بررسی اثر افزودن خوراکی ایزومالتو الیگوساکارید در آسیب بافتی ماهی کپور معمولی(Cyprinus carpio) در مواجهه با حشره‌کش ورتیمک

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 8، دوره 11، شماره 4 - شماره پیاپی 43، آبان 1397، صفحه 87-99   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

سید علی هدایتی؛ فاطمه دارابی تبار^*

گروه شیلات، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: پربیوتیک ها ترکیب غذایی غیر قابل هضمی هستند که از طریق تحریک انتخابی، رشد و فعال کردن یک یا تعداد محددی از باکتری‏های موجود در روده اثرات سودمندی بر روی میزبان داشته و می‏تواند سلامتی میزبان را بهبود بخشد. برایارزیابیمیزانسمیتآلاینده­هایمحیطیشاخص­هایفیزیولوژیکیمتفاوتیدرماهی­هاوجودداردکهازجملهآن­هابافت شناسیاست.
روش کار: در این تحقیق 147 قطعه ماهی کپور معمولی به مدت دو هفته جهت سازگاری با شرایط محیطی آکواریوم، نگهداری شدند. LC50/96h برای سم ورتیمک(ورتمیک) 243/1 محاسبه گردید که براساس آن سه غلظت کشنده ppm2، ppm3، ppm6 برای این بررسی در نظر گرفته شد. اضافه کردن پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید به غذا با روش اسپری کردن به میزان g/kg1 صورت گرفت. طی دوره تحت تأثیر قرار دادن ماهیان در معرض پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید و سم ورتیمک، ماهیان توسط 220 میلی­گرم بر لیتر محلول بیهوش کننده گل میخک به سرعت بیهوش شده و بافت کبد، آبشش آن­ها برای مطالعات بافت­شناسی جدا گردید.
 یافته ها: نتایج نشان داد تیمارهایی که بعد از القای پربیوتیک در معرض سم ورتیمک قرار گرفتند عارضه­های بافتی شامل از بین رفتن سلول­های کبدی، پرخونی، نکروز و کاریولیز هسته در بافت کبد و عارضه های هایپرپلازی تیغه اولیه، پرخونی، نکروز، چسبندگی تیغه­های ثانویه، در بافت آبشش مشاهده شد که عارضه­ها به ترتیب در غلظت ppm6، ppm 3 و ppm 2بیشترین اثر تخریب را در بافت کبد و آبشش نشان دادند.
نتیجه گیری: پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید نتوانست از میزان عارضه­های ناشی از آسیب بافتی سم ورتیمک در بافت کبد و آبشش ماهی کپور بکاهد.

کلیدواژه‌ها

ایزومالتو الیگوساکارید؛ آسیب‌های بافتی؛ سم ورتیمک؛ کپور معمولی

اصل مقاله

واژه های کلیدی: ایزومالتو الیگوساکارید، آسیب­های بافتی، سم ورتیمک، کپور معمولی.

 

مقدمه

 

