تعداد نشریات | 418 |
تعداد شمارهها | 10,005 |
تعداد مقالات | 83,629 |
تعداد مشاهده مقاله | 78,550,462 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 55,697,840 |
سنتز، جداسازی و خالصسازی نانوذرات پروتئینی آلبومین و ژلاتین به عنوان حامل داروهای ضد سرطان | ||
مجله فناوری اطلاعات در طراحی مهندسی | ||
مقاله 3، دوره 5، پاییز و زمستان - شماره پیاپی 52، بهمن 1393، صفحه 44-54 اصل مقاله (7.05 M) | ||
نوع مقاله: مقاله پژوهشی | ||
چکیده | ||
چکیده: با وجـود کـاربرد بـالقوه نـانوذرات پلیمـری در صـنایع د اروسـازی ، یکـی از چـالش هـا بـرای کـاربرد نانوذرات در ابزار تشخیص و درمان سرطان، مربوط به خالص سازی و جداسازی آن هـا مـی باشـد ؛ لذا درسال های اخیر جداسازی نانوذرات توجه زیادی را در بسیاری از زمینه های علمی به خود جلب کرده است. هدف این مقاله، یافتن روش مناسب برای جداسازی و خالص سـازی نـانوذرات پروتئینـی به عنوان حامل دارو است (زیرا روش نامناسب از فعالیت زیسـتی نـانوذرات مـی کاهـد ) کـه بسـته بـه روش ساخت و خواص رهایشی نانوذرات متفاوت می باشد. درابتدا نانوذرات پروتئینی سرم آلبـومین گاوی، سرم آلبومین انسانی و نانوذرات ژلاتینی را به روش توده ای شدن تهیه کردیم، سپس با روش اولترافیلتراســیون، دیــالیز، ســانتریفوژ، ژل الکتروفــورز و FTIR بــه جداســازی و خــالص ســازی و مشخصه یابی آن ها پرداختیم. بهترین اندازه بـرای نـانوذرات سـرم آلبـومین گـاوی ، سـرم آلبـومین انسانی و ژلاتینی به ترتیب67،53 و 174 نانومتر ب دست آمد که نشان می دهـد ایـن نـانو ذرات بـرای دارورسانی بسیار مناسب می باشند. | ||
کلیدواژهها | ||
نانوذرات؛ دارورسانی؛ جداسازی؛ سانتریفوژ؛ اولترافیلتراسیون | ||
اصل مقاله | ||
1 -مقدمه در ده ســــال اخیــــر ، الگــــوی اســــتفاده از نانوداروبرها در محیط درون بدن (vivo in ( برای افزایش کـارایی و اثربخشـی بسـیاری از داروهـا، مخصوصــاً داروهـــای ضــد ســـرطان؛ چـــه در پژوهشهای دارویی و چه در مطالعات بـالینی، بـه خوبی تایید شـده و امـروزه سیسـتم هـای زیـادی مبتنی بر نانوذرات برای انتقال و هدف گیری دارو وجود دارند که یا به خوبی توسعه یافتـه انـد و یـا در حال توسعه هستند[2،1 . [ هـدف از اسـتفاده نانوداروبرهـا، کـاهش تخریـب داروها، جلوگیری از اثرات جانبی آن هـا ، افـزایش دسترسی به دارو و تجمـع دارو در محـل ضـایعه است. از جمله ویژگیهایی که بـرای نانوداروبرهـا پیش بینی می شود، میتوان به موارد ذیـل اشـاره کرد: راحت تر و ارزان تر تهیه می شوند، تجزیه پذیرند، ابعاد ذره ای کوچکی دارند، دارای قابلیت بارگیری بالا هستند، گردش طولانی مدت دارنـد و بـه طـور ایــده آلــی ایــن توانــایی را دارنــد کــه بــه طــور اختصاصی یـا غیـ ر اختصاصـی در محـل ضـایعه تجمع کنند[3 .[ در این زمینه سیسـتم هـای رهـایش کنتـرل شـده نقش مؤثری در رساندن عوامل فارمـاکولوژیکی و بیولوژیکی به نقاط مشخصی از بدن و رهایش آن با سرعت کنترل شده و بهینه ایفا می کنند؛ و لذا نه تنها تاثیر درمانی دارو را بیشتر می کنند، بلکـه از اثرات جانبی نامطلوب نیز می کاهند. از راهکارهای موفـق در ز مینـۀ رهـایش کنتـرل شـده ( مکـانی و زمانی) استفاده از سیستم های کلوئیدی می باشد. این سیستم شامل لیپـوزوم، نـانوذرات و ... اسـت . کپسـوله کــردن دارو درون نــانوذرات در حقیقــت روشــی بــرای محافظــت دارو در حــین انتقــال و همچنــین روشــی بــرای محافظــت بــدن در برابــر داروهــای بســیار ســمی مــی باشــد. اســتفاده از نانوذرات به جای میکروذرات سبب افزایش نسبت سطح به حجم میگردد. افزایش این نسبت موجـب افزایش نفوذ دارو از ذرات شده و برهمکنش دارو را با سلول ها و بافت ها افزایش میدهد. اندازة بسیار ریز این ذرات باعث میشود که آن ها به عمق بافتها نفوذ کرده و جذب سلولی آن ها افزایش یابد[4 .