اثرات عصاره هیدروالکلی گیاه آنغوزه(Ferula assafoetida) در جیره غذایی بر بیان ژن‌های مرتبط با ایمنی(TNF-alpha و IL1B) درماهی گورخری(Daniorerio)

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 5، دوره 11، شماره 3 - شماره پیاپی 42، شهریور 1397، صفحه 55-66   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

رقیه صفری^* ؛ فاطمه واحدی امیری؛ علی شعبانی؛ سید حسین حسینی فر؛ حامد کلنگی میانده

گروه تکثیر و پرورش آبزیان، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

چکیده

زمینه و هدف: افزایش روز افزون مقاومت های باکتریایی نسبت به آنتی بیوتیک های تجاری، گرایش به استفاده از گیاهان را به منظور تحریک سیستم ایمنی ذاتی افزایش داده است. هدف از این تحقیق ارزیابی اثرات عصاره هیدرو الکلی گیاه آنغوزه(Ferula assafoetida) بر بیان ژن­های مرتبط با ایمنی(TNF-alpha و IL-1β) در ماهی گور­خری بود.
روش کار: بدین منظور ماهیان با میانگین وزنی 01/0±3/0 گرم با غذای حاوی سه سطح مختلف 5/0، 1، و 2 درصد عصاره فرولا و یک گروه شاهد با جیره پایه به مدت 8 هفته تغذیه شدند. در پایان دوره از بافت روده نمونه­برداری و RNA از نمونه­های روده استخراج و cDNA سنتز گردید، بررسی با روش Real Time PCR و استفاده از آغازگرهای اختصاصی TNF-alpha و IL-1β صورت پذیرفت.
یافته ها: نتایج افزایش میزان بیان ژن هر دو ژن در تیمار تغذیه‌شده با جیره حاوی عصاره آنغوزه در سطح 2% را نشان داد که این افزایش ازنظر آماری در ژن TNF-alpha با تیمارهای 5/0% و 1% معنی­دار بود(05/0P<). در بررسی بیان ژن IL-1β، هرچند در تیمار ازنظر آماری اختلاف معنی­داری بین تیمارهای تغذیه­شده با آنغوزه مشاهده نشد(05/0P>)، اما تیمار تغذیه‌شده با جیره حاوی 2% عصاره آنغوزه میزان بیان بالاتری را نشان داد.
نتیجه گیری: بر اساس نتایج به نظر می­رسد استفاده از عصاره هیدرو الکلی گیاهی آنغوزه می­تواند به‌واسطه افزایش بیان نسبی سایتوکین­های التهابی به بهبود وضعیت ایمنی در ماهی گور­خری کمک نماید.

کلیدواژه‌ها

ماهی گور‌خری؛ آنغوزه؛ ژن TNF-alpha؛ IL-1β

اصل مقاله

مقدمه

 