استفاده از سموم آفت کش تا زمانی که شیوه های مبارزه بیولوژیک با آفات گیاهی مرسوم نشود امری اجتناب ناپذیر است بنابراین توصیه بر این است که حداقل از آفت کش هایی با درجه سمیت و نیمه عمر کم­تر استفاده شود. اکوسیستم های آبی به عنوان بزرگ­ترین بخش محیط طبیعی همواره با تهدیدهایی مانند محدودیت ژنتیکی و تنوع زیستی مواجه می باشد. چنین محیط هایی گرچه به عنوان محیط هدف و اثر برای سموم آفت کش مد نظر نمی­باشند(16). آفت کش ها از دو طریق وارد منابع آبی می شوند که یکی از طریق کاربرد مستقیم آفت کش ها در اکوسیستم های آبی و دیگری در اثر استفاده غیرمستقیم مانند ریزش اتمسفری و فرسایش به دست آمده از زمین های کشاورزی و هم چنین نفوذ فاضلاب های صنعتی و کشاورزی است که به منابع آبی راه می یابند(19). یکی از عوامل تأثیرگذار در مسمومیت آبزیان عامل زمان است. هنگامی که ماهی در معرض غلظت ثابتی از سم باشد، به مرور زمان هم مقاومت ماهی تحلیل می رود و هم سم فرصت بیشتری برای تأثیر گذاری روی ماهی دارد. علاوه بر این در مواردی تجمع سم در بافت های ماهی نیز باعث افزایش تأثیر سوء آن بر بدن ماهی و در مدت 96 ساعت انجام آزمایشات موجب پایین آمدن سیستم ایمنی بدن ماهی می­شود. آبشش ها به عنوان ارگانی که در معرض مداوم محیط خارجی قرار دارند، اولین هدف آلاینده ها می­باشند، بنابراین آبشش بافت مناسبی جهت بررسی اثر کوتاه مدت آلاینده ها است. از طرفی این عناصر سمی در اندام ها ذخیره م و تجمع زیستی رخ می دهد(18). اغلب پربیوتیک‏ها در دسته‏ی الیگوساکاریدهای غیرقابل هضم تقسیم‏بندی می‏شوند. الیگوساکاریدهای غیرقابل هضم از جمله عواملی هستند که قابلیت تحریک رشد باکتری‏های مفید روده یا همان باکتری‏های پروبیوتیکی را دارا هستند. ایزومالتو الیگوساکارید یکی از انواع الیگوساکاریدها است که اخیراً به­عنوان پربیوتیک در آبزی­پروری مطرح می گردد. در یک نگاه کلی، اغلب پربیوتیک‏ها در دسته‏ی الیگوساکاریدهای غیرقابل هضم تقسیم‏بندی می‏شوند و همان طور که گفته شد، الیگوساکاریدهای غیرقابل هضم از جمله عواملی هستند که قابلیت تحریک رشد باکتری‏های مفید روده یا همان باکتری‏های پروبیوتیکی را دارا هستند. الیگوساکاریدهای غیرقابل هضم به دلیل ساختار شیمیایی خاص، در قسمت‏های بالایی دستگاه گوارش در برابر فرآیند گوارش مقاومت کرده و پس از رسیدن به بخش‏های انتهایی دستگاه گوارش برخی از آن ها طی فرآیند تخمیر به مونومرها هیدرولیز شده و توسط برخی باکتری‏ها متابولیزه و مورد استفاده واقع می‏شوند. هر ساله ترکیبات فعال دارویی تولید می­شوند که استفاده از آن­ها در مقیاس و تنوع بسیار بالا در حال افزایش است(12). داروها به طور مداوم در نتیجه فعالیت­های دامپزشکی در محیط زیست و در محیط آبی پراکنده می­شوند. که این مسئله باعث نگرانی­های زیست محیطی شده است. آفتکش ورتیمک یا آبامکتین در بازار با نام تجاری (Vertimec EC1.8%) وجود دارد. ورتیمک(آبامکتین) از گروه شیمیایی آورمکتین(Avermectin) و با منشا میکروبی بوده که از تخمیر یک اکتینومیست به­نام Strepromyces avermitilisبه دست آمده است. این سم دارای اثر تماسی و گوارش است که فعالیت سیستمیکی محدودی داشته و قادر است در حشره­ها نفوذ کند. این ترکیب از لحاظ آفت­کشی تاثیر آهسته ای داشته، اما اثر فلج کنندگی آن ها به سرعت بروز می­نماید. برای ارزیابی میزان سمیت آلاینده­های محیطی شاخص­های فیزیولوژیکی متفاوتی در ماهی­ها وجود دارد که از جمله آن­ها بافت شناسی است. بافت شناسی ارزیابی کاملی از سلامتی موجود زنده فراهم می­کند و به طور مؤثری اثرات مواجهه با آلاینده های محیطی را انعکاس می­دهد. با توجه به ماهیت اغلب سموم و آلاینده­های زیست محیطی، این ترکیبات به راحتی از سد دفاعی بدن آبزیان گذشته و وارد خون می­شوند و از طریق خون به بافت­های مختلف بدن انتقال می­یابند(27). پربیوتیک­ها به عنوان منبع غذایی برای پروبیوتیک­ها (بیفیدوباکترها، لاکتوباسیلوس­ها و باکتروئیدها) محسوب می­شوند. در نتیجه­ی استفاده­ی باکتری­های پروبیوتیکی از پربیوتیک­ها و تولید محصولات تخمیری از آن ها، اسیدهای چرب آزاد کوتاه زنجیره مانند استات، بوتیرات و پروپیونات و لاکتات تولید می­گردند(15). مهم­ترین فرآورده­ی حاصل از متابولیسم پربیوتیک­ها، اسیدهای چرب آزاد کوتاه زنجیره هستند(14) که از طریق اپیتلیوم روده جذب و به عنوان یک منبع انرژی مهم برای میزبان تلقی شده و سبب تقویت انتروسیت­ها و بهبود جذب مواد مغذی می­شوند(1). به علاوه، اسیدهای چرب کوتاه زنجیره و اسید لاکتیک در روده با ایجاد محیط اسیدی باعث محدود کردن جمعیت پاتوژن­ها خواهند شد(15) و شرایط مناسبی برای رشد باکتری­های اسید لاکتیک(ازجمله بیفیدوباکترها) را فراهم می­کند(اشلی و فیلد، 2002). هم­چنین باکتری­های اسید لاکتیک ترکیباتی مانند باکتریوسین­ها را تولید می­کنند و بدین طریق باعث جلوگیری از رشد میکروارگانیسم­های بیماری­زا در روده می­شوند(1) و با تحریک سیستم ایمنی سبب افزایش مقاومت میزبان در برابر عوامل بیماری­زا می­گردند(11). مطالعه پارامترهای هیستوپاتولوژیک به عنوان بیومارکرهای(نشانگر زیستی یا بیومارکرها عموماً به یک شاخص قابل سنجش از برخی حالت‌ها و شرایط بیولوژیک یا زیستی اشاره دارد، زیست‏‌نشان گرها اغلب در بررسی فرآیندهای طبیعی زیستی، فرایندهای پاتوژن و یا پاسخ دارویی به یک درمان ویژه ارزیابی می‌شوند(26)، از جمله مهم ترین شاخص های زیستی شاخص­های خون شناسی، بیوشیمیایی، هورمونی و بافتی است. هرچند ماهی معمولاً جزو ارگانیسم­های هدف برای آفتکش­ها نیست و دانش درباره تاثیرات آفتکش­ها در محیط طبیعی هنوز اندک است. تنها مطالعات اندکی نشان می­دهد که ماهیانی که در محیط­های طبیعی آب شیرین زندگی می­کنند ممکن است تحت تاثیر سمپاشی­های غیرعمدی قرار بگیرند(9). کپور معمولی(Cyprinus carpio) از رده­ی ماهیان استخوانی و متعلق به خانواده­ی کپورماهیان(Cyprinidae) است؛ در حوضه­های دریای خزر، رودخانه­ی تجن و تمام حوضه­های آبریز ایران پراکنش دارد(4). هم چنین با توجه به اثرات مثبت پروبیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید بر بهبود ایمنی ناشی از اثرات سمیت ورتیمک بر عملکرد بافتی، افزایش رشد و شاخص­های رشد و برخی از شاخص­های زیستی آبزیان نظیر شاخص­های خون شناسی و بافتی، در این مطالعه به منظور بررسی اثرات افزایش سیستم ایمنی(بهبود عملکرد دفاع هیستوپاتولوژیک) و مواجهه بافتی پروبیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید بر بافت کبد، آبشش و روده ماهی کپور معمولی در غلظت­های کشنده سم، اثر افزایش مقاومت ماهی کپور معمولی تغذیه شده با پربیوتیک به منظور کاهش آسیب بافتی ناشی از سم ورتیمک پرداخته می­شود.