[ در میان ذرات داروبـری کـه تـاکنون شـناخته شـده ، لیپوزوم ها، مایسل هـا و نـانوذرات پلیمـری از همـه مشهورترند. این ذرات دارای ویژگـی هـای مطلـوبی بــرای کپســوله کــردن بســیاری از داروهــا و مــواد تشخیصــی (تصــویربرداری) هســتند[5 .[نــانوذرات لیپوزوم دارای خاصیت آبدوستی و آبگریزی هستند و بــه عنــوان حامــل دارو از طریــق کپســوله کــردن داروها مورد استفاده قرار می گیرند. لیپـوزوم هـای بارگذاری شده توسط دوکوروبیسین با اندازه حدود 100 نانومتر به طور تجاری برای درمان سرطان بـه کار می روند. با این حال اسـتفاده از لیپـوزوم دارای معایبی نیز می باشد از جملـه اینکـ ه قابلیـت کپسـوله کردن دارو در لیپوزومها کـم اسـت، داروهـای قابـل حل در آب در حضور ترکیبات خـون بـه سـرعت از درون آن خارج می شوند و در نهایت اینکه لیپـوزوم ها پایداری کمی دارد[6 .[ ا ی ـ مهندس حـی در طرا ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 46 بسته به روش تهیه نانوذرات، باقی مانده هـای سمی مختلف از قبیل حلال هـای آلـی، مونومرهـا، شـروع کننـده هـا، الکترولیـت هـا، سـرفکتانت هـا، کلوخه های پلیمری (نانوذرات به هم چسبیده) مـی تواند در مخلوط نانوذرات وجود داشته باشد. درجۀ جداسازی و خالص سازی ذرات بستگی بـه کاربرد نهایی نانوذرات دارد. مثلاً باقی مانده هـای پایدار کننده (PVA ( که غالباً در تهیه نانوذرات پلی استر به کار مـی رود در تجـویز هـای خـوراک ی و چشمی مشکلی به وجود نمی آورد؛ اما بـه منظـور تجویزهای تزریقی باید نانوذرات تصفیه شوند. اگرچه جداکردن کلوخه های پلیمری (نانوذرات بـه هم پیوسته ) به راحتی و توسط فیلتر کردن سـاده انجـام مـی شـود، امـا حـذف بقیـه ناخالصـی هـا مسـتلزم عملیـات پیچیـده اسـت. ژل فیلتراسـیون، دیالیز، اولتراسانتریفوژ از روشهای متداول بـرای حذف این ناخالصی ها به شمار میرود[ 11 . [ اما این روش ها فقط در مقیاس آزمایشگاهی عملی هستند و همچنـین ملکـول هـای سـنگین را بـا ایـن روش نمـیتـوان جـدا کـرد. بـه منظـور حـل ایـن مشـکلات از روش فیلتراسـیون افقـی ( flow cross filtration (اســـتفاده مـــی کننـــد. در ایـــن روش سوسپانســیون نــانوذرات از روی غشــای فیلتــر عبور داده می شود (جهت حرکت مایع به مـوازات فیلتــر اســت ). بســته بــه نــوع غشــا مــی تــوان میکروفیلتراسیون و یا اولترافیلتراسیون انجام داد. مخلوط چندین بار فیلتر شده تا تمام ناخالصی هـا دور ریخته شود. بعـد از چنـد بـار فیلتراسـیون از آنجایی کـه سیسـتم غلـیظ شـده (بـه دلیـل حـذف ناخالصی ها ) به همان مقدار آب اضافه مـی شـود تا حجم ثابت بماند با این روش به راحتی می توان ذرات بزرگ و ناخالصی را حذف کرد، بدون اینکـه هیچ تغییـری در انـدازه ذرات حاصـل شـود و بـه علاوه این روش در مقیاس هـای بزرگتـر نیـز بـه راحتی امکان پذیر است. سانتریفوژ- 1-1 سانتریفوژها به عنوان یک دستۀ مهم از دسـتگاه های جداسازی، در انواع ته نشینی و فیلتری و بـه صورت پیوسته و ناپیوسته عمل می کنند، محدوده عملیاتی آنها بسیار گسترده می باشد. جداسـازی و خــالص ســازی مایعــات، رطوبــت زدایــی و شستشوی جامدات، تقسیم بندی ذرات با توجه بـه انـدازه آن هـا، جداسـازی و اسـتخراج مایعـات از جمله کاربردهای معمول این دستگاه ها می باشـد . بــه طــور کلــی روش ســانتریفوژ عبارتســت از جداسازی جامد از مایع تحت تأثیر نیروی گریز از مرکز براساس اختلاف دانسیتۀ وزنی آن ها. فیلتراسیون- 