با سه تکرار از حداقل سه نمونه مستقل انجام گرفت. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 22 و آزمون دانکن جهت تعیین معنی‌دار بودن تفاوت‌ها در سطح 05/0 ≥pانجام شد.

 

نتایج

وزن‌ترو خشک سلولهای توتون تیمار شده با امواج فروصوت به مدت‌های 30، 45 و 75 دقیقه نسبت به گروه شاهد افزایش معنی‌دار داشت(شکل‌های 1 و2).وزن دیواره در تیمارهای 45 و75 دقیقه در سلول‌های جدا کشت توتون نسبت به گروه شاهد افزایش معنی‌داری داشت (شکل3). اما میزان نشت الکترولیت‌ها از غشای سلول‌ها و نیز میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در سلول‌های جدا کشت توتون تحت تاثیر تیمار با اموج فرو صوت تغییر معنی‌داری با سلول‌های گروه  شاهد نشان نداد (شکل‌های 4 و5).

 

 

شکل1- تاثیر امواج فروصوت بر رشدسلول‌های جداکشت توتون

 

 

شکل2- تاثیر امواج فروصوت بر وزن خشک سلول‌های جداکشت توتون

 

 

شکل 3- تاثیر امواج فروصوت بر وزن دیواره  سلول‌های جداکشت توتون

 

 

شکل4- تاثیر امواج فروصوت بر نشت الکتریکی غشای سلول‌های جداکشت توتون

 

شکل5- تاثیر امواج فروصوتبر پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی  سلول‌های جداکشت توتون

بحث

قابلیت درک و پاسخ به محرک‌های مکانیکی در تمام موجودات زنده از اهمیت زیادی برخوردار است[10].به دنبال درک محرک‌های مکانیکی در سلول تغییراتی پدیدار می‌شود که از جمله می‌توان به تغییر پتانسیل غشا، تولید گونه‌های اکسیژن فعال که در پی افزایش کلسیم درون سلولی اتفاق می‌افتند اشاره کرد. کانال‌های کششی غشای سلولی پس از درک پیام مکانیکی به طور خودکار باز شده ویون کلسیم به درون سرازیر می‌شود. بالارفتن غلظت کلسیم درون سلولی پیامی برای اتفاقات پایین دست محسوب می‌شود و به دنبال آن تغییراتی در سلول بوجود می‌آید. افزایش رونویسی ژن کلمودلین و سنتز آن واتصال آن به کلسیم موجب فعال شدن فاکتورهای رونویسی شده که آغازگر نسخه‌برداری از ژن های پاسخ به رشد و پاسخ به تنش می‌باشد. اتصال کلسیم-کلمودلین به NADPH اکسیداز غشایی و فعال شدن آن تولید گونه‌های فعال اکسیژن را در پی دارد. بنابراین pH در داخل وخارج سلول تغییر کرده وموجب فعال شدن اکسپانسین‌ها شده که موجب رشد می‌شوند[5,7] گرچه در تحقیق حاضر امکان سنجش میزان کشش پذیری عشا میسر نبود اما شواهد حاضر این مکانیسم را تقویت می‌کند. در پی جریان سیگنالینگ کلسیمی عملکردهای تدافعی در سلول‌ها اتفاق می‌افتد که یکی از آنها رسوب لیگنین در دیواره بوده وموجب استحکام آن می‌شود. پیام دهی کلسیم موجب فعال شدن فاکتورهای رونویسی از ژن‌هایی می‌شود که مسیرهای دفاعی گیاه را تقویت می‌کند و موجب سنتز لیگنین می‌شود[2,6]حاصل تحقیق حاضر نیز نشان داد که استفاده از امواج فروصوتدر سلول‌های جدا کشت توتونNicotianatabacum L. cv. barley 21)) از یک سو میزان رشد سلول‌ها را افزایش داد وسبب افزایش زیتوده شدو از سوی دیگرهمزمان با حفظ تمامیت غشای سلولی شده است با افزایش وزن دیواره و احتمالا محتوای لیگنین آن موجب استحکام بخشیدن به سلولگردید.

مراجع

[1]   Alves-Pereira M., andN.A.A. CasteloBranco(2007)Vibroacoustic disease: Biological effects of infrasound and low-frequency noise explained by mechanotransduction cellular signalling. Progress in Biophysics and molecular Biology, 93: 256-279.

[2]   Castaneda P and Perez LM (1996). Calcium ions promote the response of citrus lemon against fungal elicitors or wounding. Phytochem. 42:595 - 8.

[3]   Cheng H., B.Wang, C.Tang, G.Feng, C. Zhang, L. Li, T. Lin, D. Fang, H. Duan, M.Shi, andG.Zhao(2012) Infrasound noise induces axonal degenaration of cultured neurons via Ca²⁺ influx pathway. Toxicology Letters, 212: 190-197.

[4]   Coutand, C. (2010)Mechano- sensing and tigmo-morphogenesis, a physiological and bio-mechanical point of view. Plant Science, 179: 168-182

[5]   Gabriele B., T.Monshausen, N. Bibikova, H. Manfred, and G. Simon. (2009). Ca2+ regulates reactive oxygen species production and pH during mechanosensing in arabidopsis Roots.The Plant Cell, 21: 2341–2356.

[6]   Iiyama K. and Wallis A.F.A. (1990). Determination of lignin in herbaceous plants by an improved acetyl bromide procedure, J. Sci. Food Agric. 51: 145- 161.

[7]   Kurusu T., K. Kuchitsu, M. Nakano, Y. Nakayama, andH. Lida(2013). Plantmechano-sensing and Ca²⁺transport. Trends in Plant Science, 8: 227-233.

[8]   Payez, A., F. Ghanati, M. Behmanesh, P.Abdolmaleki, A.Hajnorouzi, and E.Rajabbeigi(2012) Increase of seed germination, growth and membrane integrity of wheat seedlings by exposure to static and electromagnetic fields. Electromagnetic Biology andMedicine, 32(4):417-429.

[9]    Sahebjamei, H., P. Abdolmaleki, and F.Ghanati (2007). Effects of static magnetic field on the antioxidant enzymesactivities of suspensioncultured tobacco cells. Bioelectromagnetics, 28:42-47.

[10]Telewski F.W., (2006) A unified hypothesis of mechanoperception in plants. AmericanJournal of Botany, 93: 1466–1476.