با توجه به افزایش جمعیت جهان ونیازبه تامین مواد غذایی از منابع مختلف، صنعت آبزی­پروری رشد قابل­توجهی داشته و به سمت سیستم­های متراکم و فوق متراکم پیش رفته است(4)، که نیاز به کنترل کیفیـت آب، تغذیه­وپیشگیری از بیماری­ها بیش از پیش احساس می­گردد(25). نقش مهم سیستم ایمنی در حفظ سلامت آبزیان وتضمین بقاء و رشد مناسب آن‌ها در طول دوره پرورش، سبب شده تا محققین به استفاده از انواع ترکیبات شیمیایی و طبیعی محرک و تقویت‌کننده سیستم ایمنی تمایل نشان دهند. در مزارع پرورش ماهی و هچری­ها آنتی­بیوتیک­ها، واکسن­ها و برخی مواد شیمیایی به­عنوان محرک ایمنی در برابر ویروس­ها، باکتری­ها، انگل­ها و بیماری­های قارچی استفاده می­شود .استفاده از آنتی­بیوتیک­ها و پیش‌گیری کننده‌های شیمیایی در مقابل بیماری آبزیان دارای عوارضی چون ایجاد مقاومت در عامل بیماری نسبت به دارو، تجمع زیستی در گوشت آبزیان، آلودگی محیط‌زیست و بیمار نمودن انسان به باکتری­های مقاوم شده است(3). به همین جهت در سال­های اخیر جهت پیش­گیری، کنترل بیماری یا افزایش ایمنی به افزودن مکمل­های غذایی طبیعی توجه بیشتری شده است. ازآن جایی‌که برخی گیاهان دارویی دارای طیف وسیعی از خواص مفید ازجمله تحریک و تقویت سیستم ایمنی هستند،در بسیاری از کشورها استفاده از محرک­های ایمنی گیاهی برای کنترل بیماری، افزایش پاسخ ایمنی ذاتی و اکتسابی ماهی توسعه‌یافته است(18). استفاده از گیاهان دارویی در جیره غذایی ماهی، موجب بهبود عملکرد سیستم ایمنی مانند افزایش فعالیت ضد باکتریایی، افزایش فعالیت لیزوزیم، پاسخ آنتی­بادی و افزایش بیان ژن­های مرتبط با ایمنی در ماهی می­شود(19). مطالعات متعددی در زمینه تعیین اثرات مثبت گیاهان دارویی به‌عنوان محرک ایمنی طبیعی جایگزین مواد شیمیایی در آبزی­پروری صورت گرفته است که از آن جمله می­توان به بررسی اثرات گیاه گلپر بر ماهی(Malabaricus epinephelus)(32)، عصاره سیر بر ماهی(Lates calcarifer.)(31)، عصاره سرخار گل(Echinacea purpurea) بر ماهی قزل­آلای رنگین­کمان(Oncorhynchus mykiss)(23(، عصاره خرما و گیاه غازیاقی(Falcaria vulgaris) بر ماهی کپور معمولی(Cyprinus carpio)(20، 8) و گیاه گون(Glycyrrhizaglabra) و شیرین­بیان(Astragalus membranaceus) بر ماهی سوف زرد (Percafla vescens) اشاره نمود(12). گیاه آنغوزه با نام علمی (Ferula assa foetida)، بومی ایران و افغانستان یک گیاه چندساله از خانواده چتریان است. صمغ آنغوزه حاوی فرولیک اسیدو استرهای کومارینی فوئتیدین و کامولونول،آمبلی­فرون، فرانسی­فرول، تتراسولفیدها، سزکویی ترپن­ها، گلوکز، گالاکتوز، رامنوز، پلی­ساکاریدها، گلیکوپروتئین­ها و هم چنین روغن­های فرار سولفوره و ترپنوئیدها می­باشد(24). مطالعات دارویی و بیولوژیکی خواص آنتی­اکسیدانی، ضد قارچی، ضدویروسی، ضداسپاسمی، ضد سرطانی و کاهش­دهنده فشارخون این گیاه را نشان داده است(35). سیستم ایمنی ماهیان همانند سایر مهره­داران از اندام‌ها در برابر عوامل بیماری­زا دفاع می­کند. سایتوکین­ها گلیکوپروتئین­های محلول می­باشند که در تنظیم عملکرد سیستم ایمنی نقش عمده­ای دارند. این ترکیبات دارای گیرنده­هایی بر سلول­های هدف بوده و بااتصال به گیرنده­ اثر خود را بر سلول القاء می­کنند. در سیستم ایمنی ماهی­ها و در ارتباط با التهابات مولکول سایتوکینی فاکتور نکروزکننده تومور(TNF) نقش مهمی دارد که به دنبال تحریک سیستم ایمنی از گلبول­های سفید ترشح می­شود(17، 16). اینترلوکین­ها، سایتوکین­هایی می­باشند که از لکوسیت ترشح و بین سایر لکوسیت­ها اثر می­کند. IL-1B نقش مهمی در پاسخ میزبان به تهاجم میکروبی، آسیب بافتی و واکنش ایمونولوژیک ایفا می­نماید(10). ماهی گور­خری(Dani orerio) ماهی با اندازه کوچک (معمولاً کم­تر از 40 میلی­متر) از گونه­های آب شیرین مناطق گرمسیری بومی پاکستان و هند و ساکن آب­های کم­عمق است(21).با توجه به مزایای آن ازجمله سهولت تکثیر و وسیع بودن دامنه تحمل حرارتی، این‌گونه توانسته است نظر علاقمندان زیادی را به خود جلب نموده و در بسیاری از آزمایشات(ژنتیک مولکولی و تحقیقات زیست پزشکی) از آن به­عنوان مدل آزمایشگاهی استفاده می­نمایند(29). در مطالعه پیشین صفری و همکاران، اثر پودر گیاه آنغوزه بر بهبود وضعیت ایمنی ماهی کپور بررسی نموده و اثرات مثبت آن را مشاهده کرده است(26). ازآن جا که گزارشی در رابطه با اثر عصاره هیدروالکی این گیاه بر ایمنی ماهی گورخری صورت نگرفته است مطالعه حاضر با هدف بررسی این عصاره بر بیان ژن­های دخیل در ایمنی(TNF-alpha و IL-1β) صورت گرفت.