2-1 فیلتراسیون، روش هـای جداسـازی مبتنـی بـر اختلاف فشار هستند که از غشاها برای جداسازی اجـزا، در محلــول مــایع و یــا سوسپانســیون، بــر اساس اختلاف در اندازه و بار ذرات، استفاده مـی کنند. فیلتراسیون به دو صورت امکان پذیر اسـت : فیلتراسـیون بـا جریـان نرمـال و فیلتراسـیون بـا جریان افقی. اختلاف این دو مدل در جهت جریـان خوراک است که این تفاوت در شکل (3 (نشان داده شده است. امل داروهای ضدسرطان سازی نانوذرات پروتئینی آلبومین و ژلاتین به عنوان ح سنتز، جداسازی و خالص 47 شکل (3 :(نمای شماتیکی از الف) فیلتراسیون نرمال و ب) فیلتراسیون افقی[ 12 .[ دیالیز- 3-1 فرایندی است که در آن ترکیب مواد حل شونده در یک محلول با در معرض قرار گرفتن با محلـول دیگر که از طریـق غشـای نیمـه تـراوا از هـم جـدا شدهاند، تغییر میکند. مولکول های آب و مـواد بـا وزن مولکولی کم مـی تواننـد از منافـذ غشـا عبـور کـرده، ولـی مــواد بـا وزن مولکــولی زیـاد ماننــد پروتئین ها نمیتوانند عبور کنند. 1-4 -ژل الکتروفورز به سبب اینکه ماکروملکول های زیستی مانند دی. ان. ای و پروتئین ها باردار هستند، میتوان با قـرار دادن آن هــا در یــک میــدان الکتریکــی، آن هــا را بــر اسـاس خـواص فیزیکـی ماننـد شـکل فضـایی، وزن ملکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظـور از روشی به نام الکتروفورز اسـتفاده مـی شـود . در ژل الکتروفـورز از یـک محـیط نیمـه جامـد (ژل) بـه عنوان فاز ثابت استفاده میشود. این نوع الکتروفورز برحسـب نـوع ژل بـه کـار گرفتـه شـده بـه دو نـوع الکتروفـــورز ژل پلـــی آکریـــل آمیـــد ( PAGE (و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم میشود. 1-5 -طیــف ســنجی تبــدیل فوریــه مــادون قرمز(FTIR ( طیف سنجی مادون قرمز بر اساس جذب تابش و بررســی جهــش هــای ارتعاشــی مولکــول هــا و یونهای چند اتمی صورت میگیرد. ایـن روش بـه عنوان روشی پرقدرت و توسعه یافته برای تعیین ساختار و اندازهگیری گونههای شـیمیا یی بـه کـار می رود. برهم کـنش تـابش مـادون قرمـز بـا یـک نمونـه باعـث تغییـر انـرژی ارتعاشـی پیونـد در مولکولهای آن مـی شـود و روش مناسـبی بـرای شناسایی گروههـای عـاملی و سـاختار مولکـولی است. برخی اطلاعاتی کـه مـی تـوان از FTIR بـه دست آورد، شامل موارد ذیل است: شناســایی کیفــی و کمــی ترکیبــات آلــی حــاوی نـانوذرات، تعیـین نـوع گـروه عـاملی و پیونـدهای موجود در مولکولهـای آن . بـرای تعیـین مقـادیر بسیار کم یون هیـدروژن فسـفات در هیدروکسـی آپاتیت که در اعضاء مصنوعی مورد استفاده قرار می گیرد و همچنین برای آنـالیز برخـی داروهـای حاوی نانو ذرات مورد استفاده قرار می گیرد. در ایـن مقالــه ابتــدا نـانوذرات ســرم البــومین گاوی، سرم آلبومین انسانی و نانوذرات ژلاتینی را ی ـ مهندس حـی در طرا ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 48 به روش جدایش فـازی در محلـول آبـی یـا روش محلول زدا تهیه می کنیم و جهت به دسـت آوردن ذرات در انـدازه هـای مناسـب و خلـوص بـالا بـا اسـتفاده از روش هـایی ماننـد: اولترافیلتراسـیون، دیالیزو اولتراسـانتریفوژ بـه جداسـازی و خـالص سازی آن ها می پردازیم. 2 -مواد پـودر سـرمآلبــومین گـاوی (جـزءV ،خلــوص %98 ،(پودر سرم آلبومین انسانی (جزءV ، خلوص %99- 96 ،(پودر ژلاتین نوع A ،تویین 20 ، اتـانول آمین، گلوتارآلدهید و استن که از شـرکت سـیگما تهیـه گردیـده ، اتـانول، سـدیم آزیـد و دیگـر مـواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان خریداری شده اند. 3 -روش ها 3-1 -آماده سازی نانوذرات سرم آلبـومین گاوی ساخت این نانوذرات بـا روش تـوده ای شـدن ساده و اتصال عرضی ذرات توسـط عامـل شـبکه ای کننده گلوتارآلدهید انجام شد[13،8 .