سنتز و بهینه سازی نانوذرات سرم آلبومین انسانی به منظور انتقال هدفمند دارو

مجله فناوری اطلاعات در طراحی مهندسی

مقاله 8، دوره 6، بهار و تابستان 1392 - شماره پیاپی 61، شهریور 1393، صفحه 2-12   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

رابعه مهر اور^{* 1}؛ محسن جهانشاهی²

¹دانشگاه آزاد اسلامی ،واحد آمل

²دانشگاه ازاد اسلامی آمل

چکیده

چکیده: در سالهای اخیر کاربرد نانوذرات پروتئینی به دلیل دارا بودن ویژگیهای منحصر به فرد، در صنایع دارویی بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. در تحقیق حاضر، نانوذرات سرم آلبومین انسانی به دلیل زیسـت تخریب پذیری، ظرفیت بالای بارگذاری دارو و عدم سمیت با روش نامحلول کردن ساخته شد. سپس تـأ ثیر پارامترهای مختلفی مانند pH ، میزان گلوتارآلدهید، نسبت حجم اتانول به حجم محلول پروتئین، دور همزن، غلظت محلول پروتئین و سرعت اضافه شدن اتانول بر اندازه ذرات مورد بررسی قرار گرفـت . جهـت بهینـه سازی اندازة ذرات از روش تاگوچی با تعریف4 عامل در4 سـطح اسـتفاده گردیـد . نتـایج بررسـی تـاگوچی نشان داد که شرایط بهینه عبارتند از 9=pH ،غلظت ml/75mg ،نسبت حجـم اتـانول بـه محلـول پـروتئین 4 و سرعت اضافه شدن اتانولmin/5ml/1 که تحت این شرایط اندازة ذرة53 نانومتر به دست آمد.

کلیدواژه‌ها

انتقال دارو؛ نانوذرات؛ سرم آلبومین انسانی؛ روش نامحلول شدن؛ بهینه سازی؛ روش تاگوچی

اصل مقاله

1 -مقدمه نانو فناوری یا کاربرد فناوری در مقیاس یـک بیلیونیم متر، جهان حیـرت انگیـزی را پـیش روی دانشمندان قرار داده است کـه در تـاریخ بشـریت نظیری برای آن نمیتوان یافت. همگامی نـانو فنـاوری و فنـاوری زیسـتی در صورتی که بر طبق نظم خاصـی باشـد ، قـادر بـه خلـق ابزارهـای جدیـد خواهـد بـود. کاربردهـای زیست پزشـکی نـانو فنـاوری محصـول مسـتقیم چنین همگرایی است. اثرات نانوفناوری بر زیست پزشکی اشاره بر خلق مـواد و ابزارهـای طراحـی شـده جهـت بـرهمکنش بـا بـدن در مقیـاس هـای زیرسلولی با درجه بالای دقت دارد کـه بـه طـور بالقوه قادر خواهد بود تـا بـه درون سـلول هـای هدف رفته و باعث افزایش اثرات درمانی و کاهش اثرات جانبی گردد. در آینده ای قابـل پـیش بینـی مهمترین کاربردهای بالینی نانوفناوری، گسـترش در زمینۀ داروسازی خواهد بود[ 3-1. [ امـروزه در دارو رسـانی مـدرن تـلاش هـای زیادی برای بهینه کردن عملکـرد فارمـاکولوژیکی دارو و کاهش اثرات جانبی دارو انجام می شـود . متأســفانه بــه علــت جــذب پــایین دارو در بــدن، متابولیسم سریع آن و حذف سریع دارو، غلظـت دارو در پلاسمای خون ثابت نمی ماند و علاوه بر آن، بعضی از داروهـا را بـه علـت حلالیـت پـایین شان در آب نمی توان بـه صـورت تزریـق داخـل وریدی تجویز نمـود و سـرانجام اینکـه دسـتیابی حیاتی داروها هنـوز کـاملاً مشـخص نیسـت؛ لـذا غلظت دارو در پلاسـمای خـون متغیـر اسـت . بـه منظور حل این مشکل بایـد از سیسـتم های حامـل دارو استفاده کنیم که این سیستمها نقش مـؤ ثری در رساندن عوامل فارمـاکولوژیکی و بیولـوژیکی به نقاط مشخصی در بدن و رهایش آن با سرعت کنترل شده و بهینه