مواد و روش­ها

در این تحقیق 147 قطعه ماهی کپور به مدت دو هفته جهت سازگاری با شرایط محیطی آکواریوم، نگهداری شدند. 12 آکواریوم 100 لیتری که در هر کدام 7 عدد ماهی قرار داده شده در سالن آبزی پروری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای انجام طرح در نظر گرفته شد. به منظور اطمینان از زنده ماندن تعداد ماهیان مورد نیاز تا پایان مواجهه باسم، ماهیان اضافی تا پایان آزمایش نگهداری شدند. بعد از ضدعفونی و آماده‌سازی آکواریوم‌ها، آبگیری آن‌ها صورت گرفت. در طول دوره‌ی آزمایش فاکتورهای فیزیکوشیمیایی آب در تمام تیمارها ثابت در نظر گرفته شد. در این مطالعه از غذای تجاری( انرژی 3001، ماهیران، ایران) به عنوان جیره­ی پایه برای گروه شاهد استفاده شد. ترکیبات تقریبی جیره استفاده شده شامل 41 درصد پروتئین، 6 درصد چربی، 5 درصد فیبر خام و 12 درصد رطوبت بود. پربیوتیک مورد استفاده در این تحقیق ایزومالتو الیگوساکارید بود که از کارخانه اورافتی بلژیک تامین شد. این پربیوتیک عمدتاً شامل، ایزومالتوز، پانوز، ایزومالتوتریوز، ایزومالتوتترائوز است. و طی فرآیندهای آنزیمی از نشاسته به دست آمده است(تیتارام و همکاران، 2005). رنگ این ماده سفید مات و به شکل بلورهای ریز و فاقد بو می باشد. اضافه کردن پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید به غذا با روش اسپری کردن به میزان g/kg1 صورت گرفت، به این صورت که ابتدا میزان 2 گرم پودر ژلاتین را به آب اضافه کرده و پس از حل شدن پودر در آب مقادیر مورد نیاز پربیوتیک را که از قبل توزین و آماده شده بود، به محلول آب و پودر ژله اضافه شد. در نهایت پس از حل شدن پربیوتیک، محلول آماده شده بر غذای تجاری اسپری شد. غذادهی به بچه ماهی­ها به صورت دستی به میزان 3 درصد وزن بدن و 3 وعده در روز صورت پذیرفت. ثبت تلفات به صورت روزانه طی مدت 96 ساعت انجام شد و بعد از ثبت تلفات، اقدام به تعیینLC₁₀, LC₂₀, LC₃₀, LC₄₀, LC₅₀, LC₆₀, LC₇₀, LC₈₀, LC₉₀, LC₉₅ در 24، 48، 72 و 96 ساعت با استفاده از نرم افزار پروبیت گردید که در نهایت میزان LC_50/96h، 24/1 میلی­گرم بر لیتر محاسبه شد که براساس آن سه غلظت کشنده ppm2، ppm3، ppm6 برای این بررسی در مدت 96 ساعت در نظر گرفته شد. هر یک از غلظت‌های ورتیمک در سه تکرار ایجاد گردید.طی دوره تحت تأثیر قرار دادن ماهیان در معرض پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید در دوره 8 هفته ای و سم ورتیمک در دوره 4 روزه (4 غلظت0، 2، 3 و 6 میلی گرم بر لیتر)، ماهیان توسط 220 میلی­گرم بر لیتر محلول بیهوش کننده گل میخک به سرعت بیهوش شده و بافت کبد، آبشش آن­ها برای مطالعات بافت­شناسی جدا گردید. نمونه ها ابتدا به مدت 24 ساعت در محلول بوئن تثبیت شدند. سپس چندین مرتبه با الکل اتانول 70 درصد مورد شستشو قرار گرفتند. پس از آن توسط الکل 95 و 100 و نهایتاً توسط الکل بوتانول آبگیری و پس از قرار دادن نمونه ها در گزیلول به مدت سه ساعت به منظور شفاف سازی، برای پارافینه کردن در پارافین مایع در داخل آون قرار داده ، سپس با پارافین قالب گیری شدند. از بافت ها برش هایی به ضخامت 5-6 میکرومتر تهیه شد. پس از نگهداری به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه آون به روش استاندارد هماتوکسیلین ائوزین رنگ آمیزی صورت گرفت. در نهایت به منظور بررسی عوارض بافتی ناشی از اثر سم و مقایسه بافت های مورد نظر با نمونه های شاهد از میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین عکس برداری استفاده گردید(17).