[ ابتدا سرم آلبومین گـاوی را در 25 میلـی لیتـر آب مقطرحل کرده به آن HCl/Tris اضافه کرده سپس pH محلول را با استفاده از هیدروکسید سدیم به5 /7 رساندیم. در این مرحله اتانول را قطـره قطـره به محلول حاضر اضافه کرده تا اینکه رنگ محلول کدر شود. پس از تشکیل نانوذرات سـرم آلبـومین گاوی، به منظور تثبیت نانوذرات بدسـت آمـده 50 میکرولیتر گلوتارآلدهید به آن اضـافه گردیـد . ایـن محلول به مدت یک ساعت توسط همزن مغناطیسی همزده شد. سپس به ازای هر میلـی لیتـر از حجـم محلول نهایی 125 /0 میکرولیتر اتانول آمین به آن افزوده شده و مجدداً به ازای هر میلی لیتر از حجم محلول نهایی 01 /0 میلـی لیتـر تـویین 20 ،اضـافه گردید. در پایان محلول نانوذرات به دست آمده به مدت 1 ساعت توسط همزن مغناطیسی همزده شد. 3-2 -آماده سازی نانوذرات سـرم آلبـومین انسانی ساخت این نانوذرات بـا روش تـوده ای شـدن ساده که توسط مارتی و همکارانش پیشنهاد شده، انجام شد[ 14 . [ابتدا پودر سرم آلبـومین انسـانی را در 2 میلی لیتر محلـول 10 میلـی مـولار کلریـد سدیم حل کرده سپس بـا اسـتفاده از محلـول 1/ 0 نرمال هیدروکسید سدیم، pH را به 9 رساندیم. در این مرحله 8 میلی لیتر اتانول را بـه عنـوان عامـل ضـد حـلال بـه صـورت قطـره قطـره بـه محلـول پروتئینی اضافه نمودیم. پس از تشکیل نـانوذرات، بــا افــزودن گلوتارآلدهیــد، عامــل اتصــال دهنــدة عرضی دوتایی همگن، ذرات تثبیت شـدند . محلـول به دست آمده به مدت 24 ساعت در دمـای محـیط توسط همزن مغناطیسی همزده شد. 3-3 -آماده سازی نانوذرات ژلاتینی برای تهیۀ این نانوذرات ابتدا ژلاتـین نـوع A را در 25 میلی لیتـر آب مقطـر تحـت شـرایط دمـایی ثابت حل کردیم. سپس 25 میلی لیتـر اسـتن را بـه عنوان ضد حلال یکباره به محلول اضـافه نمـو دیم تـا ژلاتـین بـا وزن ملکـولی بـالا تـه نشـین شـود . محلول شناور دور ریخته شـده و ژلاتـین بـا وزن امل داروهای ضدسرطان سازی نانوذرات پروتئینی آلبومین و ژلاتین به عنوان ح سنتز، جداسازی و خالص 49 ملکولی بالا که ته نشین شـده بـود دوبـاره در 25 میلی لیتر آب مقطر حل شده و تحت شرایط دمایی ثابت همزده شد. pH محلول را بـه 5/2 رسـان ده و سـپس اسـتن را قطــره قطـره بــه محلـول اضــافه میکردیم تا رنگ محلول کدر شود. در این مرحلـه گلوتارآلدهید به عنوان عامل تثبیـت کننـده اضـافه شد. در نهایت محلول نانوذرات به دست آمـده بـه مدت 12 ساعت توسط همـزن مغناطیسـی همـزده شد. 4 -جداسازی و خالص سازی نانوذرات 4-1 -جداسازی و خالص سازی نـانوذرات سرم آلبومین گاوی جداسـازی و خـالص سـازی نـانوذرات ســرم آلبومین گاوی در چند مرحله صـورت مـی گیـرد . ابتدا ذرات بزرگتر توسط یک مرحله سانتریفوژ با سرعت g 36000 ،در دمای 4 درجـ ه سـانتی گراد و به مدت 20 دقیقه جـدا مـی شـوند . سـپس محلـول شناور حاصـل از ایـن مرحلـه را جـدا کـرده وارد کیسه دیـالیز مـی کنـ یم و بـه مـدت 14 سـاعت در محلول آب مقطر باpH برابر با5/7 قرار مـی دهـیم . در این مرحلـه نیـز مقـداری از ناخالصـی هـا جـدا مـی گردنـد و در نهایـت بـه منظـور تکمیـل فراینـد جداســـازی، از میکـــرو و اولترافیلتراســـیون در محدودة اندازه منافـذ 2 /0 تـا 02/ 0 میکرومتـر و کات آف 300 کیلو دالتون استفاده می شود. 4-2 -جداسازی و خـالص سـازی نـانوذرات سرم آلبومین انسانی به منظور جداسـازی و خـالص سـازی نـانوذرات سرم البومین انسانی به دسـت آمـده ، از 5 مرحلـه سانتریفوژ با سرعت g 25000 در دمای 25 درجه سانتیگراد و به مدت 10 دقیقه استفاده می کنیم به طوری که