مواد و روش ها

تهیه ماهی و سازگاری به شرایط آزمایشگاهی

بچه ماهی‌های گورخری از مرکز خصوصی تکثیر و پرورش ماهیان زینتی واقع در شصت کلا، استان گلستان تهیه و با پلاستیک­های محتوی یک‌سوم آب و دوسوم هوا به مرکز تحقیقات آبزی­پروری شهید فضلی برآبادی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان منتقل شدند. ابتدا ماهیان جهت انگل­زدایی و بهبود استرس ناشی از حمل‌ونقل در آب‌نمک(NaCl) به غلظت 2 درصد به مدت ربع ساعت حمام داده شدند و مدت 48 ساعت جهت کاهش تلفات احتمالی و استرس غذادهی نشدند. جهت آدابتاسیون ماهیان به مدت 2 هفته با شرایط آزمایشی عادت دهی­گردیدند. در این 2 هفته ماهیان با جیره غذایی پایه(بیومار) مورد تغذیه واقع شدند. طی این مدت روزانه 50 درصد آب مخازن با آب شهری کلرزدایی شده تعویض شد.

طرح آزمایش و مدیریت مخازن

این آزمایش به‌صورت طرح کاملاً تصادفی در 4 تیمار و هر تیمار با 3 تکرار انجام شد. تیمارها شامل گروه تغذیه‌شده با(شاهد)، 5/0، 1 و 2 درصد عصاره هیدرو الکلی گیاه آنغوزه بودند(26). به‌طور تصادفی تعداد 50 عدد ماهی با میانگین وزنی حدود 01/0±3/0 گرم در آکواریوم­های شیشه­ای 50 لیتری ذخیره‌سازی گردیدند. هوادهی آکواریوم­ها با استفاده از سنگ هوای متصل به پمپ هواده صورت گرفت. در این آزمایش در طول دوره پرورش میانگین دمای آب 2±25 درجه سانتی‌گراد، دامنه pH 8-7 و میانگین اکسیژن 7 میلی‌گرم در لیتر اندازه­گیری شد.

تهیه غذا، عصاره و غذادهی

گیاه آنغوزه ازشهرستان بی ارجمند استان سمنان در بهار 1395، جمع­آوری و مورد تأیید اساتید گیاه‌شناسی دانشگاه گلستان قرارگرفت. اندام­های هوایی پس ازجدا شدن درسایه‌خشک گردیدند، سپس با استفاده از آسیاب برقی به‌صورت پودر در آمد. جهت تهیه عصاره هیدرو الکلی بر اساس دستورالعمل استخراج هیدروالکلی گیاه سرخار گل با استفاده از افزودن  g20 پودر گیاه آنغوزه و 400 میلی‌لیتر متانول60% تهیه شد. بدین منظور مخلوط آماده ‌شده باگذشت زمان مورد نظر محتویات موجود در ارلن را از روی چند گاز استریل عبور داده تا رسوبات از عصاره جدا و محلول صاف‌شده را با کاغذ صافی والتمن صاف و به یک بشر ضدعفونی شده منتقل و با دستگاه روتاری حلال موجود حذف شد، سپس در دستگاه خشک­کن انجمادی به پودر خشک تبدیل گردید(9). بعد از تهیه عصاره،ابتدا جیره پایه(غذای بیومار) با ترازوی دیجیتال با نشان تجاری AND EK610i با دقت 001/0گرم توزین و به نسبت وزن غذا برای سطوح مختلف، عصاره آنغوزه به‌صورت محلول در ژلاتین 5 درصد روی غذا به­صورت یکنواخت اسپری و مخلوط شد. جیره­های آماده‌شده در هوای محیط آزمایشگاه خشک و در پلاستیک­های زیپ­دار قرار داده‌شده و تا زمان مصرف به یخچال با دمای 4 درجه سانتی‌گراد منتقل گردیدند. غذادهی به میزان 5% وزن بدن به‌طور روزانه در طی 4 الی5 نوبت صورت گرفت.