ایفا می کنند؛ لذا نه تنها تـأ ثیر درمانی دارو را بیشـتر مـی کننـد ، بلکـه از اثـرات جـانبی نـامطلوب نیـز مـی ک اهنـد. از راهکارهـای موفـق در زمینـۀ رهـایش کنتـرل شـده (مکـانی و زمـانی) اسـتفاده از سیسـتم هـای کلوئیـدی مـی باشد. در میان حامـل هـ ای کلوئیـدی ، لیپـوزوم و نــانوذرات بــیش از بق یــه مــورد بررســی قــرار گرفتهاند. لیپـوزوم عمـدتاً از کلسـترول و لسـتین درست شده است؛ لذا زیسـت سـازگاری خـوبی دارد، اما به دلیـل پایـداری پـایین (نشـت دارو ) و بازده جـذب دارویـی کـم ، نـانوذرات پلیمـری بـه عنوان یک سیستم حامل دارویی جدیـد جـایگزین لیپوزوم ها شدند[ 5،4 . [ نانوذرات پلیمری مزایای ویـژه ای نسـبت بـه لیپـوزوم هـا دارنـد بـه عنـوان مثـال بـه افـزایش پایــداری داروهــا / پــروتئین هــا کمــک کــرده و خصوصــیات رهــایش کنتــرل شــده ای دارنــد ، همچنین نسبت به میکـروذرات (کـه دارای انـدازه بزرگتری مـی باشـند ) انتقـال مـؤ ثرتری از میـان دیــواره شــریانی دارا بــوده و قابلیــت نفــوذ بــه قسمتهای مختلف بدن را دارند. همچنین نانوذرات با توجه به اندازة کوچـک و زیست سازگاری شان توسط سیستم دفاعی بدن بــه عنــوان ذره خــارجی شــناخته نمــی شــوند . نانوذرات باعث انتقال هدفمند داروهـا، کـم کـردن انتقال هدفمند دارو ور ظ سازی نانوذرات سرم آلبومین انسانی به من سنتز و بهینه 3 میــزان مصــرف دارو، افــزا یش اثــرات درمــانی میگردد؛ به علاوه نانوذرات به عنوان حاملDNA و ژن نیز شناخته شدهاند [6 [ در میان سیستم های پلیمـری آنهـایی کـه بـر پایۀ پروتئین هستند کاربرد بیشتری دارنـد ؛ زیـرا پروتئین ها دسته ای از ماکروملکول های طبیعـی می باشند که دارای ساختار منحصر به فرد بوده و کاربرد بـالقوه ای در زمینـه بیولـوژیکی دارنـد .[7،8] نانوذرات ساخته شده از سرم آلبومین انسانی دارای قابلیت بارگذاری زیاد دارو و اثرات جـانبی بسیار ناچیز بر روی بافت آسیب دیده می باشند. همچنین این نانوذرات زیست تخریب پذیر و غیـر آنتی ژن بوده و روش تهیه آنها ساده مـی باشـد . [9] 1-1 بهینه سازی نانوذرات در اواخــر دهــۀ1940 مــیلادی دکتــر گنیچــی 2 تــاگوچی در راســتای افــزایش کیفیــت صــنایع مخابرات ژاپن، مفاهیم آماری جدیـدی ارائـه کـرد [10 .[ تاگوچی در روش ابداعی خـود، عـلاوه بـر فرمول بندی ریاضی طراحی آزمایش ها، روشـی را برای طراحی و اجرای آزمـایش هـا نیـز ارائـه کرده اسـت . نکتـۀ مهـم دیگـر در روش تـاگوچی، نحوة تجزیه و تحلیل نتایج و مـد نظـر قـرار دادن عوامــل خــاص در تحلیــل بــ ه دســت آمــده از آزمایشهای گوناگون می باشد. مزیت عمدة روش های آماری نسبت به روش یک عامل در یک زمان، آن است که در روش های 1- Genechi Taguchi آماری، طرح کلی آزمایش ها در یک مرحلـه و آن هم در ابتدا انجام گرفته و سپس انجام آزمایشـها به طور همزمان صورت می گیرد. در صورتی که در روش یک عامل در یک زمـان، در هـر مرحلـه، ابتدا تفکری دربارة آنچه باید مورد آزمایش قـرار گیرد، صورت گرفته و سپس چند آزمـایش اجـرا شده و این فرایند تا چندین مرحله ادامه می یابـد . همان طور که مشخص