پس از هر با سانتریفوژ محلـول شـناور دور ریخته شده و قسمت ته نشین شده را مجـددا در محلول 10 میلی مولار کلرید سدیم پراکنده مـی شود. این پراکندگی مجـدد ذرات در محلـول اولیـه توسط قـرار دادن نمونـه در حمـام اولتراسـونیک صـورت مـی گیـرد. پـس از پایـان ایـن 5 مرحلـه سـانتریفوژ، نـانوذراتی بــا خلـوص بـالا خــواهیم داشت. 4-3 -جداسازی و خالص سازی نانوذرات ژلاتینی به منظور تهیه نانوذرات ژلاتینی با خلوص بالا، توسط سه مرحله سانتریفوژ با سـرعت g 15000 ودر دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه ، ناخالصی ها را جداسازی می کنیم. به این صورت که پس از هر مرحلـه سـانتریفوژ، محلـول شـناور دور ریخته شده و رسـوب حاصـله را در محلـول %30 اســتن ( 30 % اســتن و 70 % آب ) مجــدداً پراکنده می کنیم. در پایان مرحله سوم بـه منظـور جداســازی اســتن موجــود در محلــول حــاوی نانوذرات، این محلول را در حمام آب با دمـای 50 درجه سانتیگراد قرار می دهیم تا استن موجود در آن تبخیر گشته و نانوذرات با خلوص بالا حاصـل گردد. ی ـ مهندس حـی در طرا ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 50 5 -بررسی خواص فیزیکی و اندازة نانوذرات اندازة ذرات به دست آمده و مورفولوژی آنها را با استفاده از دستگاهها 2101-SALD PCS) محصول کشـور ژاپـن ) و AFM ) سـاخت شـرکت DME از کشور دانمـا رک) و SEM) XL30 سـاخت شـرکت فیلیپس) مورد بررسی قرار گرفت. 6 -ارائه نتایج و تحلیل یافته ها قطر ذرات فاکتور مهمی برای توزیع نـانوذرات در انــدام و نســوج بــدن اســت [ 15 .[ مطالعــات صورت گرفته در مورد توزیـع نـانوذرات در بـدن نشان می دهد که نانوذرات بزرگتر از 230 نانومتر در طحال به دلیل بخش های مـویینی کـه در انـدام وجود دارد انباشته میشود [ 16 .[ مطالعـاتی کـه بر روی بدن صورت گرفته نشان می دهد که سایز ذرات، جذب سلولی نانوذرات را تحـت تـأ ثیر خـود قرار می دهد. به عنوان مثال دسای و همکـارانش [ 17 [ نشان دادنـد کـه جـذب ذرات بـا انـدازة 100 نانومتر، 5/2 برابر ذرات با اندازه 1 میکرومتـر و همچنین 6 برابر جذب میکـروذرات 10 میکرومتـر در سلول های 2-Caco می باشد. علاوه بر انـدازه، ساختار و ویژگی های این ذرات نیز پارامتر مهمی در به کارگیری آنها به عنوان حامل دارو در بدن است؛ به طوری که این ذرات خود باید غیر سمی و به دور از هر گونه ناخالصی باشند. پس از ساخت نانو ذرات پروتئینی برای به دست آوردن اندازة ذره کوچکتر به جستجوی عوامـل مؤثر در اندازه پرداختیم و با روش های مناسب به جداسازی و خالص سازی آن ها پرداختیم و و سپس با استفاده از یک روش مناسب اقدام به بهینه سـازی نـانو ذرات نمـودیم . بـرای بهینـه ســازی از روش کســری از فاکتوریــل کامــل استفاده گردید، چون روش فاکتوریل کامل نیـاز به انجام تعداد زیادی (با توجه به شش عامـل و در سطوح مختلف حداقل به بـیش از پـنج هـزار ) آزمایش بود و روش یک عامـل در یکرمـان هـم نمی توانست تمامی خواسته های ما را برآورده نماید؛ زیرا احتمال در نظـر نگـرفتن بسـیاری از عوامـل وجـود خواهــد داشـت. در نتیجــه روش کسری از فاکتوریـل کامـل از میـان روش هـای فوق انتخاب گردید و در میان روش های آماری نیز با توجـه بـه در دسـترس بـودن و همچنـین کارهای مشابه انجام شده روش تاگوچی انتخاب گردید برای بهینه سازی از نرم افـزار تـاگوچی اسـتفاده ) Qualiteck – 4 version 4.82.0) مـدل گردید. برای بهینه سازی اندازه ذرات چهـار عامـل مـؤ ثر ذکر شده در چهار سطح انتخاب می شوند که مـی توان آنها را در جدول (1و2و3 (مشاهده نمود بـه نتایج ذیل دست یافتیم: جدول (1 :(عوامل و سطوح آن ها در فرایند ساخت نانوذرات پروتئینی سرم آلبومین گاوی عامل سطح 4 3 2 1 700 550 400 250 (rpm) همزن سرعت): A) (B :(غلظــــت پــــروتئین ( mg/ml) 30 20 10 5 8 7/5 7 6 pH:(C) دما): D) 0 34 24 14 4 ( C) امل داروهای ضدسرطان سازی نانوذرات پروتئینی آلبومین و ژلاتین به عنوان ح سنتز، جداسازی و خالص 51 جدول (2 :(عوامل و سطوح آن ها در فرایند ساخت نانوذرات پروتئینی سرم آلبومین انسانی عامل سطح 4 3 2 1 5 pH :(A) 9 8/5 8 7/ (B:(غلظت پروتئین (mg/ml) 100 75 50 25 (C:(نسبت حجم اتانول به پروتئین 4 3 2 1 (D:(نرخ افزودن اتانول به محلول پروتئین(min/ml ( 2 1/5 1 0/5 جدول (3 :(عوامل و سطوح آن ها در فرایند ساخت نانوذرات ژلاتین عامل سطح 4 3 2 1 ( دما): A) 0 60 55 50 40 C) (B :(غلظــــت ژلاتــــین (mg/ml) 60 55 50 45 80 75 65 60 (ml) استن حجم): C) 800 700 600 500 (rpm) همزن سرعت): D) با توجه به تعریف عوامل به صورت بـالا نـرم افزار تاگوچی تعداد 16 آزمایش را پیشنهاد نموده است. با توجه به تمامی ترکیب های ممکـن بـین 4 عامل در 4 سـطح، 256 آزمـایش بـرای پوشـاندن تمامی حالات ممکـن ضـروری بـوده اسـت (روش فاکتوریل کامل) اما تاگوچی از میان 256 آزمایش، تعداد 16 آزمایش را که بیشترین اثر چهـار عامـل مربوط را در خود دارند، مشخص و پیشـنهاد مـی کند (جدول 4 .( جدول (4 :(طراحی آرایه متعامد سطوح متغییرها A B C D شماره آزمایش 1 1 1 1 1 2 2 2 1 3 3 3 1 4 4 4 2 1 2 3 2 2 1 4 2 3 4 1 2 4 3 2 3 1 3 4 3 2 4 3 3 3 1 2 3 4 2 1 4 1 4 2 4 2 3 1 4 3 2 4 4 4 1 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 پس از انجام آزمایش ها مطابق آرایـه متعامـد، با وارد نمودن اعداد به دست آمـده از آزمایشـات در نرم افزار و انتخـاب گزینـه "هـر چـه کـوچکتر باشد بهتر است" نـرم افـزار بـا انجـام محاسـبات شرایط بهینه برای تهیـه نـانوذرات را بـه صـورت زیر پیشنهاد می کند (جدول 5 و 6 و 7 .(سپس در ایــن شــرایط انــدازة ذرات بــه دســت آمــده و مورفولوژی آن ها را با استفاده از دسـتگاه هـای PCS و AFM و SEM مورد بررسی قرار دادیم. تصاویر به دست آمده از SEM نشـان دهنـدة ایـن است که ذرات حاصله کروی یا شبه کـروی بـوده، دارای سطحی متراکم و یکنواخت هسـتند کـه ایـن ویژگی ها به همراه خلوص بالای بـه دسـت آمـده اثبات می کند، این نانوذرات می توانند بـه عنـوان حامل های دارویی به کار گرفته شوند. جدول (5 :(شرایط بهینه برای تهیۀ نانوذرات سرم آلبومین گاوی سرعت همزن (rpm) غلظت پروتئین(ml/mg ( ( 0C) دما pH 4 7/5 10 700 ی ـ مهندس حـی در طرا ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 52 که در این شرایط توانسـتیم ذراتـی بـا انـدازة متوسط 67 نانومتر را به دست آوریم. شکل (4 :(تصویر SEM از نمونه نهایی نانوذرات سرم آلبومین گاوی با بزرگ نمایی30000 برای مقایسۀ خلوص نانوذرات به دسـت آمـده با سرم آلبومین گـاوی خـالص از ژل الکتروفـورز PAGE-SDS استفاده شد (شکل 5 .(نمونه هایی بـا مقـادیر مختلـف (10، 20 و30 میکرولیتـر ) مــورد آنــالیز واقــع شــد . بانــدهای پــروتئین، خلــوص نـانوذرات بــه دســت آمــده را نشــان مــی دهــد و نوارهـــای موجـــود در شـــکل خلـــوص بـــالای محصولات را اثبات می کند. شکل (5 :(آنالیز نانوذرات سرم آلبومین گاوی با مقادیر 10، 20 و 30 میکرولیتر توسط ژل الکتروفورز [6 . [ ساختار ملکولی نانوذرات سرم آلبومین گـاوی نیز توسط طیف سنجی تبدیل فوریه مـادون قرمـز (FTIR ( مورد ارزیابی واقع شد (شکل 6 .