الگوی بیان فاکتور نکروز تومور- آلفا (Tumor NecrosisFactor-α) تحت تاثیر عصاره هیدروالکلی زنجبیل(Zingiber officinale)

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 4، دوره 11، شماره 3 - شماره پیاپی 42، شهریور 1397، صفحه 41-53   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

زینب صحرائیان^*

استادیار، دانشگاه ازاد اسلامی، واحد زنجان، مرکز تحقیقات بیولوژی، زنجان، ایران

چکیده

زمینه و هدف: دیابت به عنوان یک بیمـاری التهـابی کـه بـا اخـتلالات متابولیسمی همراه است، شناخته می شود. فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا(Tumor necrosis factor- Alpha, TNF-α) یکی از سایتوکاین های اصلی التهابی بوده و نقش مرکزی در دفاع میزبان، التهاب و عملکرد سیستم ایمنی دارد. مصرف گیاهان دارویی مختلف از جمله زنجبیل در جهت کاهش عوارض التهاب از گذشته­های دور رایج بوده است. در این تحقیق به بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره هیدروالکلی زنجبیل بر میزان بیانفاکتور نکروز تومور–آلفادر سلول های بنیادی مزانشیمی(Mesenchymal stem cells, MSCs)مشتق از مغز استخوان پرداخته شد.
روش کار: سلول های بنیادی مزانشیمی در گروه شاهد بدون دریافت عصاره زنجبیل و شش گروه تیمار با عصاره هیدروالکلی زنجبیل با غلظت های μg/ml 100و 50 و در زمان های 2، 16و24 ساعت مورد مطالعه قرار گرفتند. RNA از سلول های شاهد و تیمار استخراج شده و پس از سنتز cDNA، میزان بیان ژن TNF-α به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از^ctΔΔ-2 میزان بیان ژن TNF-α سنجیده و نتایج با t-test مورد ارزیابی قرار گرفت.
یافته ها: نمونه های تیمار شده با عصاره زنجبیل با غلظت های μg/ml 50 و 100به مدت16 و 24 ساعت، برای ژن TNF-α کاهش معنی داری نشان دادند(05/0>p). در سایر گروه های تیمار بیان معنی داری مشاهده نشد.
نتیجه گیری: با توجه به نتایج به دست آمده، این کاهش میزان بیان TNF-α ،نشان دهنده اثر دراز مدت این عصاره در مقایسه با اثر کوتاه مدت 2 ساعته آن بوده است. بنابراین تاثیر زنجبیل بر میزان بیان ژن التهابی  TNF-α وابسته به غلظت و زمان تیمار می باشد.

کلیدواژه‌ها

زنجبیل؛ فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا؛ سلول های بنیادی مزانشیمی؛ دیابت

اصل مقاله

مقدمه

 