نتایج

ثبت تلفات به صورت روزانه طی مدت 96 ساعت انجام شد(جدول 1) و بعد از ثبت تلفات، اقدام به تعیینLC₁₀, LC₂₀, LC₃₀, LC₄₀, LC₅₀, LC₆₀, LC₇₀, LC₈₀, LC₉₀, LC₉₅ در 24، 48، 72 و 96 ساعت با استفاده از نرم افزار پروبیت گردید. که در نهایت میزان LC50/96h، 24/1 میلی­گرم بر لیتر محاسبه شد(جدول 2تا5). در طول دوره آزمایش در هیچ یک از تیمارهای آزمایشی و گروه کنترل مرگ و میر مشاهده نگردید. بررسی­های بافت­شناسی ماهیان که در معرض پربیوتیک و ورتیمک قرار داشتند، نشان دهنده بروز ناهنجاری­های ساختاری در بافت آبشش بود(شکل 1). بیشترین عارضه­های مشاهده شده در بافت آبشش ماهی کپور معمولی شامل هایپرپلازی تیغه اولیه، پرخونی، نکروز، چسبندگی تیغه­های ثانویه، چماقی شدن تیغه­های ثانویه، از بین رفتن لاملاهای ثانویه، کوتاه شدن و خمیدگی لاملاهای ثانویه بود. که بیشترین اثر تخریب در غلظت ppm 6 با عارضه­هایی نظیر از بین رفتن و خمیدگی تیغه­های ثانویه و نکروز بود. که این عارضه­ها در غلظت ppm2 با اثر تخریب کمتری مشاهده شد. بیشترین عارضه­های مشاهده شده در بافت آبشش ماهی کپور معمولی شامل هایپرپلازی تیغه اولیه، پرخونی، نکروز، چسبندگی تیغه­های ثانویه، چماقی شدن تیغه­های ثانویه، از بین رفتن لاملاهای ثانویه، کوتاه شدن و خمیدگی لاملاهای ثانویه بود. که بیشترین اثر تخریب در غلظت ppm 6 با عارضه­هایی نظیر از بین رفتن و خمیدگی تیغه­های ثانویه و نکروز بود. که این عارضه­ها در غلظت ppm 2با اثر تخریب کمتری مشاهده شد(جدول 6). بیشترین عارضه­های مشاهده شده در بافت کبد شامل از بین رفتن سلول­های کبدی، پرخونی، نکروز و کاریولیز هسته بود. که شدت این عارضه­ها در هر دو غلظت ppm 3 و ppm 6 مشاهده شد. رکود صفراوی تنها در غلظت ppm 3 مشاهده شد(شکل 2).

 

 

 

جدول1- میزان مرگ و میردر تست سمیت حاد(LC₅₀ 96h)(تعداد در هر تیمار=21 عدد)

غلظت mg/l))	24 ساعت	48 ساعت	72 ساعت	96 ساعت
شاهد	0	0	0	0
1	0	0	8	12
2	2	9	15	16
3	7	11	17	20
6	9	13	15	21
12	15	17	21	21
15	17	18	21	21

 

جدول2- غلظت کشنده (LC_10-95) با حدود اطمینان 95 % در طی زمان 24 ساعت

LC	غلظت کشنده	حدود اطمینان 95%
		حد پایین	حد بالا
LC10	303/1	-	178/4
LC20	825/3	-	449/6
LC30	645/5	247/2	447/8
LC40	199/7	360/4	523/10
LC50	652/8	017/6	779/12
LC60	105/10	439/7	271/15
LC70	659/11	790/8	107/18
LC80	478/13	241/10	558/21
LC90	001/16	125/12	470/26
LC95	084/18	620/13	588/30

جدول3- غلظت کشنده (LC_10-95) با حدود اطمینان 95 % در طی زمان 48 ساعت

LC	غلظت کشنده	حدود اطمینان 95%
		حد پایین	حد بالا
LC10	-	-	388/2
LC20	795/0	-	589/4
LC30	780/2	-	745/6
LC40	476/4	-	588/9
LC50	061/6	174/1	753/13
LC60	647/7	713/3	329/19
LC70	343/9	562/5	161/26
LC80	328/11	229/7	654/34
LC90	081/14	179/9	795/46
LC95	354/16	650/10	960/56

 

 

 

 

 

 

جدول4- غلظت کشنده(LC_10-95) با حدود اطمینان 95 % در طی زمان 72 ساعت

LC	غلظت کشنده	حدود اطمینان 95%
		حد پایین	حد بالا
LC10	-	-	801/0
LC20	123/0	-	450/1
LC30	768/0	-	036/2
LC40	319/1	-	749/2
LC50	834/1	-	849/3
LC60	349/2	753/0	637/5
LC70	900/2	605/1	157/8
LC80	545/3	253/2	454/11
LC90	440/4	933/2	246/16
LC95	179/5	422/3	277/20

 

جدول5- غلظت کشنده (LC_10-95) با حدود اطمینان 95 % در طی زمان 96 ساعت

LC	غلظت کشنده	حدود اطمینان 95%
		حد پایین	حد بالا
LC10	086/0	-	514/0
LC20	483/0	-	841/0
LC30	769/0	280/0	092/1
LC40	014/1	607/0	323/1
LC50	243/1	893/0	559/1
LC60	472/1	155/1	820/1
LC70	716/1	407/1	127/2
LC80	003/2	675/1	513/2
LC90	400/2	015/2	080/3
LC95	728/2	281/2	564/3