( شکل (6 :(آنالیز نانوذرات سرم آلبومین گاوی با استفاده از . [8] FTIR نتایج به دست آمده از آنالیز نانوذرات سرم آلبومین گاوی نشان می دهد که این ذرات با اندازة مناسب و خلوص بالا، این قابلیت را دارند که به عنوان حامل مناسبی برای انتقال دارو به بدن به شمار آیند. جدول (6 :(شرایط بهینه برای تهیه نانوذرات سرم آلبومین انسانی pH غلظت mg/ml)پروتئین ( نسبت حجم اتانول به پروتئین نرخ افزودن اتانول به محلول پروتئین ( ml/min) 1/5 4 75 9 که در این شرایط توانستیم ذراتی با اندازه متوسط 53 نانومتر را بدست آوریم. شکل (7 :(تصویرSEM از نمونه نهایی نانوذرات سرم آلبومین انسانی با بزرگ نمایی 60000 امل داروهای ضدسرطان سازی نانوذرات پروتئینی آلبومین و ژلاتین به عنوان ح سنتز، جداسازی و خالص 53 شکل (8 :(تصویرAFM از نمونه نهایی نانوذرات سرم آلبومین انسانی جدول (7 :(شرایط بهینه برای تهیه نانوذرات ژلاتین 0 دما ( C) غلظت ژلاتین ( mg/ml) حجم استن (ml) سرعت همزن (rpm) 700 80 45 50 در این شرایط موفق به تهیـه ذراتـی بـا انـدازه متوسط 174 نانومتر شدیم. شکل (9 :(تصویرSEM از نمونه نهایی نانوذرات ژلاتینی با بزرگ نمایی 60000]18 [ شکل (10 :(تصویر AFM از نمونه نهایی نانوذرات ژلاتینی[18 [ 7 -جمع بندی در سال های اخیر در زمینۀ بهبود دارودرمانی بـه صورت توزیع کنترل شده دارو در بدن به منظـور کـاهش اثـرات جـانبی داروهـا تحقیقـات وسـیعی صـورت گرفتـه اسـت . سیسـتم هـای د ارورسـانی جدید و متنوعی در اندازة میکرو و نـانومتر بـرای غلبه بر این مشکل تولید شدند. نــانوذرات پروتئینـــی کاربردهـــای بســـیاری در داروسازی و پزشکی دارند. از بین پـروتئین هـای مـورد اسـتفاده، آلبـومین هـا و ژلاتـین بیشـترین کاربرد را دارند. آلبومینهـا بـه طـور گسـترده در سیستم های رهاسازی کنتـرل شـده و بـه عنـوان ابزاری برای انتقال عوامل درمانی به سـایت هـای ی ـ مهندس حـی در طرا ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 54 مورد نظر، مورد بررسی و مطالعه قرار گرفته اند. هــدف از انجــام ایــن تحقیــق، ســاخت نــانوذرات پروتئینی مناسب از لحـاظ انـدازه و کیفیـت، جهـت انتقال هوشمندانه و هدفمنـد دارو بـه نقـاط مـورد نظر بوده است. در ایـن تحقیـق از روش تـوده ای شــدن بــرای ســاخت نــانوذرات پروتئینــی ســرم آلبــومین انســانی (HSA ،( ســرم آلبــومین گــاوی (BSA(و ژلاتین نوع A استفاده شـده اسـت . تـ أثیر عوامـل مختلفـی ماننـد دمـا، pH ،غلظـت پـروتئین، سرعت همزن، حجـم ضـد حـلال و ... روی انـدازه ذرات مورد بررسی قرار گرفت. بـه منظـور بهینـه سـازی انـدازه ذرات از نـرم افـزار تـاگوچی مـدل . گردیـد اسـتفاده ) Qualiteck – 4 version 4.82.0) پـس از سـاخت نـانوذرات نوبـت بـه جداسـازی و خالص سازی آن ها می رسد. از آنجا که تهیه این نانوذرات به منظور کاربرد در سیستم های انتقـال دارو به عنوان حامل داروهـای ضـد سـرطان مـی باشد، جهت به دست آوردن ذرات در انـدازه هـای مناسب و خلوص بـالا بـا اسـتفاده از روش هـایی مانند: اولترافیلتراسیون، دیـالیز ، اولتراسـانتریفوژ ، ژل الکتروفـورز و FTIR بـه جداسـازی و خـالص ســازی آن هــا پــرداختیم و در نهایــ ت موفــق بــه ساخت ایـن ذرات در انـدازه هـای بسـیار کوچـک (نــانوذرات ســرم آلبــومین گــاوی 67 نــانومتر، نــانوذرات ســرم آلبــومین انســانی 53 نــانومتر و نانوذرات ژلاتین 174 نانومتر) و با خلوص بسیار بالا شدیم که در نوع خود بی نظیراست. بارگذاری دارو بر روی این نانوذرات هدف بعدی و موضوع مقالات آینده خواهد بود. 8 -تقدیر و تشکر نویسندگان مقاله مراتب تشکر خود را از مرکـز تحقیقاتی نانو بیوتکنولوژی بابل به منظور فـراهم کردن تسهیلات لازم برای انجام این تحقیق ابـراز داشته و به طور ویژه از پرفسور نجف پور، آقـای مهندس رحیمنـژاد، خـانم مهنـدس بابـای ی و خـانم مهندس گل بیانی تقدیر می نمایند. | ||