دیابت مجموعه ای از ناهنجاری های متابولیکی اسـت کـه در اثر اختلال ترشح انسـولین، عملکـرد انسـولین یـا هـر دو ایجاد شده و منجر به افزایش قند خون می شـود(2). این بیماری، معضل در حال گسترش جوامع اسـت که بـا افزایش مرگ و میر همراه می باشد. کنتـرل قند خون و افـزایش حساسـیت بـه انسـولین سـبب کـاهش التهاب و اختلالات چربی های خون در بیماران دیابتی شده و از ابتلای این بیماران به عوارض دیابـت پیشـگیری مـی کنـد(28،24). کمبود و یا کاهش نسبی میزان انسولین در این بیماری با عوارض متابولیکی حاد نظیر اغمای هیپراسمولار و یا یک اختلال متابولیک مزمن و عوارض نامطلوب در دراز مدت نظیر ریتینوپاتی، گرفتگی عروق کلیوی، نوروپاتی، ضایعات پوستی، اختلالات سیستم قلب و گردش خون همراه می باشد. عوارض متابولیک دیابت قندی با هیپرگلیسمی و بروز اختلال در متابولیسم مواد غذایی شامل پروتئین ها، کربوهیدرات ها و لیپیدها مشخص می گردد .در سال­های اخیر، علی رغم پیشرفت های فراوان در زمینه ترکیبات سنتزی دارویی هنوز بیماری های بسیاری، از جمله عفونت ها و ناراحتی های مزمن(دیابت) وجود دارند که به طور کامل قابل درمان نیستند. علاوه بر آن مصرف فرآورده های دارویی بسیاری که در درمان دیابت به کار می روند، دارای عوارض و مشکلاتی برای بیمار است. گیاهان دارویی و مشتقات آن ها از دیر باز در درمان دیابت و عوارض ناشی از آن(که مستقیماً با افزایش میزان بیان ژن های التهابی مرتبط می باشد) مطرح بوده اند. امروزه گرایش مجددی به مصرف گیاهان دارویی به خاطر کم بودن عوارض سوء جانبی و گوناگونی ترکیبات موثره موجود در آن ها به وجود آمده است. زنجبیل(Zingiber officinale) یکی از این گیاهان می­باشد. این گیاه در درمان گلودرد، سردردها، آرتریت، تب و درد ناشی از انواع سرماخوردگی ها و آنفلونزا استفاده می شود(20، 13، 12). بیش از 50 ترکیب مختلف در روغن فرار و معطر زنجبیل شناسایی شده است که اکثراً از نوع ترکیبات مونوترپنوئیدی و سزکویی ترپنوییدی می باشند. تندی زنجبیل تازه نیز به علت وجود برخی ترکیبات فنولی به نام جینجرول ها از جمله 6- جینجرول است. فرم دهیدراته این ترکیبات مانند شوگاول ها نیز در زنجبیل خشک دیده می شود(3). سایر ترکیبات موجود در زنجبیل شامل 3-دی هیدرو شوگاول­ها، پارادول ها، دی هیدرو پارادول ها، مشتقات استیله جینجرول ها، جینجردیول ها، مشتقات مونو و دی استیل جینجردیول ها، 1-دهیدرو جینجردیون ها، دی آریل هپتانوئید ها، مشتقات متیل اتر ها، مشتقات فرولیک اسید، ترپن هایی مانند زیینجرون و زینجرول و غیره می­باشند(3،37). زنجبیل یک ماده ایمن شناخته شده است و سازمان غذا و داروی آمریکا آن را به عنوان یک مکمل غذایی در مرتبه(GRAS) Generally Recognized As Safe  می داند(3). سایتوکاین ها پروتئین های ترشح شده از سلول های ایمنی ذاتی و سازشی هستند که بسیاری از اعمال این سلول ها را میانجی گری می کنند، سایتوکاین­هایی که در پاسخ به آنتی ژن ها و سایر میکروارگانیسم ها تولید می شوند، در ایجاد التهاب و ایمنی دخالت دارند. فاکتور نکروز دهنده تومور– آلفا(Tumor Necrosis Factor-Alfa ,TNF-α ) یکی از سایتوکاین های اصلی التهابی بوده و نقش مرکزی در دفاع میزبان، التهاب و عملکرد سیستم ایمنی دارد که با پاتوژنز، توسعه و پیشرفت انواع عفونت ها، بیماری های خود ایمنی، بیماری های بدخیم و غیره ارتباط دارد(29). محققین نشان داده اند که زنجبیل در بیماری های مزمن التهابی مؤثر است. ترکیبات آن مانند 6-شوگائول و جینجرادیون با مهار سنتز NO در بلوکه کردن فعالیت ماکروفاژ و کاهش التهاب مزمن و حاد تاثیر دارند(36). 6-شوگائول تولید  NO ,IL-1B ,TNF-αرا در ماکروفاژها به طور معنی داری مهار می نماید(22). هم­چنین مطالعات نشان دهنده ی کاهش سطوح بتا گلوکورونیداز و لاکتات دهیدروژناز توسط این ترکیب زنجبیل و اثرات قوی ضد التهابی آن می باشد(34). زینجرول و جینجرول-10 از ترکیبات مهم زنجبیل می­باشند که از طریق افزایش بیان PPARs (Peroxisome proliferator-activated receptors ) و مهار فاکتور ترجمه پیش التهابی(NF-κB) دارای اثرات ضد التهابی می باشد(21، 8). یکی از ویژگی های التهاب افزایش اکسیداسیون آراشیدونیک اسید، تولید پروستاگلاندین و لوکوترین ها است. زنجبیل سبب مهار سنتز پروستـاگلاندین از طریق مهار سیـکلو اکسیژناز 1 و 2 می­گردد. هم­چنین عصاره این گیاه منجر به مهار تولید لوکوترین ها از طریق مهار  لیپواکسیژناز 5 می شود(12). سلول های بنیادی مزانشیمی Mesenchymal Stem Cells, MSC_s)) به عنوان یک منبع مهم سلول های بنیادی بالغ کاربرد فراوانی در مهندسی بافت و سلول درمانی پیدا کرده اند(10). توان سلول های بنیادی مزانشیمی در تکثیر و تمایز به بافت های مختلف سبب شده که منبع مناسبی برای آزمایشات بالینی سلول درمانی و هم چنین استفاده در ترمیم و بازسازی انواع رده های سلولی به حساب آیند(6). این سلول ها به محل التهاب مهاجرت کرده و تأثیر ایمونومدولاتوری خود را القا می­کنند. استفاده از این سلول ها به عنوان ابزار تشخیص ضایعات، قابلیت تشریح برخی فاکتورهای رشد و سایتوکاین ها، بیان برخی ژن ها پس از مهندسی ژنتیک، در کنار استحصال و تزاید نسبتاً آسان این سلول ها بر جذابیت MSC_s افزوده است. دانشمندان بر این عقیده اند که پیوند MSC_s دستاورد جدیدی برای درمان بیماری­هایی است که با روش های درمانی کنونی قابل درمان نیستند(5). در این تحقیق تأثیرعصاره هیدروالکلی گیاه زنجبیل در تغییر احتمالی بیان ژن فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا در سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها

کشت سلول های بنیادی مزانشیمی

سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان از مرکز کشت سلول های بنیادی پژوهشگاه رویان خریداری شد. این سلول ها مراحل اولیه کشت خود را سپری کرده و در پاساژ دوم با تراکم ۷۰٪ بودند. ادامه مراحل کشت تا پاساژ ششم در آزمایشگاه تحقیقاتی بیولوژی انجام شد. به سلول ها محیط کشتDMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) حاوی 10٪ سرم جنینی گاوی((Fetal bovine serum FBS یک درصد ال- گلوتامین و یک درصد آنتی بیوتیک استرپتومایسین-پنی سیلین اضافه شد و در فلاسک T₂₅ به طور یکنواخت کشت و در داخل انکوباتور(دمای37 درجه سانتی گراد و 5 درصد دی اکسید کربن) قرار داده شد. سلول ها با خاصیت چسبندگی خود به کف ظرف چسبیدند. در مراحل بعدی هر از4 -3روز با محلول شستشو PBS (Phosphate buffered saline) شستشو و سپس تعویض محیط کشت انجام شد. با رسیدن سلول ها به تراکم 80-70 درصد، پاساژ سلولی انجام گرفت. برای انجام پاساژ سلولی، پس از دور ریختن محیط کشت روی سلول ها و شستشوی آن ها با محلول شستشو، تریپسین روی سطح سلول ها ریخته شد. بعد از طی مدت کوتاهی در دمای 37 درجه سانتی گراد، با گرد و جدا شدن سلول­ها از کف ظرف، سلول ها جمع آوری و به فلاسک­های جدید حاوی محیط کشت تازه منتقل شدند.