نمونه‌برداری، استخراجRNA، سنتز cDNA

بعد از 2 ماه پرورش و تغذیه با سطوح مختلف آنغوزه، جهت بررسی میزان بیان ژن مرتبط با ایمنی(TNF-alpha, IL1B) در شرایط استریل از روده ماهی ها نمونه‌برداری شد. از هرتکرار3 ماهی نمونه برداری و با استفاده از پودر گل میخک با دوز ppm 200 بی‌هوش و پس‌ازآن سطح بدن با پنبه آغشته به الکل استریل­شده و به‌سرعت ناحیه شکم ماهی باز ­گردید. بافت روده جدا شده و پس از جمع‌آوری، به داخل تیوپ‌های از قبل استریل­شده ریخته و بلافاصله تیوپ‌ها به تانک ازت انتقال داده شدند. در پایان نمونه­برداری نمونه­ها در یخچال 80- درجه سانتی­گراد قرار داده شدند و تا زمان استفاده جهت استخراج RNA در آن جا نگهداری گردیدند. استخراج RNA بر اساس روشتوسط ماده هضم‌کننده بایوزول انجام شد(1). RNA کل از 100 میلی‌گرم نمونه بافت­های روده هموژن شده با ازت مایع با استفاده از بیوزول و طبق دستورالعمل شرکت سازنده(Biozol-Bioflux- Bioer) استخراج گردید. کیفیت RNA کل با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1درصد و مشاهده باندهایS 18 وS28 مربوط به RNA ریبوزومی و کمیت آن با استفاده از نسبت جذب در طول ‌موج 260 به 280 نانومتر به‌دست ‌آمده از دستگاه نانوفتومتر(IMPLEN-P100) ارزیابی شد. سپس به غلظت 50 نانوگرم در میکرولیتر با استفاده از آب DEPC رقیق شدند. جهت حذف هر­گونه باقی­ماندهDNA  ژنومی در نمونه­های RNA، تیمارDNase I انجام و سپسس اخترشت هاول cDNA بر اساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز(Fermentase- France) با استفاده از 5 میکرولیترRNA تیمار شده با DNase I(غلظت 500 نانوگرم)، 1 میکرولیتر آغازگر الیگو dt(20-18 الیگونوکلئوتید) و 5 میکرولیترآب دپس انجام شد. بدین منظور تیوپ­ها به مدت 5 دقیقه در 70 درجه سانتی­گراد انکوباسیون و به­سرعت روی یخ قرارگرفتند. 4 میکرو لیتر بافر X5 آنزیم نسخه­بردار معکوس، 2 میکرو لیتر dNTP 10 میلی­مولار و 20 واحدآنزیمRNase inhabitor و 5/1 میکرو لیترآبDEPC به مخلوط بالا اضافه شد. تیوپ­ها به مدت 5 دقیقه دردمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور قرار گرفت. بلافاصله 200 واحد آنزیم نسخه­بردار معکوس به هر تیوپ اضافه گردید و به مدت 1 ساعت در دمای 42 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند، سپس تیوپ­ها به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی­گراد انکوبه گردید تا واکنش غیر فعال شود. به هر تیوپ 380 میکرو لیتر آب DEPC اضافه و cDNAهای سنتزشده تا شروع آزمایش­ها در فریزر 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. جهت بررسی بیان ژن­های مربوطه( جدول1) Real time PCR در 3 تکرار بیولوژیکی و 3 تکرار تکنیکی با استفاده از 10 میکرولیتر بافر سایبر گرین، 1 میکرولیتر پرایمر پیش‌رونده و پس‌رونده، 8/2 میکرولیتر آب، 2/0 میکرولیتر آنزیمtag polymerase و 5 میکرولیتر cDNAرقیق‌شده(بر اساس غلظت) صورت گرفت(6). ژن بتا اکتین به­عنوان ژن خانه دار استفاده شد، علت استفاده از ژن بتا اکتین به­عنوان ژن خانه دار ثبات بیان در مطالعات پیشین می­باشد(26). به ‌منظور اطمینان از بهینه بودن شرایط qPCR، سری غلظت­های مختلف(1، 2/1، 5/1، 10/1، 20/1 و 50/1) از نمونه­های cDNA مخلوط از تیمارهای متفاوت از بافت­های مذکور تهیه و با هر دو پرایمر هدف و رفرنس در 3 تکرار تکثیر و منحنی استاندارد جهت تخمین کارایی(E) و تکرارپذیری آزمایش برای هر پرایمر ترسیم شد(6).

 تجزیه و تحلیل آماری

این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی برنامه‌ریزی و اجرا گردید.  Ctبه‌دست ‌آمده برای ژن­های TNF-α₁و IL-1β با استفاده از فرمول2^-ΔΔct (ΔΔCt برابر است با ΔCt ژن هدف منهای ΔCt کالیبراتور) در فضای نرم­افزار اکسل تبدیل به بیان نسبی ژن­های مورد نظر نسبت به ژن رفرنسβ- actin گردید(22). عدد به‌دست‌آمده با استفاده از نرم­افزار اکسل 2010 مرتب و نمودار­های آن رسم گردید.