 

جدول 6- اثر پروبیوتیک بر تخریب بافت آبشش ناشی از غلظت­های کشنده آبامکتین

عارضه­های آبشش	0	ppm2	ppm3	ppm6
هایپرپلازی تیغه اولیه	-	++	++	+++
پرخونی	-	++	++	++
نکروز چسبندگی تیغه­های ثانویه	- -	+++ ++	+++ +++	++++ ++
چماقی شدن تیغه ثانویه	-	++	++	++
از بین رفتن لاملاهای ثانویه	-	+++	+++	++++
کوتاه شدن لاملاهای ثانویه	-	++	+++	++
خمیدگی تیغه ثانویه	-	+++	++++	++++

عدم مشاهده عارضه(- )، 1 تا 3 عارضه مشاهده شده (+ )، 3 تا 5 عارضه مشاهده شده (++)، 5 تا 11 عارضه مشاهده شده (+++)، و بیشتر از 11 (++++).

 

 

شکل 1- بررسی اثر پروبیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید بر تخریب بافت آبشش ماهی کپور معمولی ناشی از غلظت­های کشنده آبامکتین با بزرگنمایی 200 برابر

A= غلظت 2ppm سم آبامکتین، B= غلظت 3 ppm سم آبامکتین، C= غلظت 6 ppm سم آبامکتین

چسبندگی لاملای ثانویه (a)، پرخونی (b)، از بین رفتن لاملاهای ثانویه (e)، چماقی شدن تیغه­های ثانویه (f)، خمیدگی تیغه ثانویه (h)، از بین رفتن لاملای اولیه (i)، هایپرپلازی لاملاهای اولیه (j)، نکروز (n)، کوتاه شدن لاملای ثانویه (k)

 

 

 

شکل 2- بررسی اثر پربیوتیک ایزومالتوالیگوساکارید بر تخریب بافت کبد ماهی کپور معمولی ناشی از غلظت­های کشنده ورتیمک با بزرگنمایی 200 برابر

A= غلظت 2ppm سم ورتمیک، B= غلظت 3 ppm سم ورتمیک، C= غلظت 6 ppm سم ورتیمک، D= تیمار شاهد

پرخونی (b)، نکروز (n)، سیاهرگ باب کبدی (q)، از بین رفتن سلول­های کبدی (r)، کاریولیز هسته (تخریب هسته سلول) (t)، رکود صفرا (v)، تورم صفراوی

 

 

بحث و نتیجه گیری

در ماهیان تحت تیمار سم ورتیمک، هایپرپلازی تیغه ثانویه، چسبندگی لاملاهای ثانویه، ادم و جداشدگی اپی­تلیوم(ادم منتشر در لاملای ثانویه) مشاهده شد، که شدت این عوارض در تیمار 6 ppm افزایش یافت. افزایش عوارض بافتی مشاهده شده در برابر سموم مختلف در مطالعات پیشین به اثبات رسیده است(12، 10، 9). هیپرپلازی افزایشی غیرطبیعی در تعداد سلول­های اپی‌تلیوم آبشش است. این عارضه بر تبادل گاز و تنفس تاثیر گذاشته و در حالات شدیدتر می‌تواند منجر به اتصال تیغه‌های مجاور به یکدیگر و جلوگیری از تبادل گاز شود. سلول­های هیپرتروفی و برآمدگی­های بسیار ریز سلول­های پوشش سطحی، اولین علائم اثرات فیزیکی و شیمیایی بر تیغه­های ثانویه هستند. گرزی­شکل بودن تیغه­ها خود دلیلی بر تغییرات مزمن در آبشش­ها است(5). تغییرات آبشش ماهیان قرار گرفته در معرض غلظت کشنده 6ppm ورتیمک پس از گذشت 96 ساعت شامل ادم، پرخونی، نکروز، چسبندگی تیغه­های ثانویه، چماقی شدن تیغه ثانویه، از بین رفتن لاملاهای ثانویه، بود. که نتایج نشان داد با افزایش زمان غلظت میزان آسیب بافتی نیز بیشتر خواهد بود. Caliskan و همکاران در سال 2003 بلند شدن لایه اپیتلیال لاملای آبشش، هایپرپلازی، کوتاه شدن تیغه های ثانویه و نکروز در آبشش ماهی Lebistes reticulates قرار گرفته در معرض سایپرمترین را گزارش کردند. اتصال تیغه‌های ثانویه‌ی مجاور پس از هیپرپلازی، بیش­ترین عارضه­ی مشاهده شده بود. در این عارضه اپی­تلیوم دو تیغه­ی ثانویه مجاور به­واسطه هیپرپلازی و یا برآمدگی و در برخی موارد هیپرتروفی اپی­تلیوم به­هم اتصال می‌یابد و موجب توقف تبادل گاز از طریق سطوح مربوطه می‌شود.

 ادم: ادم در آبشش ماهیان به حالتی اطلاق می­شود که لایه اپیتلوم از سطح لاملاهای ثانویه جدا می­شود. در این حالت بین اپی­تلیوم و عروق خونی فاصله می­افتد در حقیقت این واکنش یک عمل دفاعی بوده و به این طریق ماهی سعی می­کند تا از مسمومیت بیش­تر در امان بماند که در تیمارهای 2، 3 و 6 ppm این عارضه مشاهده شد ولی با افزایش غلظت سم این عارضه نیز بیش­تر مشاهده شد(5).