تیمار سلول های بنیادی مزانشیمی

عصاره خالص هیدروالکلی زنجبیل از پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی خریداری و با کمک محیط کشت DMEM غلظت های مختلف 50 و 100 میکروگرم بر میلی لیترتهیه شد. سلول های بنیادی مزانشیمی پاساژ ششم تحت تأثیر محیط کشت حاوی عصاره زنجبیل با غلظت های μg/ml 50 و μg/ml ۱۰۰ در مدت زمان های مختلف 2، 16 و 24 ساعت(علت استفاده از این غلظت ها بررسی تحقیقات قبلی جهت استفاده از غلظت های غیر سمی و زمان هایی با حداکثر تاثیر احتمالی می باشد.) قرار گرفتند(30، 16). پس از گذشت این زمان ها، سلول ها از کف ظروف کشت جمع آوری گردید. برای آنالیز مولکولی جهت تعیین میزان بیان ژن TNF-α از تکنیکReal Time-PCR استفاده شد. میزان بیان ژن TNF-α در MSCs مشتق از مغز استخوان انسان تیمار نشده و تیمار شده با عصاره زنجبیل با یک­دیگر مقایسه شدند. هم­چنین میزان بیان این ژن در گروه های مختلف سلولی که تحت تیمار با عصاره زنجبیل در زمان­های متفاوت قرار گرفته بودند، مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. شمارش سلولی با کمک لام نئوبار انجام گرفت که مشخص شد به طور میانگین ۱۰^۴×۱۳ سلول در هر ml ۱ از سوسپانسیون سلولی وجود دارند.

بررسی میزان بیان ژن  TNF–α  

 استخراجmRNA  و سنتز cDNA

بررسی سطوح بیان ژن TNF–α در سلول های بنیادی مزانشیمی تیمار نشده و تیمار شده با عصاره زنجبیل انجام گرفت. ابتدا محیط کشت هر فلاسک مورد نظر پس از گذشت زمان معین شده دور ریخته و سپس سلول ها با ml ۲ از PBS^-، دو بار شستشو داده شد. سلول ها تریپسینه و انکوبه گردیده و با ضربات متوالی به کنار فلاسک، سلول ها از کف فلاسک جدا شدند. پس از آن سلول­های جدا شده با پیپت، جمع آوری و در یک فالکون ml ۱۵ ریخته شدند. فالکون حاوی سلول به مدت ۵ دقیقه با دور rpm ۱۲۰۰ سانتریفیوژ گردید. محلول رویی را دور ریخته و مجدداً ml ۱ محلول شستشوی PBS^- به رسوب سلولی اضافه و با عمل سمپلینگ، رسوب به داخل میکروتیوپ منتقل شد. جهت استخراج RNA کل، از دستورالعمل شرکت سیناژن استفاده شد. برای این منظور ml ۱ از محلول RNX-Plus، به صورت نیمه منجمد به یک میکروتیوپ ml ۲ حاوی نمونه همگن شده اضافه شد. سپس به مدت ۵ الی ۱۰ ثانیه ورتکس شده و در دمای اتاق به مدت ۵ دقیقه انکوبه گردید. μl ۲۰۰ کلروفرم به آن اضافه و به مدت ۱۵ ثانیه مخلوط شد. مخلوط حاصل بر روی یخ به مدت ۵ دقیقه قرار گرفت. در دمای ۴ درجه سانتی گراد با دور rpm ۱۲۰۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز آبی به دست آمده به یک میکروتیوپ ml 5/1 انتقال داده و هم حجم فاز آبی به آن ایزوپروپانول اضافه گردید. به آرامی با سر و ته کردن میکروتیوپ آن را مخلوط کرده و روی یخ به مدت ۱۵ دقیقه انکوباسیون صورت پذیرفت. مخلوط در دمای ۴ درجه سانتی گراد با دور rpm ۱۲۰۰۰ و به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی را دور ریخته وبه رسوب ml ۱ اتانول ۷۵٪ اضافه و پس از آن در دمای ۴ درجه سانتی گراد با دور rpm ۷۵۰۰ و به مدت ۸ دقیقه سانتریفیوژ گردید. محلول رویی را دور ریخته و رسوب به مدت اندک جهت خشک شدن به دمای اتاق انتقال داده شد. رسوب حاصله در μl ۵۰ از DEPC treated water حل گردید. جهت کمک به حل شدن رسوب، میکروتیوپ در دستگاهی به نام Dry Plate Incubator به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۵۵-۶۰ درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از استخراج RNA، مرحله cDNA سازی جهت فرآیند Real Time PCR می باشد. کیت cDNA سازی از شرکت تاکارا(امینسان) خریداری گردید. ابتدا مواد موجود در جدول 1 بر روی یخ به مقدار لازم برای هر نمونه در یک میکروتیوپ مخلوط و در دستگاه ترموسایکلر انکوبه شد.