اسـت، در روش تـاگوچی، تعداد آزمایشهای مورد نیـاز بـرای بررسـی اثـر اصلی عوامـل بـه طـور مسـتقل، بسـیار کمتـر از روش فاکتوریل کامل و تـا حـدودی نیـز کمتـر از روش یک عامل در یک زمان است. قابل ذکر است که با وجود قابل بررسی بودن کلیۀ آثـار متقابـل در روش فاکتوریل کامل، از آنجا که درجه تـأ ثیر عوامل و آثار متقابـل نسـبت بـه یکـدیگر یکسـان نبوده و فقط برخی از آن ها تأثیر قابل ملاحظهای داشته و باید بررسی شوند، انجام آزمایش ها بـه تعداد فراوان، فقط موجب بـه هـدر رفـتن وقـت و هزینه می شود. گاهی تعداد زیاد آزمایش ها، دقت آنها را نیز کاهش می دهد[ 11. [ در ایـن مقالـه ابتـدا نـانوذرات سـرم آلبـومین انسانی به روش نامحلول کردن تهیه شد و سپس تـــأثیر عوامـــل مختلفـــی ماننـــد : pH ،میـــزان گلوتارآلدهید، نسبت حجم اتانول به حجم محلـول پـروتئین، دور همـزن، غلظـت محلـول پـروتئین و سـرعت اضـافه شـدن اتـانول روی انـدازة ذرات مورد بررسـی قـرار گرفـت . جهـت بهینـه سـازی اندازة ذرات از روش تاگوچی بـا تعریـف 4 عامـل در4 سطح استفاده گردید. ی ـ مهندس در طراحـی ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 4 2 -مواد و روش ها مواد- 1-2 پودر سرم آلبومین انسـانی (جـز ءV ،خلـوص %99- 96 (و گلوتارآلدهید از شرکت سـیگما تهیـه گردید. اتانول با درصد خلوص 99 % و دیگر مواد شیمیایی از شرکت مرک آلمان خریداری شدند. 2-2 -آماده سازی نانوذرات سـرم آلبـوم ین انسانی ساخت این نانوذرات با روش تـوده ای شـدن ساده انجام شـد [ 13-12 .[ ابتـدا سـرم آلبـومین انسانی را در 2 میلی لیتر محلول 10 میلـ ی مـولار کلریــد ســدیم حــل کــرده ســپس بــا اســتفاده از محلول1/0 نرمال هیدروکسید سدیم، pH را بـه 9 رساندیم. در این مرحلـه 8 میلـ ی لیتـر اتـانول بـه عنوان عامل ضد حلال به صورت قطره قطـره بـه محلــول پروتئینــی اضــافه شــد. پــس از تشــکیل نانوذرات، با افزودن گلوتارآلدهید، عامـل اتصـال دهندة عرضی دوتایی همگن، ذرات تثبیـت شـ دند. محلول به دست آمده به مدت 24 ساعت در دمای محیط توسط همزن مغناطیسی همزده شد. مرحلۀ خالص سازی شامل پنج مرحله استفاده از ســانتریفوژ بــا دور 25000g و زمــان 10 دقیقــه مــیباشــد؛ بــدین ترتیــب کــه پــس از هــر بــار سـانتریفوژ، قسـمت شـناور دور ریختـه شـده و رسوبات در محلول اولیه پراکنده شدند. پراکندگی مجـدد ذرات در محلـول اولیـه توسـط قـرار دادن نمونه در حمام اولتراسونیک صورت گرفت. پـس از ساخت نانو ذرات به منظور بهینه سازی اندازة ذرات تأثیر عواملی مانند حجم اتانول، pH ،غلظـت پروتئین، نرخ افزودن اتانول به محلول پروتئینـی ، غلظــت گلوتارآلدهیــد و دور همــزن روی انــدازه نانوذرات مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت، اندازه و مورفولـوژی ذرات توسـط دستگاه پراکنش نور لیزر، میکروسکوپ الکترونی روبشـی و میکروسـکوپ نیـروی اتمـی بررسـی گردید. 