تورم سلولی: در این حالت سلول­ها متورم شده و سیتوپلاسم آن بسته به­ نوع تورم آبکی یا ابری شکل، شفاف و صاف یا ابری شکل و دانه­دار می­گردد. دانه­ها ممکن است ریز یا درشت و تقریباً به شکل قطرات هیالینی و ائوزینوفیلی در سیتوپلاسم ظاهر گردند. تورم سلولی ممکن است به علت ناتوانی سلول در حفظ تعادل یون سدیم باشد.

تورم کبد: در این عارضه تعداد زیادی لنفوسیت و لکوسیت در اطراف رگ­های خونی کبد دیده می­شود. تغییرات دژنراتیو مانند هیدروپسی، تورم ابری و نکروز در اطراف سلول­های کبدی متورم قابل تشخیص است. با پیشرفت تورم کبدی بافت هم­بند نواحی آسیب دیده، شروع به رشد می­کند.

خون­ریزی: عبارت است از خروج خون از رگ­های خونی(5). در طول دوره آزمایش در هیچ یک از تیمارهای آزمایشی و گروه کنترل مرگ و میر مشاهده نشد. بررسی­های بافت­شناسی ماهیان که در معرض ورتیمک قرار داشتند، نشان­دهنده بروز ناهنجاری­های ساختاری در بافت کبد بود. به­طوری­که این تغییرات در مقایسه با بافت­های گروه شاهد اختلاف بسیاری داشته و این تغییرات با افزایش غلظت سم ورتیمک افزایش یافت. در مطالعه­ای که توسط بنایی و همکاران بر روی آسیب­شناسی بافتی کبد ماهی قزل­آلای رنگین کمان تحت دو غلظت تحت­کشنده دیازینون انجام شد که مهم­ترین عوارضی هم چون هیپرتروفی سلول­های کبدی، واکوئله شدن سیتوپلاسم سلولی و تورم ابری مشاهده شد. این نتایج به دست آمده نشان می دهد که تغییرات آسیب شناختی القا شده توسط سم ورتیمک وابسته به روش مواجهه، اندازه و مقدار می­باشند. مطالعه تغییرات هیستوپاتولوژی انجام شده نشان داد، در هر سه غلظت 2 و 3 و 6 ppm سم ورتیمک بافت کبد دچار آسیب شده است. به­طوری­که تجمعات و تقسیمات سلولی در بافت کبد به خصوص در اطراف مجاری سینوزوئیدی افزایش یافته است و با افزایش غلظت، میزان این تجمعات و تقسیمات بیش­تر شده است. کبد ماهی شاخص حساس آلودگی محیط بوده و به دلیل تجمع زیستی فوق العاده نسبت به سایر بافت­های بدن، اکثر مطالعات اخیر برای تعیین آلودگی، بر این اندام متمرکز شده است(21). بیشترین و وسیع ترین عارضه­های مشاهده شده در بافت کبد شامل: تخریب سلول­های کبدی، آب­آوردگی، خونریزی و نکروز بود. که این عارضه­ها در غلظت 2ppm سم ورتمیک، با شدت کمتری بروز نمود. ولی با افزایش غلظت و مدت زمان قرارگیری در برابر سم (6ppm)، میزان آسیب وارد شده نیز بیشتر بود. این تجمع صفرا آسیب احتمالی به متابولیسم کبدی را نشان می­دهد(10). بنابراین به نظر می­رسد تغییرات هیستوپاتولوژیک ایجاد شده در کبد و آبشش ماهی کپور معمولی پس از مواجهه با سم ورتیمک نوعی پاسخ فیزیولوزیک باشد که جاندار برای ممانعت از ورود این مواد به بدن خود و جلوگیری از آسیب­های بیشتر ایجاد کرده است. هم­چنین پارگی در هپاتوسیت موجب شد تا مواد سلولی از آن خارج شود و وجود خون در سینوزوئیدهای کبدی، وجود صفرا در سلول­های هپاتوسیت و سیتوپلاسم، وجود خون در مجاری صفراوی و یا خون­ریزی، رگ­زایی، پرخونی در وریدهای مرکزی لوبولی و سینوزوئیدها، تجمعات سلولی و یا ارتشاح شدید سلول­های دفاعی در پارانشیم کبدی و حذف در بافت کبد مشاهده شد. از آن جائی که نقش کبد در تجزیه و خروج سم است تأثیر سم ورتیمک بر کبد نشان می­دهد که وقتی سم وارد بدن ماهی شده وارد کبد شده و بر روی آن تأثیر زیادی گذاشته و به بافت آسیب رسانده است(20). اکرمی و همکاران در سال 1387 اثر استفاده از اینولین در سطوح 1، 2 و 3 درصد را در جیره­ی ماهی قزل­آلای رنگین کمان بررسی کردند. یافته­های آن ها نشان داد که این نوع پربیوتیک نمی­تواند مکمل مناسبی برای جیره­ی غذایی ماهی قزل­آلا­ی رنگین کمان در نظر گرفته