جدول 1- مقادیر مواد مورد نیاز جهت سنتز cDNA

غلظت نهایی	مقدار	مواد واکنش
1X	μl2	5X primescript Buffer
	μl5/0	Primescript RT Enzyme Mix I
25Pmol	μl5/0	Oligo dT Primer (50 μM)
50Pmol	μl5/0	Random 6 mers (100 μM)
	μl2	total RNA (0/5 μg)
	µl4	RNase Free dH2O
	μl10	Total

برای طراحی پرایمر توالی ژن از سایت NCBI دریافت و به وسیله نرم افزار آنلاین primer3 و Design primer در سایت NCBI پرایمرها مشخص گردید. هم­چنین با کمک سایت ensemble مکان اگزون ها و اینترون ها مشخص و جفت پرایمری را که قسمتی از اینترون های ژن را در بردارد با استفاده از بخش primer-blast در سایت NCBI انتخاب شد. پس از طراحی پرایمرها جهت اطمینان از صحت عملکرد از جمله نقطه ذوب، میزان سیتوزین و گوانین،  ∆Gو امکان تشکیل لوپ و دایمر-پرایمر، آن ها را از طریق نرم افزار

 

Oligo7 بررسی گردید. پرایمرهای طراحی شده از شرکت سیناکلون دریافت شد. توالی پرایمرهای به کار برده شده در جدول 2 آورده شده است. برای انجام این تکنیک از کیت Real Q plus 2X Master mix Green استفاده شد. تمامی موارد مورد نیاز برای واکنش اعم از dNTP، MgCl2، آنزیم تک پلی مراز، سایبرگرین، پرایمر و cDNA می باشد که طبق دستورالعمل جدول 3 انجام شد. هم چنین برنامه دمایی ۳ مرحله ای را مطابق جدول 4 اجرا گردید.

 

جدول 2- مشخصات پرایمرهای جلوبرنده و معکوس بتا اکتین و فاکتور نکروز تومورآلفا

تعداد ( bp)	سکانس	نام پرایمر
20	TTCCTTCCTGGGCATGGAGT	-act F.β
20	TACAGGTCTTTGCGGATGTC	-act R.β
22	GTAGCCCATGTTGTAGCAAACC	TNF-α F.
22	TTATCTCTCAGCTCCACGCCATT	TNF-α R.

جدول 3- مقادیر مورد نیاز مواد در واکنش Real Time PCR

غلظت نهایی	حجم بر اساس هر واکنش	ترکیبات
1X  (μM5/0- 05/0) μM 1/0  (μM5/0- 05/0) μM 1/0	μl5/12  (μl 5/2-25/0) μl 5/0  (μl 5/2-25/0) μl 5/0 X μl X μl	Real Q plus 2X Master mix Primer A Primer B PCR grand H2O cDNA

جدول 4- برنامه دمایی ۳ مرحله ای جهت انجام Real Time PCR

Temperature	Duration of cycle	Cycle
˚C95	min15	1
˚C95 ˚C60-55 ˚C72	s15-13 s30 s30	40

 

 

تحلیل آماری

پس از مشخص شدن Ctها، داده ها در برنامه Rest و Excel وارد و سپس ∆Ct و ∆∆Ct برای نمونه ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.

∆Ct= Ct sample - Ct house keeping gene

∆Ct= Ct TNF-α - Ct β-actin

∆∆Ct= ∆Ct sample - ∆Ct control

و سپس از رابطه ^-∆∆Ct 2 تغییرات میزان بیان ژن مشخص و بـرای مقایسـه میـانگین متغیرهای کمی قبل و بعد از مداخله، در داخل هـر گـروه از آزمون t زوج استفاده شد. میانگین 2^-∆∆Ct، انحراف معیار و P-value برای گروه های تیمار محاسبه گردید تا معنی دار بودن یا نبودن تاثیر عصاره زنجبیل بر نمونه ها بررسی شود.

نتایج

نتایج مربوط به کشت سلول ها

پس از کشت اولیه، سلول های بنیادی مزانشیمی به صورت تک لایه ای از سلول های دوکی شکل، کف ظرف را پوشاندند. با مشاهدات میکروسکوپی، ملاحظه شد که به طور فزاینده ای بر تعداد سلول های چسبنده افزوده می شود. این سلول ها در طی دوره رشد، ریخت­شناسی فیبروبلاستی خود را حفظ نمودند(شکل 1).

نتایج مولکولی مربوط به بیان ژن TNF-α

برای بررسی بیان ژن TNF-α توسطReal-time PCR از روش کمیت سنجی نسبی و متد استفاده شد. نتایج آنالیز مولکولی نشان داد که بیان ژن TNF-α در MSCs مشتق از مغز استخوان انسان در گروه های تیمار نشده و تیمار شده با TNF–α با یک­دیگر متفاوت بودند. در اکثر گروه ها میزان بیان ژن در گروه های تیمار شده به طور معنی داری کمتر می باشند. نتایج حاصل از نمودار melt curve  در نمودار 1 نشان داده شده است.

آنالیز بیان ژن TNF-α در غلظت μgml^-1 50 در سه بازه زمانی 2، 16 و 24 ساعت

نتایج به دست آمده نشان دهنده این مطلب بود که در زمان 16 و 2 ساعت پس از تیمار سلول ها با عصاره زنجبیل، میزان بیان ژن TNF-α تغییر معنی داری نشان نمی دهد اما پس از گذشت 24 ساعت کاهش بیان ژن TNF-α معنی دار(05/0P≤) خواهد بود. بنابراین در بازه­های زمانی صورت گرفته، زمان موثر زنجبیل برای کاهش بیان ژن TNF-α در غلظت 5۰ میکروگرم بر میلی لیتر زمان 24 ساعت بوده است که بیشترین کاهش بیان را نشان می دهد(نمودار2 و جدول 5).