3 -نتایج و بحث 3-1 -بررسی عوامل مـؤ ثر بـر انـدازه ذرات سرم آلبومین انسانی با توجـه بـه آنکـه انـدازة ذره یکـی از عوامـل بســیار مهــم در خصوصــیات نــانوذراتی کــه میخواهند جهت انتقـال دارو اسـتفاده شـوند مـی باشد، پـس از سـاخت نـانوذرات پروتئینـی سـرم آلبومین انسانی، برای به دست آوردن اندازة ذرة کـوچکتر بـه جسـتجوی عوامـل مـؤ ثر بـ ر انـدازه پرداختیم و سپس با استفاده از یک روش مناسب اقدام به بهینه سازی نانوذرات نمودیم. اولین عاملی که تأثیر آن بـر انـدازه نـانوذرات مورد بررسی و رسیدگی قرار گرفت اثر pH اولیه محلول پروتئینی بوده است که نتایج آن در شـکل (1 (نشان داده شده است. انتقال هدفمند دارو ور ظ سازی نانوذرات سرم آلبومین انسانی به من سنتز و بهینه 5 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 7.5 8 8.5 9 pH Particle Size (nm) شکل (1 :(تأثیرpH بر اندازه ذرات سرم آلبومین انسانی برای تشکیل نانوذرات pH باید به اندازة کـافی از نقطـه ایزوالکتریـک دور باشـد؛ زیـرا در نقطـه ایزوالکتریک، ذرات ناپایدارند و همان طـوری کـه درشکل بالا مشاهده می شود، pH هـای 5/7 , 8, 5/8 و 9 مورد مطالعه قرار گرفتنـد . نتـایج نشـان می دهد کـ ه بـا افـزایش pH ،انـدازة ذرات کـاهش مییابد. عامل دیگری که تأثیر آن بر انـدازه نـانوذرات مورد بررسی و رسیدگی قرار گرفت غلظت اولیـه محلـول پروتئینـی بـوده اسـت کـه ایـن تـ أثیر در غلظتهــای 25 , 50 , 75 و 100 میلــی گــرم بــر ،1 ml/min اتـانول افزایش نرخ ، pH=9) میلیلیتر حجم اتانول cc 4 و دور همزنrpm 550 و غلظـت گلوتارآلدهیـــد µlit 75/58 ( مـــورد بررســـی و مطالعه قرار گرفت. همـان طـور کـه در شـکل (2 ( دیده می شـود ، بـا افـزایش غلظـت محلـول اولیـه پـروتئین، انـدازه ذرات ابتـدا کـاهش و سـپس بـه میزان اندکی افزایش مـی یابـد و مـی تـوان نتیجـه گرفــت، بهتــرین غلظــت بــرای بــ ه دســت آوردن کــوچکترین ذرات 50 میلــی گــرم بــر میلــی لیتــر میباشد. 0 20 40 60 80 100 120 25 50 75 100 HSA Concentration [mg/ml] Particle Size (nm) شکل (2 :(تأثیر غلظت اولیه محلول پروتئینی بر اندازه ذرات سرم آلبومین انسانی پارامتر بعدی نسـبت حجمـی عامـل نـامحلول کننده (اتانول) به حجم محلول اولیه پروتئین بوده است که نتایج آن در شکل (3 (آورده شده اسـت . این کمیت در نسبتهای 1 , 2 , 3 و 4) 9= pH ، نرخ mg/ml پـروتئین غلظـت، 1 ml/min اتانول افزایش 50 ،دور همـزن rpm 550 و غلظـت گلوتارآلدهیـد µlit 75/58 (آزمایش شده است. نتایج نشان می دهد کـه بـا افـزایش میـزان مـا ده نامحلول کننده (اتانول) انـداز ة قطـر ذرات کـاهش می یابد. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 1 2 3 4 Ethanol volume per volume HSA solution Particle Size (nm) شکل (3 :(تأثیر نسبت حجمی اتانول به حجم محلول پروتئین بر اندازه ذرات سرم آلبومین انسان تأثیر سـرعت افـزودن عامـل نامحـدود کننـده (اتانول) به سیستم در دبی های 5/0، 1 ، 5/1 و 2 میلی لیتر بر دقیقه (9=pH ، غلظت پروتئین ml/mg ی ـ مهندس در طراحـی ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 6 50 ،حجــم اتــانول cc 4 ،دور همــزن rpm 550 و غلظـت گلوتارآلدهیـد µlit 75/58 (مـورد بررسـی قرار گرفت و همان طوری که در شکل4 مشـاهده می شود با افـزایش نـرخ افـزودن اتـانول، انـدازة ذرات ابتـدا کـاهش و سـپس بـه میـزان نـاچیزی افزایش می یابد و مـی تـوان نتیجـه گرفـت تحـت شرایط فوق بهترین نرخ افزودن اتانول بـر ای بـ ه دست آوردن کوچکترین ذرات، 5/1 میلی لیتر بـر دقیقه می باشد. 0 20 40 60 80 100 120 0.5 1 1.5 2 Speed of ethanol addition [ml/min] Particle Size (nm) شکل (4 :(تأثیر نرخ افزودن اتانول به محلول پروتئین بر اندازه ذرات سرم آلبومین انسانی سپس تأثیر گلوتارآلدهید (به عنوان ماده شبکه ساز) بر انـدازة ذرة مـورد بررسـی قـرار گرفـت . بــرای بررســی چنــین اثــری م قــایر متفــاوتی از 9) 117/5 و 58/75 ،23/5 µl یعنــی گلوتارآلدهیــد =pH ، غلظت پـروتئین ml/mg 100 ،حجـم اتـانول cc 4 ،دور همزن rpm 550 و نرخ افـزایش اتـانول min/ml 1 (اسـتفاده شـد کـه ایـن مقـادیر معـادل 40،100 و200 % مقدار لازم برای شبکه ای کردن 59 گـروه آمینـو اسـید موجـود در ملکـول سـرم آلبومین انسانی در ماتریس نانوذرات مـی باشـد . نتــایج در شــکل (5 (آورده شــده اســت. چنانچــه مشاهده می شود، به نظـر نمـی رسـد کـه میـزان گلوتارآلدهید تأثیری بر انـدازة نـانوذرات داشـته باشد؛ اما شبکه کردن نانوذرات بـا گلوتارآلدهیـد نقطه ایزوالکتریک محلول را کاهش می دهد که این کاهش نقطه ایزوالکتریـک بـرای ایجـاد پیونـدهای کووالانســی زنجیــره هــای لایــزین لازم اســت و همچنین اگر بخواهیم از نانوذرات به عنوان حامل دارو از طریق ایجاد پیوند کووالانسی دارو با ذره استفاده کنیم مقدار گروه های آمینـو اسـیدی کـه روی ســطح ذرات وجــود دارد پــارامتر مهمــی محسوب می شود. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 40 100 200 Glutaraldehyde Concentration [% ] Particle Size (nm) شکل (5 :(تأثیر میزان غلظت گلوتارآلدهید بر اندازه ذرات سرم آلبومین انسانی برای بررسـی دور همـز ن بـه هنگـام افـزودن اتانول، سیستم آزمایشی تحت شرایط دور همزن غلظــــت ، pH=9) 700 و 550 ،400 rpm هــــای غلظــت، 4 cc اتــانول حجــم، 50 mg/ml پــروتئین گلوتارآلدهید µlit 75/58 و نـرخ افـزایش اتـانول min/1ml (مورد مطالعه قرار گرفـت . همـان گونـه که از نتایج نشان داده شده در شکل (6 (برمیآید، در محدوده در نظر گرفته شـده ، سـرعت همـزدن تأثیری بر اندازة ذره نخواهد داشت. انتقال هدفمند دارو ور ظ سازی نانوذرات سرم آلبومین انسانی به من سنتز و بهینه 7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 400 550 700 Agitation Speed[rpm] Particle Size (nm) شکل (6 :(تأثیر سرعت همزدن بر اندازه ذرات سرم آلبومین انسانی با بررسی های صورت گرفتـه مشـخص گردیـد که عوامل دور همزن و غلظت گلوتارآلدهید تـأ ثیری بر اندازة ذره تولیـدی ندارنـد و عوامـل pH ،نسـبت حجم اتانول به حجم محلول پروتئین، غلظت محلـول سرم آلبومین انسانی و سرعت اضافه شدن اتـانول بیشترین تـأ ثیر را بـر انـدازة ذرات دارا مـی باشـند . برای بهینه سازی، روش تاگوچی با تعریف 4 عامـل در 4 سطح (آرایه L16 (انتخاب گردید. 