نتایج

بررسی کیفی RNA

نتایج بررسی کیفی RNA استخراج‌شده از بافت­روده ماهی گورخری در هر نمونه، دو باندS rRNA18 و S28 را با وضوح‌ بالا نشان داد. نسبت شدت جذب در نمونه­های RNA استخراج‌ شده در دو طول‌موج 260 و 280 نانومتر در محدوده 1/2 -8/1 قرار داشت، هم­چنین میزان جذب در طول ‌موج‌های 230، 240 و 320 نیز بیان­گر قابلیت مناسب RNA در نمونه­های موردبررسی بود.

بررسی  cDNA سنتز شده

cDNA سنتز شده با پرایمر -actin β طراحی‌شده برای این‌گونه تست و مشاهده باند در bp216 سنتز صحیحDNA  را تأیید نمود(شکل2).

الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% و رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید. مارکرbp100

نتایج ارزیابی اثرات عصاره گیاه آنغوزه بر تغییرات بیان ژن TNF-αدر شکل 3 آورده شده است. بررسی میزان بیان ژن TNF-α ماهی گورخری تحت تیمارهای آزمایشی حاکی ازافزایش میزان بیان ژن در تیمار تغذیه‌شده با جیره حاوی عصاره آنغوزه در سطح 2% بود که از نظر آماری در مقایسه با سایر گروه­های تغذیه­شده افزایش معناداری را نشان داد(05/0P<)، درحالی‌که اختلاف بین گروه­های دیگر معنی­دار نبود(05/0P>). پیک مشاهده‌شده در منحنی ذوب آغازگر برای هر محصول، بیان­گر وجود یک محصول ویژه و تکثیر اختصاصی است( شکل 4). در این مطالعه تغییرات بیان ژن IL-1β در تیمارهای آزمایشی تغذیه­شده با عصاره گیاه آنغوزه و تیمار شاهد موردبررسی قرار گرفت. شکل 5 نشان­دهنده اثرات عصاره آنغوزه بر میزان بیان ژن IL ماهی گورخری است. همان­طور که در نمودار مشخص است، ازنظر آماری اختلاف معناداری بین بیان ژن IL-1β در تیمارهای تغذیه­شده با عصاره آنغوزه مشاهده نشد(05/0P>). پیک مشاهده‌شده در منحنی ذوب آغازگر برای هر محصول، بیان­گر وجود یک محصول ویژه و تکثیر اختصاصی است( شکل 6).

 

جدول1- اطلاعات مربوط به توالی آغازگرهای استفاده‌شده

 

کاربرد	دمای اتصال (C°)	توالی (´3-´5)		نام پرایمر
سنجش کمی بیان ژن‌های ایمنی	58		CTGCTTCACGCTCCATAAGA	TNF-alfa q-PCRF
			CTGGTCCTGGTCATCTCTCC	TNF-alfa q-PCRR
سنجش کمی بیان ژن‌های ایمنی	58		CGTCTCCACATCTCGTACTCA	IL-1βq-PCRF
			GTGTCTTTCCTGTCCATCTCC	IL-1β q-PCRR
ژن خانه‌دار	58		AGCAGATGTGGATCAGCAAG	β- actin q-PCRF
			TACCTCCCTTTGCCAGTTTC	β- actin q-PCRR

 

بحث  و نتیجه­گیری

در سال‌های اخیر تحقیقات گسترده ای در زمینه استفاده از گیاهان دارویی در جیره غذایی آبزیان جهت افزایش بهره­وری از مواد غذایی و هم چنین بهبود وضعیت رشد و ایمنی این موجودات انجام شده است(13،30، 5). اثرات مثبت گیاه آنغوزه به دلیل دارا بودن ترکیباتی نظیر اسیدگالبانیک، آمبلی­فرون، لیمونن و فلاونوئید(28) در درمان دیابت، کاهش قند خون، افزایش ترشح انسولین در موش­های صحرایی دیابتی(14) و بهبود ایمنی همورال و سلولی در جوجه­های گوشتی(28)، هم چنین اثرات ضدمیکروبی و ضدانگلی)36 (از گیاه آنغوزه نیز گزارش‌شده است. نتایج مطالعه حاضر حاکی از افزایش معنی­دار بیان ژن TNFآلفا در ماهیان گورخری تغذیه­شده با جیره حاوی عصاره گیاه آنغوزه در تیمار 2% نسبت به سایر تیمارها و گروه شاهد می باشد(05/0P<). بااین‌حال در این مطالعه اختلاف معناداری در بیان ژن IL بین تیمارهای آزمایشی و تیمار شاهد مشاهده نشد(05/0P>). نتایج مشابهی در ماهی شانک(Sparus aurata) تغذیه­شده با جیره غذایی حاوی گیاه شنبلیله در بیان ژن TNFآلفاگزارش شد(2). در بررسی اثر جلبک ساپرولینا بر بیان ژن­های ایمنی (TNFα و IL-10)، نتایج حاکی از افزایش بیان ژن TNFα و کاهش بیان ژن IL-10 بود(33).