آنالیز بیان ژن TNF-α در غلظت μgml^-1100 در سه بازه زمانی 2، 16 و 24 ساعت

نتایج به دست آمده حاکی از آن است که 2 ساعت پس از تیمار کاهش معنی دار بیان ژن مشاهده شد و پس از گذشت 16 و 24 ساعت کاهش بیان ژن TNF-α شدیدتر و معنی دار (05/0P≤) خواهد بود( نمودار 3). در مقایسه ای که بین غلظت های 5۰ و ۱۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر در هر سه زمان ۲، ۱۶و ۲۴ ساعته صورت گرفت، مشخص شد که به جز گروه هایی با 2 و16 ساعت تیمار با غلظت های 5۰ میکروگرم بر میلی لیترکه افزایش بی معنی میزان بیان ژن TNF-α مشاهده شد، در سایر گروه های تیمار کاهش معنی دار میزان بیان ژن TNF-α مشاهده گردید. هم چنین گروه هایی با 16 و ۲۴ ساعت تیمار باغلظت ۱۰۰ میکروگرم بر میلی لیترعصاره زنجبیل بهترین زمان و غلظت تاثیر بین گروه های فوق را دارا است(نمودار 4). نتایج حاکی از تاثیر وابسته به غلظت و زمان عصاره زنجبیل بر میزان بیان ژن TNF-α می باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسانی با تراکم ۷۰٪. پاساژ ششم. با بزرگنمایی ×4

 

 

 

 

 

نمودار1- نمودار melt curve تکثیر قطعه  bp 101 ژن TNF-α با پرایمرهای اختصاصی

 

 

 

 

جدول5- نتایج به دست آمده از آنالیز بیان ژن TNF-α در غلظت μgml^-1 50 و μgml^-1 100

	گروه	انحراف از معیار±میانگین
Ctrl	کنترل	0/0±1
G1	ginger 2h dose 50	169/0± 296/2	عدم تغییرمعنی دار
G2	ginger 2h dose 100	033/0±157/0	کاهش معنی دار
G3	ginger 24h dose 50	01/0±155/0	کاهش معنی دار
G4	ginger 24h dose 100	00/0±009/0	کاهش معنی دار
G5	ginger 16h dose 50	188/0±607/0	عدم تغییرمعنی دار
G6	ginger 16h dose 100	00/0±009/0	کاهش معنی دار

 

 

نمودار 2- نمودار ستونیمیزانبیان ژنTNF-α در غلظت μgml^-1 50 از عصاره زنجبیل بعد از 2، 16 و 24 ساعت.

 

نمودار3 – نمودار ستونی میزان بیان ژنTNF-α  در غلظت μgml^-1 100 از عصاره زنجبیل بعد از 2، 16 و 24 ساعت

 

نمودار 4- نمودار خطی مقایسه تاثیر غلظت های μgml^-1 100 و 50 عصاره زنجبیل بر روی بیان ژن TNF-α در سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان

 

 