3-2 -نتایج حاصل از تاگوچی با توجه بـه بررسـی هـای صـورت گرفتـه در بخش های قبلی مشخص گردید که سرعت همـ زن و همچنین غلظت گلوتارآلدهید تـأ ثیری بـر انـدازه نانوذره پروتئینی ساخته شده ندارند؛ اما 4 عامل: pH ،غلظت پروتئین، نسبت حجم اتانول بـه حجـم محلول اولیـه پـروتئین ، نـرخ افـزودن اتـانول بـه محلول پروتئین، بیشترین تأثیر را بر اندازة ذرات دارنــد. بــرای بهینــه ســازی از روش کســری از فاکتوریــل کامــل اســتفاده گردیــد ؛ چــون روش فاکتوریل کامل نیاز به انجام تعداد زیادی آزمایش بـود و روش یـک عامـل در یـک زمـان هـم نمـی توانست تمامی خواسته های ما را برآورده نماید؛ زیرا احتمال در نظـر نگـرفتن بسـیاری از عوامـل وجود خواهد داشـت . در نتیجـه روش کسـری از فاکتوریل کامل از میان روش هـای فـوق انتخـاب گردید و در میان روش های آماری نیز بـا توجـه به در دسترس بودن و همچنـین کارهـای مشـابه انجام شده، روش تاگوچی انتخاب گردید و بـرای بهینه سازی از نرم افزار تاگوچی مدل ( Qualiteck .شد استفاده –) 4 version 4.82.0 برای بهینه سازی، اندازة ذرات چهار عامل مؤثر ذکر شده در چهار سطح انتخاب می شـوند کـه مـی توان آن ها را در جدول (1 (مشاهده نمـود . لازم بـه ذکـر اسـت کـه سـطح هـا بـا توجـه بـه آزمایشـات صورت گرفته در بخش های قبل انتخاب گردید. جدول (1 :(عوامل و سطوح آنها در فرایند ساخت نانوذرات پروتئینی عامل متغیر سطح 4 3 2 1 9 8/5 8 7/5 A pH 100 75 50 25 B (mg/ml)پروتئین غلظت 1 نسبت حجم اتانول به پروتئین C 4 3 2 5 نرخ افزودن اتانول به محلول پروتئین(min/ml (D 2 1/5 1 0/ ی ـ مهندس در طراحـی ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 8 با توجه به تمامی ترکیـب هـای ممکـن بـین 4 عامل در 4 سطح، 256 آزمـایش بـرای پوشـاندن تمــامی حــالات ممکــن ضــروری اســت (روش فاکتوریــل کامــل ) امــا تــاگوچی از میــان 256 آزمایش، تعداد 16 آزمـایش را کـه بیشـترین اثـر چهار عامل مربوط را در خود دارنـد، مشـخص و پیشنهاد می کند. تاگوچی برای طراحـی و اجـرای آزمـایش هـا مجموعه ای از جداول را به عنوان آرایـه متعامـد تهیه کرد. جدول (2 (آرایه متعامد را برای 4 عامل در 4 سطح را نشان مـی دهـد . ایـن آرایـه کـه بـا علامـت اختصـاری 16 L در نـرم افـزار تـاگوچی معرفـی مـی شـود ، شـامل 4 سـتون و 16 ردیـف می باشد. هر ستون به یک عامل و هر ردیـف بـه یک آزمایش تعلق دارد. در جـ دول (2 (عـلاوه بـر طراحی آزمایشات، نتایج حاصل از کار نیز آورده شده است. جدول (2 :(طراحی آرایه متعامد و نتایج برای هر آزمایش نتایج D C B A عامل شماره آزمایش 185 175 99 111 93 91 87 92 78 69 99 92 75 77 79 92 1 2 3 4 3 4 1 2 4 3 2 1 2 1 4 3 1 2 3 4 2 1 4 3 3 4 1 2 4 3 2 1 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 انتقال هدفمند دارو ور ظ سازی نانوذرات سرم آلبومین انسانی به من سنتز و بهینه 9 جدول (3 :(آنالیز واریانس در فرایند ساخت نانوذرات پروتئینی عوامل درجه آزادی مجموع مربعات واریانس نسبت واریانس *10/293 3336/083 10008/25 3 A 0/658 213/416 640/25 3 B *3/157 1023/416 3070/25 3 C 1/862 603/583 1810/75 3 D 324/083 972/25 3 خطا 16501/75 15 مجموع پارامترهای مؤثر با