شود و در تیمارهای تحت بررسی تفاوت آماری معنی داری در نرخ بازماندگی مشاهده نگردید. در مطالعه­ای دیگر، با افزودن اینولین به میزان 5 یا 10 g/kg جیره ماهی سیم دریایی(Spaus aurata) طی مدت 1 تا 2 هفته در شرایط پرورشی دریافتند که اینولین بازدارندگی معنی­داری در پارامترهای سیستم ایمنی به دنبال دارد و پیشنهاد کردند که اینولین نمی­تواند محرک ایمنی مناسبی برای این گونه باشد(8). که نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن پروبیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید به تنهایی در جیره غذایی ماهی کپور معمولی باعث ایجاد آسیب و ایجاد عارضه در بافت کبد، آبشش شده است. اکرمی و همکاران در سال 1387 تاثیر پربیوتیک اینولین را در سه سطح 1، 2 و 3% بر روی شاخص­های تغذیه­ای فیل ماهیان جوان پرورشی بررسی کردند. نتایج حاصل، حاکی از ارتباط منفی پربیوتیک اینولین و برخی شاخص­های تغذیه­ای شامل کارایی بقاء انرژی، نسبت کارایی پروتئین و کارایی غذا در فیل ماهیان بود. به طوری که در سطح 3% مقادیر فاکتورهای فوق، در مقایسه با سایر تیمارها کاهش یافت. پروبیوتیک استفاده شده به میزان یک گرم بر کیلو­گرم واحد غذا در این مطالعه نتوانست بر آسیب­های بافتی ناشی از غلظت­کشنده سم ورتمیک بکاهد و تیمارهایی که بعد از دادن پروبیوتیک در معرض سم ورتمیک قرار گرفتند عارضه­های بافتی نظیر تخریب سلول­های کبدی، آب­آوردگی، خونریزی، نکروز و کاریولیز هسته در بافت کبد و عارضه های هایپرپلازی تیغه اولیه، خونریزی، نکروز، چسبندگی تیغه­های ثانویه، چماقی شدن تیغه­های ثانویه، تخریب لاملاهای ثانویه، کوتاه شدن و خمیدگی لاملاهای ثانویه در بافت آبشش مشاهده شد که عارضه­ها به ترتیب در غلظت 6ppm، 3ppm و 2ppm بیشترین اثر تخریب را در بافت کبد، آبشش نشان دادند. اوجی فرد و همکاران در سال 1387 در مطالعه­ای که روی میگوی وانامی(Litopenaeus vannamei)، یک دوز(2 درصد) پربیوتیک اینولین در جیره مورد استفاده قرار دادند که نتایج این مطالعه نشان داد پربیوتیک اینولین اثری بر فاکتورهای رشد، کارایی مصرف جیره و بازماندگی بچه میگوها ندارد(3). Staykov و همکاران در سال 2007، در مطالعه­ای روی قزل­آلای رنگین کمان در دو سیستم پرورش در قفس و کانال­های دراز، اثر افزودن پربیوتیک مانان­الیگوساکارید را روی فاکتورهای رشد، بازماندگی و ایمنی این ماهی بررسی کردند و دریافتند که در هردو سیستم ذکر شده افزودن این پربیوتیک به طور معنی­داری وزن، بازماندگی ایمنی را فزایش و ضریب تبدیل غذایی را کاهش داد(24). این مطالعه نشان داد که غلظت­های کشنده سم ورتمیک باعث آسیب­های شدید در بافت کبد و آبشش و روده می­شود. که شدت این آسیب­ها با افزایش غلظت در 6ppm سم ورتمیک و افزایش مدت زمان قرار گیری در معرض سم 96h افزایش پیدا می­کند. و هم چنین استفاده از پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید به میزان یک گرم در کیلوگرم به تنهایی باعث بروز عارضه در بافت کبد، آبشش و روده گردید و تیمارهایی که به آن­ها پربیوتیک داده شده بود زمانی که در معرض غلظت­های کشنده سم ورتمیک قرار گرفتند. پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید نتوانست از میزان عارضه­های ناشی از آسیب بافتی سم ورتمیک در بافت کبد، آبشش بکاهد. بنابر این با توجه به اثر منفی پربیوتیک ایزومالتو الیگوساکارید بر بافت کبد و آبشش این پربیوتیک نمی­تواند اثری بر بهبود ایمنی ناشی از تخریب سم ورتیمک داشته باشد، هرچند این امر می تواند به دلیل غلظت های مورد استفاده پروبیوتیک و دوره مواجهه باشد که نیاز به بررسی بیشتر در مطالعات آتی دارد.