مراجع | ||
[1] RH Miiller; “Colloidal carriers for controlled drug delivery and targeting”. Wissenschaftliche verlagsgesellschaft: Stuttgart, Germany and CRC Press: Boca Raton, 1991. [2]S Cohen, H Bernstein (eds); “Microparticulats systems for the delivery of proteins and vaccines”, Marcel Dekker, New York, 1996. [3] R Gref, Y Minamitake, MT Peracchia, V Trubetskoy, VP Torchilin, R Langer; “Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres”, Science 263, 1994, 1600. [4]G Panyam, V Labhasetwar: “Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue”, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 55, 2003, 329-347. [5] F Yuan, M Dellian, M Fukumura, M Leunig, BD Berk, VP Torchilin, RK Jain; “Vascular permeability in a human tumor xenograft, Molecular size dependence and cutoff size”, Cancer Res55, 1995, 3752. امل داروهای ضدسرطان سازی نانوذرات پروتئینی آلبومین و ژلاتین به عنوان ح سنتز، جداسازی و خالص 55 [6] M Rahimnejad, M Jahanshahi, G. D Njafpour: “Production of biological nanoparticles from bovine serum albumin for drug delivery”, Afr. J. Biotechnol, 5 (20), 2006, 1918-1923. [7] L Brannon-Peppas, J.O Blanchette; “Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy”, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 56, 2004, 1649-1659. [8] M Jahanshahi, G. D Njafpour, M Rahimnejad; “Applying Taguchi method for optimized fabrication of bovine serum albumin (BSA) nanoparticles as drug delivery vehicles”, Afr. J. Biotechnol, 7(4), 2008, 362. [9] M Jahanshahi, M H Sanati, S Hajizadeh, Z Babaei; “Gelatin nanoparticle fabrication and optimization of the particle size”, Phy. Stat. sol. (a), 2008, 1-5. [10] M Jahanshahi, Z Babaei; “Protein nanoparticle: A unique system as drug delivery Vehicles”, Afr. J. Biotechnol, 7(25), 2008, 4926-4934. [11]Hand book of drug delivery systems, Nanoparticles. [12] Protein Concentration and Diafiltration by Tangential Flow Filtration, [Internet source], Millipore, Viewed 2007-10-01, Available at: http://www.millipore.com/techpublications/tech1/tb032 [13] M Jahanshahi, Z Zhang, ALyddiatt; “Subtractive chromatography for purification and recovery of Nano-bioproducts”, J.IEE Proc-Nanobiotechnol, 152(3), 2005, 121-126. [14] J.J Marty, R.C Oppenheimer, P Speiser; “Nanoparticles-a new colloidal drug delivery system”, Pharm. Acta Helv, 53, 1978, 17-23. [۱۵ [سید عباس شجاع الساداتی، محمد علی اسـدالهی، بیوتکنولوژی صنعتی. انتشـارات دانشـگاه تربیـت مدرس، ۱۳۸۱ . [16] J Kreuter; “Peroral administration of nanoparticles”, Adv Drug Del Rev 7(1), 1991, 71-86. [17] MP Desai, V Labhasetwar, E Walter, RJ Levy, GL Amidon; “The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells in size dependent”, Pharm Res 14 , 1997, 1568 -1573. [18] M Jahanshahi, MH Sanati , Z Babaei; “Optimization of parameters for the fabrication of gelatin nanoparticles by the Taguchi robust design method”, Journal of Applied Statistics, 35, 12, 2008, 1345–1353, | ||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 4,538 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 2,154 |