 

 

 

 

شکل 1- کیفیت RNAاستخراج‌شده از بافت­روده ماهی گورخری روی ژل آگارز 5/1% و رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید در نمونه­های استخراج‌شده دوباند متعلق به SrRNA18 و S28 می­باشند. بررسی کمی RNA(ستون اول از سمت راست مارکر و ستون­های دیگرRNA نمونه­ها از تیمارهای مختلف).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل2- محصول تکثیر cDNAهای سنتز شده با آغازگر-actinβ(bp216) در ماهی گورخری پس از

 

 

شکل 3- سطوح بیان ژن TNF-α در یک دوره 8 هفته­ای در ماهی گورخری تحت تأثیر سطوح مختلف عصاره گیاهی آنغوزه(در هر نمودار حروف متفاوت نشانه معنی­دار بودن در سطح 05/0 است).

 

شکل 5-سطوح بیان ژن IL-1βدر یک دوره 8 هفته­ای در ماهی گورخری تحت تأثیر سطوح مختلف عصاره گیاهی آنغوزه(در نمودار حروف مشابه نشانه عدم معنی­دار بودن است).

 

 

 

شکل4- منحنی ذوب ترسیم‌شده از غلطت­های سریالی برای آغازگر TNF-α

 

 

 

شکل6- منحنی ذوب ترسیم‌شده از غلطت­های سریالی برای آغازگر IL-1β

 

هم چنین در مطالعه چاکرابارتی و همکاران (7) رابطه معکوس بین بیان ژن TNFα و IL-10 در ماهی کاتلا تغذیه­شده با دانه گیاه(Achyranthes aspera) مشاهده شد،چراکه IL-10 به­عنوان یک سایتوکین چندمنظوره می­باشد که یکی از فعالیت­های آن سرکوب عملکرد سیستم ایمنی است(27). یایوان و همکاران(34) در مطالعه­ای بر ماهی کپور معمولی گزارش کردند که افزودن گیاه گون به جیره غذایی سبب افزایش αTNF-وIL-1 شد. هم چنین صفری و همکاران گزارش نمودند که به­کارگیری پودر آنغوزه در جیره غذایی ماهی کپور معمولی(Cyprinus carpio) به مدت 8 هفته سبب افزایش معنادار بیان ژن­های دخیل در ایمنی گردید. آن­ها اعلام نمودند که تیمارهای تغذیه­شده با پودر گیاه آنغوزه در سطوح مختلف(5/0، 1 و 2 درصد) نسبت به گروه شاهد افزایش بیان ژن­های αTNF-،IL-1 ،IL-8 را نشان دادند(26). در مطالعه­ای دیگر بیلن و همکاران گزارش کردند که به‌کارگیری عصاره گیاه(Capparis spinosa) در جیره غذایی ماهی قزل­آلای رنگین­کمان سبب افزایش رونویسی ژن­های سایتوکین ازجمله αTNF- و IL-1 و درنتیجه بهبود پاسخ ایمنی شد(4). سیتوکین­های پیش­التهابی مانند IL-8 و TNFآلفا در شروع و تقویت فرآیندهای التهابی در ماهی دخالت دارند(15). عصاره آنغوزه نیز به دلیل دارا بـودن متابولیت­های ثانویه دارای توانایی کاهش رادیکـال­هـای آزاد و تقویت سیستم ایمنی هستند. درمجموع نتایج حاصل از این مطالعه حاکی ازآن است که عصاره گیاهی آنغوزه به منظور افزایش ایمنی غیراختصاصی و به­عنوان تحریک­کننده سیستم ایمنی در برابر عوامل بیماری­زا می­تواند در جیره غذایی ماهی سودمند باشد. بنابراین استفاده از عصاره این گیاه، یک راه­کار مفید برای استفاده درمانی آن به جهت پیش­گیری از بیماری­ها و جلوگیری از تلفات ماهی توصیه می­شود، چراکه افزایش ایمنی ذاتی از طریق کاهش احتمالی بیماری می­تواند اثرات مثبتی را به همراه داشته باشد. هرچند مطالعات بیشتری در خصوص میزان دوز مصرفی، روش استحصال عصاره و تعیین استاندارد تغذیه­ای مورد نیاز می­باشد.