بررسی های انجام شده و نتـایج حاصـل از نرم افزار، شرایط بهینـه بـرای سـاخت نـانوذرات پروتئینی سرم آلبومین انسانی به صورت ذیل به دست آمد: نســبت، 75mg/ml =پــروتئین غلظــت، 9=pH حجم اتانول به محلول پـروتئین =4 ،نـرخ افـزودن اتانول به محلول پروتئین=min/ml 5/1 ،یعنـی pH در سـطح4 ،غلظـت پـروتئین در سـطح 3 ،نسـبت حجم اتانول به پروتئین در سطح 4 و نرخ افزودن اتانول به محلول پروتئین در سطح 3 . همچنین نتایج حاصل از جدول (3 (نشان می دهد از بین عوامل یاد شده، pH و نسبت حجـم اتـانول به محلول پـروت ئین، تأثیرگـ ذارترین عوامـل روی اندازه نانوذرة تولیدی می باشد. SIZE DISTRIBUTION 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 10 100 1000 Particle Diameter (nm) Normalized Particle Amount Max : 53 شکل (7 :(توزیع اندازة نانوذرات ساخته شده از سرم آلبومین انسانی در شرایط بهینه تحــت ایــن شــرایط تــاگوچی انــدازه ذره را 625/46 نانومتر پیش بینی می کنـد . آزمـایش بـ ا شـرایط بهینـه انجـام شــد و بـا انجـام آزمــایش پیشنهادی، اندازة ذره 53 نانومتر بـه دسـت آمـد شکل (7 .( جهــت اطمینــان بیشــتر و همچنــین بررســی مورفولوژی نانوذرات تولید شده در شرایط بهینه از این نمونه تصاویر SEM وAFM گرفته شد کـه در شکل های (9و 8 (ارائه شده اند: شکل (8 :(تصویر SEM نمونه نهایی سرم آلبومین انسانی با بزرگ نمایی الف)30000 و ب)60000 ب (ال ی ـ مهندس در طراحـی ات ـ اوری اطلاع ـ ه فن ـ مجل 10 شکل (9 :(تصویر AFM نمونه نهایی سرم آلبومین انسانی الف) تصویر دو بعدی. ب) تصویر سه بعدی 4 -نتیجه گیری هدف از ایـن تحقیـق، سـاخت و بهینـه سـازی نـانوذرات پروتئینـی ، جهـت انتقـال ه وشـمندانه و هدفمند دارو به نقاط مورد نظر می باشد. در ایـن تحقیق، ساخت نانوذرات پروتئینی سرم آلبـومین انسانی بـا روش نـا محلول شـدن انجـام گردیـد . بررسـی ریخـت شناسـی ذرات بـا میکروسـکوپ الکترونی روبشـی SEM و میکروسـکوپ نیـروی AFM نشـان دادنـد کـه نـانوذرات تولیـدی دارای شکل تقریباً کروی می باشند. قسمت دیگری از این تحقیق بـه بهینـه سـازی نانوذرات تولیـدی جهـت داشـتن ذرات بـا انـدازة کوچکتر اختصاص یافت. به این منظور به بررسی اثرات عوامل مختلف بر اندازة ذرات پرداختیم. این عوامــل عبــارت بودنــد از : pH ،غلظــت محلــول پروتئین، نسبت حجمی عامـل نـامحلو ل کننـده بـه حجم محلول پروتئین، نرخ افزودن عامل نامحلول کننده به محلول پـروتئین ، غلظـت گلوتارآلدهیـد و دور همزن در هنگام افزودن عامل نامحلول کننده. با بررسی های صورت گرفته مشخص گردید کـه عوامل غلظت گلوتارآلدهید و دور همزن در هنگام افزودن عامل نامحلول کننده تأثیری بر اندازة ذرة تولیــدی ندارنــد و عوامــل pH ، غلظــت محلــول پروتئین، نسبت حجمی عامـل نـام حلول کننـده بـه حجــم محلــول پــروتئین و نــرخ افــزودن عامــل نامحلول کننده به محلول پروتئین، بیشترین تأثیر را بر اندازة ذرات دارند. برای بهینه سازی روش تاگوچی با تعریـف 4 عامل در 4 سطح (آرایـه 16 L (انتخـاب گردیـد . بـا انجـام آزمایشـات مطـابق نـرم افـزار تـاگوچی و بررسی نتایج