بحث ونتیجه گیری

علارغم وجود داروهای شیمیایی فراوان در جهت درمـان التهـاب، هم چنان مـشکل عدم توانایی موفق درمان التهاب به خصوص نـوع مـزمن آن و اثرات جانبی گسترده داروهای سنتزی وجود دارد. با توجه به مشکلات بالینی ناشی از التهاب، سعی محققین بر آن است که روش های درمانی جدید، بهتر، موثرتر و با عوارض جـانبی محدودتر استفاده شود. مواد موثره موجود در زنجبیل با اثرات ضد موتاژنیک، ضد کارسینوژنیک، ضد التهابی و آنتی اکسیدانی خود می تواند در درمان بیماری­های التهابی و مرتبط با سن نظیر بیماری های قلبی عروقی، دیابت، آرتریرت، استؤپورز و سرطان ها وغیره موثر باشد(18). تحقیقات نشان می دهند که عصاره گیـاه زنجبیـل احتمالاً از طریق مهار آزاد سازی واسطه های التهابی محیطـی توانـسته است میزان التهاب را کاهش دهد. ماده جینجرول به عنوان ترکیب موثره گیاه زنجبیل دارای توانـایی  قوی در مهار تولید پروستاگلاندین ها، لکوترین ها و کنین بـه عنوان مهم ترین واسطه ی التهابی می باشد. علاوه بـر ایـن هـا مهار آزادسازی انواع سیتوکین، TNF و اینترلوکین یک بتا کـه جزو واسطه­های مهم التهابی مـی باشـند توسـط عـصاره گیـاه زنجبیل گزارش شده و نشان داده که کـاهش فـاکتور هسته ای کاپابی به عنوان ماده القاء شده در فرآینـدهای التهـابی به وسیله اینترلوکین ها، توسط آنزیم فسفاتاز کیناز موجود در گیاه کاهش و سبب مهار التهاب می گردد(19). باتوجه به نتایج تحقیقات قبلی، عصاره زنجبیل قادر است التهاب را مهار کند که احتمالاً این اثر ضد التهابی عصاره از طریق مهار سیکلواکسیژنازها به خصوص سیکلواکسیژناز - 2 و پروستاگلاندین E₂ در سیستم عصب مرکزی گردیده است(9). هم چنین زنجبیل دارای ترکیبات فیتوشیمیایی مهمی چون فلاونوییدها می باشد که دارای اثرات ضدالتهابی دارند(32). موادی مانند quercetin, rutin, catechinepicatechin, naringenin, kaempfero از جمله ترکیبات فلاونوئیدی موجود در زنجبیل می باشند(11). چنان چه فلاونوییدها با مهار فعالیت گیرنده N–متیل-D-آسپارتات، سبب کاهش کلسیم داخل سلولی می گردند و به دنبال آن فعالیت آنزیم سنتزکننده نیتریک اکساید و فسفولیپاز A₂ وابسته به کلسیم را کاهش می دهند. در نتیجه با کاهش نیتریک اکساید و پروستاگلاندین ها، به ویژه پروستاگلاندین E₂ و F₂α، اثرات ضد دردی و ضد التهابی خود را نشان می­دهند(9). هم چنین گزارش شده است که تاثیرات ضد التهابی فلاونوئیدها ناشی از مهار سیتوکین های التهابی نظیر فاکتور نکروز دهنده تومور که از ماکروفاژهای فعال در التهاب ترشح می شوند و سبب افزایش پروتاگلاندین­ها می گردند، می باشد(32). برخی از فلاونوئیدها نیز از طریق مهار کاتکول O-متیل ترانسفراز و حفظ کاتکول آمین ها خواص آنتی اکسیدانی و ضدالتهابی خود را اعمال می کنند(38). سایر ترکیبات زنجبیل از جمله شوگائول نیز دارای اثرات فارماکولوژیک مشابه با داروهای غیراستروئیدی ضدالتهابی(NSAIDS, Nonsteroidal anti-inflammatory drugs) هستند و سبب مهار متابولیسم آراشیدونیک اسید و در نهـایت سنتز پروستاگلاندین می­شوند و بنابراین به عنـوان یک عامــل ضدالتهـابی موثـرتر از داروهـای ضـدالتـهـابی مرسـوم و با اثـرات جـانبی کمـتر عمل می کننـد(7). 6 شوگــائول دارای اثـرات ضددردی از طریق مهار آزادسازی ماده P است. به نظر می­رسد که 6 شوگائول با آبشار آراشیدونیکالتهاب مداخله می کند و منجر به مهار سیکلواکسیژناز و جلوگیری از آزادسازی پروستاگلاندین می شود. هم­چنین زنجبیل در درمان التهاب و روماتیسم مؤثر است که این را از طریق مهار سنتز لوکوترین و پروستاگلاندین انجام می دهد(12). عصاره زنجبیل سبب مهـار بیـان ژن­هـای متعـدد درگیـر در پـاسـخ های التهابی می گردد که این شامل ژن های کدکننده سیتوکینین، کیموکینین و آنزیم سیکلواکسیژناز2 است(31، 1). در مطالعـــه Levy و Simon مشـــخص گردیـــد کـــه 6 -شوگائول( ترکیب فعال زنجبیل خشک شـده)، مـی توانـد میزان TNF-α در ماکروفاژهای فعال شده با لیپوپلی ساکارید را کاهش دهد(22). تحقیقات نشان می دهند که زنجبیل از طریق مهار فعالیت فاکتور هسته ای کاپا(NF-κB)، سطوح TNF-α و -6 IL را در التهاب کبد کاهش دهد و باعث کاهش سیتوکین ها و مارکرهای التهابی کبد گردد(23). هم چنین نشان داده شده که جینجرول دارای اثر محافظتی بر روی نفرون ها با کاهش فرآیند التهاب می باشد، به طوری که باعث کاهش معنی دار در mRNA و رونویسی فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا، اینترلوکین-2 و اینترفرون گاما می گردد(33). در این تحقیق نیز مشابه نتایج ما تاثیرات وابسته به غلظت مشاهده شد. در تحقیق دیگری Shim از زنجبیل با غلظت μgml^-1 100 بر روی سلول های عصبی استفاده نمود، که نتایج نشان دهنده ی مهار سیتوکین های پیش التهابی و کاهش سطوح iNOS(Inducible nitric oxcide synthase )، سیکلواکسیژناز-2(COX2)، NF-κB و بهبود عملکرد نورولوژیکی می باشد(35). 6-هیدروجینجردیون نیز که یکی از اجزاء مهم زنجبیل می باشد قادر است سنتز iNOS، COX2، IL-1B، TNF-α و IL-6 ماکروفاژهای موش را به واسطه LPS(Lipo poly saccarides) کاهش دهد(14). مطالعات بالینی تاثیر زنجبیل بر بیماران دیابتی نیز نشان می دهد که زنجبیل با کاهش خطرات عوارض مزمن ناشی از دیابت از طریق کاهش التهاب(کاهش بیان TNF-α، IL-6 و C-reactive protein) CRP) مؤثر است(25، 24، 4). هم چنین نشان داده شده است که جینجرول-2 و شوگائول-3 موجود در زنجبیل قادرند به عنوان مهار کننده های رسپتور های سوتونین عمل کنند(17) و منجر به محدود شدن آزادسازی ماده P گردند که واسطه التهابی و درد محسوب می شود. در ضمن مهار گیرنده سروتونین همراه با کاهش پروستاگلاندین ها IL-1، IL-2، IL-6  و TNF-α می­باشد(27). نکته جالب آن است که زنجبیل بیان ژن های ضد التهابی نظیر IL-10 را نیز افزایش می دهد(26). هم چنین عصاره زنجبیل سنتز سیتوکین های التهابی و کموکین های التهابی را در ماکروفاژهای تحریک شده مهار می کند و با تنظیم کاهشی ماکروفاژهای ارایه کننده آنتی ژن ها و مهار فعالیت آن ها باعث کاهش رشد سلول­های T می گردد(17). به نظر می رسد تأثیر زنجبیل بر کاهش التهـاب از طریـق تأثیر برخی ترکیبات فعال آن(جینجرول ها و زرومبون) بـرمهار فاکتور هسته ای NF-κB )κB ) و TNF-α نیز می باشد. ترکیبـات موجود در زنجبیل سـبب مهار بیانNF-κB و TNF-α می شوند. مهار ژن TNF-α به وسیله زنجبیل، سبب کاهش فعالیـت NF-κB  شده در نتیجه سایر مسیرهای التهـابی ماننـد آنـزیم سیکلواکسیژناز2(COX2) و محصولات ناشی از آن مانند پروستاگلاندینE2 نیز مهار می گردند. این امـر باعـث کـاهش التهاب و عوارض آن در بدن می شود(15) که با نتایج پژوهش حاضر(در مورد کاهش TNF-αکه به صورت In vitro صورت پذیرفت) نیز هم­خوانی دارد. در این تحقیق و برخی مطالعات پیشین نشان داده شده که داروی گیاهی زنجبیل می تواند در کاهش فاکتورهای التهابی مؤثر باشد. پس می توان بیان نمود که زنجبیل می تواند به عنوان یک داروی گیاهی با عوارض بسیار محدود در کاهش التهاب بیماران دیابتی موثر باشد. اگر چه از نظر طب سنتی مصرف زنجبیل سابقه طولانی دارد ولی از جنبه بالینی، تاکنون مطالعات بسیار محدودی در زمینه ارزش درمانی زنجبیل تداخلات دارویی و عوارض احتمالی آن انجام گرفته است. بنابراین لزوم تحقیقات بیشتر در زمینه روشن شدن این موارد در پژوهش های آتی ضروری به نظر می رسد.