مراجع

1.Awad, E., Mitchell, W. J.,Austin, B. (2011). Effect of dietary supplements on cytokine gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of fish diseases, 34; 629-634.

2.Awad, E., erezuel, R.,Esteban, M.A. (2015). Effects of fenugreek (Trigonella foenumgraecum) on gilthead seabream (Sparus aurata L). Immune Status And Growth performance, 45(2); 454-464.

3.Bairwa, M.K., Jakhar, K., Satyanarayana Y., Reddy D. (2012). Animal andplant originated immunostimulants used in aquaculture. Journal of Natural Product and Plant Resources, 2(3); 397-400.

4.Bilen, S., Altunoglu, Y.C., Ulu, F., Biswas, G. (2016). Innate immune and growth promoting responses to caper (Capparis spinosa) extract in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish and Shellfish Immunology, 57; 206-212.

5.Brudeseth, B.E., Wiulsrod, R., Fredriksen, B.N., Lindmo, K., Lokling, K.E., Bordevik,M. (2013). Status and future perspectives of vaccines for industrialised fin-fish farming. Fish and Shellfish immunology, 35; 1759-1768.

6.Bustin, A.S., Benes, V., Garson, J.A., Healmans, J., Huggett, J., Kubista, M. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time pcr expriments. Clinical Chemistry, 55(4); 611-622.

7.Chakrabarti, R., Srivastava, P.K., Verma, N., Sharma, J. (2014). Effect of seeds of Achyranthes aspera on the immune responses and expression of some immune-related genes in carp (Catla catla). Fish and Shellfish Immunology, 41; 64-69.

8.Chobkar, N. (2015). Effect of using Falcaria vulgaris on skin wound healing and immune response of common carp (Cyprinus carpio). Journal of Endocrinology and Veterinary Clinic, 9(1); 1-9.

9.Citarasu, T., Sivaram, V., Immanuel, G., Rout, N., Murugan, V. (2006). Influence of selected Indian immunostimulat herbs against white spot syndrome virus(WSSV) infection in black tiger shrimp,(Penaeus monodon) with reference to haematological, biochemical and immunological changes. Fish and shellfish immunology, 21; 372-384.

10.Corripio-Miyar, Y., Bird S., Tsamopoulos, K., Secombes, C.J. (2007). Cloning and expression analysis of two pro-inflammatory cytokines, IL-1ß and IL-8, in haddock (Melanogrammus aeglefinus). Molecular Immunology, 44; 1361-1373.

11.Dorman, H.J.D., Bachmayer, O., Kosar, M., Hiltunen, R. (2004). Antioxidant properties of aqueous extracts from selected Lamiaceae species grown in Turkey. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(4); 762–770.

12.Elabd, H., Wang, H.P., Shaheen, A., Yao H., Abbass, A. (2016). Feeding(Glycyrrhiza glabra) (liquorice) and(Astragalus membranaceus)(AM) alters innate immune and physiological responses in yellow perch(Perca flavescens). Fish and Shellfish Immunology, 54; 374-384.

13.Faggio, C., Morabito, S.A., Minicante, G.L., Piano, M., Pagano, G., Genovese, G. (2015). Potential use of polysaccharides from the brown algea(Undaria pinnatifida) as anticoagulants, Braz. Brazilian Archives of Biology and Technology, 58; 798-804.

14.Fateh, M., Farifteh, F., Fatehi-Hassanabad, Z. (2004). Antispasmodic and hypotensive effects of Ferula asafoetida gum extract. Journal of Ethnopharmacology, 91; 321–324.

15.Feng, L., Li, W., Liu, Y., Jiang, W.D., Kuang, S.K., Jiang J. (2015). Dietary phenylalanine-improved Intestin albarrier health in young grass carp(Ctenopharyn godonidella) is associated with increased immunestatus and regulated geneexpression of cytokines, tight junction proteins, Antioxidant enzymes and related signaling Q4 molecules. Fish and Shellfish Immunology, 45 (2); 495-509.

16.Grayfer. L., Walsh, J. G., Belosevic, M. (2008). Characterization and functional analysis of goldfish (Carassius auratus L) tumor necrosis factor-alpha. Developmental and Comparative Immunology, 32; 532-543.

17.Gruss, H.J. (1996). Molecular, structural, and biological characteristics of the tumor necrosis factor ligand superfamily. International Journal of Clinical and Laboratory Research, 26; 143-159.

18.Guardiola, F.A., Porcino, C., Cerezuela, R., Cuesta, A., Faggio, C., Esteban, M.A. (2016). Impact of date palm fruits extracts and probiotic, enriched diet on antioxidant status, innate immune response, and immune-related gene expression of European seabass (Dicentrarchus labrax). Fish and Shellfish Immunology, 52; 298-308.