مراجع

-اکرمی، ر.، قلیچی، ا.، ابراهیمی، ا. 1387. تأثیر سطوح مختلف پربیوتیک اینولین بر رشد و زنده مانی ماهی قزل آلای رنگین کمان(Oncorhynchus mykiss). خلاصه مقالات اولین کنفرانس ملی علوم شیلات و آبزیان ایران، صفحه 12-10.

2-اکرمی، ر.، کریم آبادی، ع.، محمدزاده، ح.، احمدی فر، ا. 1388. تاثیر پربیوتیک مانان الیگوساکارید بر رشد، بازماندگی، ترکیب بدن و مقاومت به تنش شوری در بچه ماهی سفید(Rutilus frisii kutum). مجله علوم وفنون دریایی، 47-57.

3-اوجی فرد، ا.، عابدیان کناری، ع.، نفیسی بهابادی، م.، عباس زاده،ا. 1387. تأثیر پربیوتیک اینولین بر ترکیب اسیدهای چرب عضله میگوی پاسفید غربی(Litopenaeus vannamei). خلاصه مقالات اولین کنفرانس ملی علوم شیلات و آبزیان ایران، صفحه 15-13.

4-ستاری، م.، شاهسونی، د.، شفیعی،ش. 1382. ماهی­شناسی2. نشر حق­شناس.597 ص.

5-هدایتی، ع.، جهانبخشی، ع.، قادری­رمازی، ف. 1392. سم­شناسی آبزیان. چاپ اول، انتشارات دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران، صفحه: 210.

6.Braunbeck, T., Appelbaum, S. (1999). Ultrastructural alterations in the liver and intestine of carp Cyprinus carpio induced orally by ultra-low doses of endosulfan. Diseases of Aquatic Organisms, 36(3);183-200.

7.Çaliskan, M., Erkmen, B., Yerli, S.V. (2003). The effects of zeta cypermethrin on the gills of common guppy Lebistes reticulatus. Environmental Toxicology and Pharmacology, 14(3); 117-120.

8.Cerezuela, R., Cuesta, A., Meseguer, J., (2008). Effect of inulin on gilthead Seabream (Sparus aurata) innate immune parameters. Fish & Shellfish Immunology, 24(5); 663-668.

9.Csillik, B., Fazakas, J., Nemcsok, J., Knyihar-Csillik, E. (2000). Effect of the pesticide deltamethrin on the mauthner cells of lake balaton fish. Journal of Neurotoxicology, 21; 343-352.

10.Fanta, E., Rios, F. S., Romao, S., Vianna, A. C. C., and Freiberger, S. (2003). Histopathology of the fish Corydoras paleatus contaminated with sublethal levels of organophosphorus in water and food. Journal of Ecotoxicology and Environmental Safety, 54; 119-130.

 

11.Flickinger, EA., Van Loo, J., Fahey, G.C. (2003). Nutritional responses to the presence

of inulin and oligofructose in the diets of domesticated animals: A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43(1); 19-60.

12.Hedayati, A., Tarkhani, R. (2014). Hematological and gill histopathological changes in iridescent shark, Pangasius hypophthalmus(Sauvage, 1878) exposed to sublethal diazinon and deltamethrin concentrations. Fish Physiology and Biochemistry, 40; 715-720.

13.Liu, K., Chiu, C., Shiu, Y., Cheng, W., Liu, C. (2010). Effects of the probiotic, Bacillus subtilis E20, on the survival, development, stress tolerance and immune status of white shrimp, Litopenaeus vannamei larvae. Fish and Shellfish Immunology, 28; 837-844.

14.Mahious, A.S. (2005). Prebiotics in aquaculture: new strategy for larviculture improvement. LARVI 05. Fish & Shellfish Larviculture Symposium Belgium, 311-313.

15.Mahious, A.S., Ollevier, F. (2005). Probiotics and prebiotics in aquaculture: a review. 1st regional workshop on techniques for enrichment of live food for use in larviculture. Artemia and aquatic Animals Research Institute, 17-26.

16.Mansingh, A., Wilson, A. (1995). Baseline studies on the status of insectidical pollution of Kingston Harbour Insecticide contamination of Jamaican environment. 3. Marine Pollution Bulletin, 30; 640-643.

17.Martoja, R., Martoja–Pierson, M. (1967). Initiation aux techniques de l histology animale. Masson et Cie, Paris. 345 p.

18.Pelgrom, S., Lamers, L., Lock, R., Balm, P., Wendelaar Bonga, S.E. (1995). Integrated physiological response of tilapia (Orechromis mossambicus) to sublethal copper exposure. Aquatic Toxicology, 32(4); 303-320.

19.Piri Zirkoohi, M., Vince, O. (1997). Effect of some pesticides commonly used in iranian agriculture on aquatic food chain. Thesis submitted to the Hungarian Academy of Sciences for Ph.D. degree, 131p.

20.Rastogi, I.D. (2012). Nanotechnology:safety paradigms. Journal of Toxicology and Environmental Health, 4(1);1-12.

21.Safahieh, A., Hedayati, A., Savari, A., Movahedinia, A., (2011). Effect of sublethal dose of mercury toxicity on liver cells and tissue of yellowfin seabream(Acanthopagrus latus). Toxicology and industrial health, 28(7); 583-92.

22.Satyanarayan, S. Satyanarayan, J.P.K.A., Verma, S. (2012). Histopathological changes due to some chlorinated hydrocarbon pesticides in the tissues to Cyprinus carpio. IOSR Journal of Pharmacy, 2; 60-66.

23.Schley, P.D., Field, C.J. (2002). The immune-enhancing effects of dietary fibres and prebiotics. British Journal Nutrition, 87; 221-23.

24.Staykov, Y., Spring, P., Denev, S., Sweetman, J. (2007). Effect of a mannan oligosaccharide on the growth performance and immune status of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) . Aquaculter International, 17; 153-161.

25.Thitaram, S., Chung, C. H., Day, D. F., Hinton, A., Bailey, J. S., Sirausa, G.R. (2005). Isomaltooligosaccharide increases cecal Bifido bacterium population in young broiler chickens. Poultry Science, 84(7); 998-1003.

26.Van der Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N. P. E. (2003). Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review. Journal of Environmental Toxicology Pharmacology, 13(2); 57–149.

27.Vutukuru, S.S., Prabhath, N.A., Raghavender, M., Yerramilli, A. (2007). Effect of arsenic and chromium on the serum amino-transferases activity in indian major carp, Labeo rohita. International Journal Of Environmental Research And Public Health, 4; 224-227.

 

.