مراجع

. Aimbire, F., Penna, S.C., Rodrigues, M., Rodrigues, K.C., Lopes – Martins, R. AB., Sertie, JAA. (2007). Effects of hydro alcoholic extract of Zingiber officinalis rhizomes on LPS induced rat airway hyper reactivity and lung inflammation. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 77; 129 – 138.

2.Alberti, K., Aschner, P., Assal, JP., Bennett, P., Groop, L. (2008). Dyslipidaemia in diabetic rats. J Ethnopharmacol Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 31(1); S55-60.

3.Ali, BH., Blunden, G., Tanira, MO., Nemmar, A. (2008). Some phytochemical, pharmacological and toxicological properties of ginger. A review of recent research. Food and chemical Toxicology, 46(2); 409-20.

4.Aryaeian, N., Arablou, T., Valizadeh, M., Sharifi, F., Fatemeh Hosseini, A., Djalali ,M. (2014). .The effect of ginger consumption on glycemic status, lipid profile and some inflammatory markers in patients with type 2 diabetes mellitus. International Journal of Nutrition and Food sciences, 65(4); 515-520.

5.Barzkar, Z. (2015). An applied research in properties and clinical application of bone marrow messnchymal stem cells. Jound of Fasa University of Medical Sciences, 5(2); 306-322.

6.Bianco, P., Robey, P.G., Simmons, P.J. (2008). Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell, 2; 313-319.

7.Charlier, C., Michaux, C., Dual, A. (2005). Inhibition of cyclooxygenase-2 effects of ginger aqueous extract and its phenolic constituents are mediated through multiple pathways. Vascular Pharmacology, 43; 234–241.

8.Chung, SW., Kim, MK., Chung, JH., Kim, DH., Choi, JS., Anton, S. (2009). Peroxisome pro liferator activated receptor activation by a short-term feeding of zingerone in aged rats. Journal of medicinal food, 12(2); 345-50.

9.Dickenson, AH. (1994). Neuro physiology of opioid poorly responsive pain. Cancer Surv, 21; 5-16.

10.Eini, L. (2014). Expression of indoleamine 2 3-dioxygenase in endometrial mesenchymal stem cells treated with gamima interferon. Iranian Journal of Diabetes and Metabolism,13( 2); 153-162.

11.Ghasemzadeh, A., Jaafar, HZ., Rahmat, A. (2010). Identification and concentration of some flavonoid components in malaysian young ginger(Zingiber officinale ) varieties by a high performance liquid chromatography method. Molecules, 15; 6231-6243

12.Grzanna, R., Lindmark, L., Frondoza, CG. (2005). Ginger-an herbal medicinal product with broad anti-inflammatory actions. J Med Food, 8(2); 125-32.

13.Grzanna, R., Phan, P., Polotsky, A., Lindmark, L., Frondoza, CG. (2004). Ginger extract inhibits β-amyloid peptide-induced cytokine and chemokine expression in cultured thp-1 monocytes. J Altern Complement Med, 10(6); 1009-1013.

14.Guahk, GH., Ha, SK., Jung, HS., Kang, C., Kim, CH., Kim, YB. (2010). Zingiber officinale protects HaCaT cells and C57BL/6 mice from ultraviolet B-induced inflammation. Journal of medicinal food, 13(3); 673-80.

15.Habib, SHM., Makpol, S., Hamid, NAA., Das, S., Ngah, WZW., YusofI, YAM. (2008). Ginger extract(Zingiber Officinale ) has anti-cancer and anti-inflammatory effects on ethionine- induced hepatoma rats. CLINICS, 63(6); 807-813.

16.Hajar Tavakoli, H., Aryaeian, N. (2016). A review of the effect of Ginger in inflammation. Rahavard salamat journal, 2(1); 52-64.