19.Harikrishnan, R., Balasundaram, C., Heo, M.S. (2011). Diet enriched with mushroom Phellinus linteus extract enhances the growth, innate immune response, and disease resistance of kelp grouper,(Epinephelus bruneus) against vibriosis. Fish and Shellfish Immunology, 30; 128-134.

20.Hoseinifar, S H, Khalili, M, Rufchaei, R, Raeisi, M. (2016). Investigating the effects of date palm extract on growth performance and mucus immune parameters in Common Carp Cyprinus carpio Linnaeus, 1758 fingerlings. Journal of Academia and Industrial Research, 3(4); 89-100.

21.Lessman, Ch.A. (2011). The developing zebrafish(Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews, 93(3); 268-280.

22.Livak, K. J., Schmittgen, T. D. (2001). Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods, 25; 402-408.

23.Pourgholam, R., Sharif Rohani, M., Safari, R., Saeeidi, A., Binaeei M., Najafeyan R. (2013). Effect of Echinacea purpurea extract on the immune system of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and its resistance to Streptococcusis. Journals & Diaries - Personality Cafe, 22 (3); 1-12.

24.Rahbarian, R., Sadooghi, S.D. (2014). Investigating the effects of aqueous extract of Asafoetida resin on the serum level of insulin and blood glucose in type 1 diabetic rats. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences, 16 (3); 16 - 21.

25.Reverter, M., Bontemps, N., Lecchini, D., Banaigs, B., Sasal, P. (2014). Use of plant extracts in fish aquaculture as an alternative to chemotherapy: Current status and future perspectives. Aquaculture, 433; 50-61.

26.Safari, R., Hoseinifar, S.H., Nezhadmoghadam, S., Jafar, A. (2016). Transciptomic study of mucosal immune, antioxidant and growth related genes and non-specific immune response of common carp(Cyprinus carpio) fed dietary Ferula (Ferula assafoetida). Fish and Shellfish Immunology, 55; 242-248.

27.Savan, R., Igawa, D.,Sakai, M. (2003). Cloning, characterization and expression analysisof interleukin-10 from the common carp, (Cyprinus carpio L). European Journal of Biochemistry, 270; 4647-4654.

28.Shademani, M., Bagherzadeh Kasmani, F., Mirzaee, H.R., Mehri, H.R. (2015). Effect of Stikun gassa(Ferulaa assafoetida) powder on performance, immunitystatus and cecal microbial population of broiler chickens. Iranian Journal of Applied Animal Science; 111-118.

29.Shin, J.T., Fishman, M.C. (2002). From zebrafish to human: modular medical models. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 3; 311–40.

30.Sitja-Bobadilla, A. (2008). Living off a fish: a trade-off between parasites and the immune system. Fish and Shellfish Immunology, 25; 358-372.

31.Taplur, A.D., Ikhwanuddin, M. (2012). Dietary effects of garlic(Allium sativum) on haemato-immunological parameters, survival, growth and disease resistance against Vibrio harveyi infection in Asian sea bass, Lates calcarifer (Bloch). Aquaculture, 364-356.

32.Wang, Q.K., Chen, C.X., Guo, Y.J., Zhao, H.Y., Sun, J.F., Ma, S. (2011).
Dietary polysaccharide from(Angelica sinensis) enhanced cellular defence responses
and disease resistance of grouper(Epinephelus malabaricus). Aquaculture International,
19; 945–956.

33.Watanuki, H., Ota, K., Tassakka, A.C.M., Kato, T.,Masahiro, S. (2006). Immuno stimulant effects of dietary Spirulina platensis on carp, (Cyprinus carpio). Aquaculture, 258; 157-163.

34.Yuan, C., Pan, X., Gong, Y., Xia, A., Wu, G., Tang, J. (2008). Effects of astragalus poly saccharides (APS) on the expression of immune response genes in headkidney, gill and spleen of the common carp,(Cyprinus carpio L). Immunopharmacology, 8(1); 51-58.

35.Zamani Taghizadeh Rabe, Sh., Iranshahi, M., Mahmoudi, M. (2016). In vitro anti inflammatory and immune modulatory properties of umbelliprenin and methyl galbanate. Journal of Immunotoxicology, 13 (2); 209-216.

36.Zare, A.R.A., Omidi, M., Fallah Hoseini, H., Yazdani, D., Rezazadeh, S., Irvani, N. (2011). A review on pharmacological effects of Ferula assa foetida L.: a systematic review. Journal of Manufacturing Processes, 4 (40); 17-25.