حاصله از هر آزمایش طبـق آنـالیز آماری، کـوچکترین انـدازة نـانوذره پروتئینـی در شرایط ذیل بدست آمده است: ،75 mg/ml =پروتئین محلول غلظت، 9= pH نسـبت حجمـی عامـل نــامحلول کننـده بـه حجــم محلول پروتئین= 4 و نرخ افزودن عامل نـامحلول کننده به محلول پروتئین= min/ml 5/1. که اندازة نانوذرة تولیدی، تحت این شرایط 53 نانومتر بوده است و با توجه به آنچه تأکید شـده اسـت، نـانوذراتی کـه بـرای انتقـال دارو بـه کـار می روند بهتر است در دامنۀ کمتر از 100 نانومتر باشند در این شرایط می توان گفت مـا بـه بهینـه مطلوب مورد نظر دست پیدا نموده ایم. (ب (الف انتقال هدفمند دارو ور ظ سازی نانوذرات سرم آلبومین انسانی به من سنتز و بهینه 11 بارگــذاری دارو روی نــانوذرات ســرم آلبــومین انسانی و انتقال هدفمند داروی بارگذاری شده، از اهداف بعدی این گروه تحقیقاتی می باشد.

مراجع

1. Roy I, Ohulchanskyy T. Y, Pudavar H. E, “Ceramic-Based Nanoparticles Entrapping WaterInsoluble Photosensitizing Anticancer Drugs: A Novel Drug-Carrier System for Photodynamic Therapy”. J. Am. Chem. Soc., 125, 2003, 7860-7865 2. Bigger I, Dubernet C, Couvreur P, “Nanoparticles in Cancer Therapy and Diagnosis”. Adv Drug Deliv. Rev., 54, 2002, 631-651. 3. Crommelin D. J, Storm G, Jiskoot W, Stenekes R, Mastrobattista E and Hennink W. E, “Nanotechnological Approaches for the Delivery of Macromolecules.” J. Controlled Release, 87, 2003, 81-88 4 .اسماعیل جباری، شهریار شـریفی، ”نانوذرات و کاربرد آنها در رهایش کنترل شـده عوامـل بیولـوژیکی .“ زمستان 1382. 5. Rahimnejad M, Jahanshahi M, Njafpour G. D, “Production of biological nanoparticles from bovine serum albumin for drug delivery”. Afr. J. Biotechnol., 5(20), 2006, 1918-1923 6. Jahanshahi M, Sanati M.H, Hajizadeh S, Babaei Z, “Gelatin nanoparticle fabrication and optimization of the particle size”. Phys. Stat. sol. (a), 2008, 1-5 7. Lowe C.R, “Nanobiotechnology”, Current Opinions in Structural Biology, (2000). 8. Zhang Z, Burton S,Williams S, Lyddiat A, “Design and assembly of solid phase for the effective recovery of nanopartoculate.Bioproducts in fludised bed contactors”, Bioseparation,10, 2001, 113- 132 9. http:// nanobiotechnology.blogfa.com. 10. Jahanshahi M, Raoof JB, Hajizadeh S, Jabari Seresht R, “Synthesis and subsequent purification of carbon nanotubes by arc discharge in NaCl solution”. phys. stat. sol. (a), 2008, 1– 5 11 .جهانشــاهی، محســن،”گــزارش ســاخت از پــائین بــه بــالای یــک نانوســاخت ار پروتئینــی بــه روش . 1385 تابستان “ ، Coacervation 12. Marty JJ, Oppenheimer RC, Speiser P, "Nanoparticles-a new colloidal drug delivery system”. Pharm. Acta Helv 53, 1978, 17-23 13. Jahanshahi M, “Molecular Nanotechnology & Nanobiotechnology”, Book: Academic University (Mazandaran) publications (2007).