17.Huang, Q., Iwamoto, M., Aoki, S., Tanaka, N., Tajima, K., Yamahara, J. (1991). Anti-5 hydroxy tryptamine 3 effect of galanolactone, diterpenoid isolated from ginger. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 39(2); 397-399

18.Kim, MK., Chung, SW., Kim, DH., Kim, JM., Lee, EK., Kim, JY. (2010). Modulation of age-related NF-κB activation by dietary zingerone via MAPK pathway. Experimental gerontology, 45(6); 419-426.

19.Lantz, RC., Chen, GJ., Sarihan, M., Sólyom, AM., Jolad, SD., Timmermann, BN. (2007). The effect of extracts from ginger rhizome on inflammatory mediator production. Phytomedicine, 14; 123-128.

20.Leach, MJ., Kumar, S. (2008). The clinical effectiveness of ginger(zingiber officinale) in adults with osteoarthritis. Int J Evid Based Healthc, 6(3); 11-20.

21.Lee, HY., Park, SH., Lee, M., Kim, HJ., Ryu, SY., Kim, ND. (2012). 1  Dehydro [10] gingerdione from ginger inhibits IKKβ activity for NF κB activation and suppresses NF κB regulated expression of inflammatory genes. British journal of pharmacology, 167(1); 128-140.

22.Levy, A., Simon, O. (2009). Six-shogaol inhibits production of tumour necrosis factor alpha, interleukin-1 beta and nitric oxide from lipo poly saccharide -stimulated macrophages. West Indian Med J, 58(4); 295-300.

23.Li, XH., McGrath, KCY., Nammi, S., Heather, AK., Roufogalis, BD. (2012). Attenuation of liver pro inflammatory responses by Zingiber officinale via inhibition of NF kappa B activation in high fat diet fed rats. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 110(3); 238-244.

24.Mahluji, S., Attari, VE., Mobasseri, M., Payahoo, L., Ostadrahimi, A., Golzari, SE. (2013). Effects of ginger(Zingiber officinale) on plasma glucose level, HbA1c and insulin sensitivity in type 2 diabetic patients. Int J Food Sci Nutr, 64(6); 682-686.

25.Mahluji, S., Ostadrahimi, A., Mobasseri, M., Attari, VE., Payahoo, L. (2013). Anti-inflammatory effects of Zingiber officinale in type 2 diabetic patients. Advanced Pharmaceutical Bulletin, 3(2); 273-276.

26.Mu, J., Zhuang, X., Wang, Q., Jiang, H., Deng, ZB., Wang, B. (2014). Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome‐like nanoparticles. Molecular Nutrition & Food Research, 58(7); 1561-73.

27.Muller, W., Fiebich, BL., Stratz, T. (2006). New treatment options using 5-HT3 receptor antagonists in rheumatic diseases. Current Topics in Medicinal Chemistry, 6(18); 2035-42.

28.Navarro, JF., Mora, C. (2006). Diabetes, inflammation, proinflammatory cytokines, and diabetic nephropathy. Scientific World Journal, 6; 908-917.

29.Panigrahi, R. (2014). Association of TNF-α promoter polymorphism with HBV associated disease outcome among HBV infected patients from orissa,southern part of east india . Journal of Clinical and Experimental Hepatology , 4 (3); 202-208.

30.Prasanthi, K., Chagani, S., Gundala, SR., Rida, PC., Asif, G., Sharma, V. (2012). Benefits of whole ginger extract in prostate cancer. British Journal of Nutrition, 107; 473–484.

31.Raji, Y., Udoh, US., Oluwadara, OO., Akinsomisoye, OS., Awobajo, O., Adeshoga, K. (2002). Anti-inflammatory and analgesic properties of the rhizome extract of Zingiber officinale. African Journal of Biomedical Research, 5; 121-124.

32.Rang, HP., Dale, MM., Ritter, JM.(1999). Text book of pharmacology.3^th ed. New York: Churchill Livingston, 148-633.

33.Rodrigues, FA., Prata, MM., Oliveira, IC., Alves, NT., Freitas, RE., Monteiro, HS. (2014). Gingerol fraction from Zingiber officinale protects against gentamicin-induced nephrotoxicity. Antimicrobial agents and chemotherapy, 58(4); 1872-8.

34.Sabina, EP., Rasool, M., Mathew, L., EzilRani, P., Indu, H. (2010). 6-Shogaol inhibits monosodium urate crystal-induced inflammation–An in vivo and in vitro study. Food and Chemical Toxicology, 48(1); 229-35.

35.Shim, S., Kim, S., Choi, D-S., Kwon, Y-B., Kwon, J. (2011). Anti-inflammatory effects of [6]-shogaol: potential roles of HDAC inhibition and HSP70 induction. Food and Chemical Toxicology, 49(11); 2734-40.

36.Shimoda, H., Shan, S-J., Tanaka, J., Seki, A., Seo, J-W., Kasajima, N. (2010). Anti-inflammatory properties of red ginger  extract and suppression of nitric oxide production by its constituents. Journal of Medicinal Food, 13(1); 156-62.

37.Singh, A., Duggal, S., Singh, J., Katekhaye, S. (2010). Experimental advances in pharmacology of gingerol and analogues. Pharmacie Globale(IJCP), 2(4);1-5.

38.Toker, G., Kupeli, E., Memisoglu, M., Yesilada, E. (2004). Flavonoids with anti nociceptive and anti inflammatory activities from the leaves of Tilia argentea(Silver linden). J Ethnopharmacol, 95; 393-7.