اثر کوآنزیم کیو 10 بر محافظت عصبی درمدل سلولی و حیوانی بیماری پارکینسون القاء شده با 6 – هیدروکسی دوپامین

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 7، دوره 12، شماره 4 - شماره پیاپی 47، آذر 1398، صفحه 75-93   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

مهدیه اذر شب¹؛ مهدی رهنما^{* 2}؛ رامین حاجی خانی¹؛ جلال صولتی³؛ محمد رضا بیگدلی⁴

¹گروه زیست شناسی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

²گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحدزنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران

³گروه زیست شناسی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، کرج ، ایران.

⁴گروه زیست شناسی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: بیماری پارکینسون یکی از شایع ترین انواع بیماری های نورودژنراتیو است. علت اصلی بیماری ، تخریب نورون­های دوپامینرژیک بخش متراکم جسم سیاه در مغز میانی و کاهش غلظت دوپامین در پایانه های جسم مخطط است. این مطالعه، به منظور بررسی اثر کوانزیم کیو10 بر مدل سلولی(PD) القاء شده با سم 6 – هیدروکسی دوپامین با کاهش التهاب انجام شد.
روش کار:برای شمارش سلول های زنده از دو روشMTT و BT استفاده شد. برای ایجاد مدل سلولی پارکینسون ازسم  6 – هیدروکسی دوپامین استفاده گردید. بعدازگذشت48ساعت، درصد سایتوتوکسیسیتی سم واثردارومشخص شد. یک هفته بعد از جراحی کوآنزیم کیو 10 با دوزهای 25، 50 و 100 میلی گرم برحسب وزن موش، به صورت گاواژ به مدت دو هفته مورد درمان و سپس مورد ارزیابی آزمون های رفتاری قرار گرفتند.
یافته ها:در مدل جانوری دوز 25 میلی گرم کوآنزیم کیو 10 اثر قابل ملاحظه ایی بر بهبود علائم رفتاری نداشت. اما دوز50 میلی گرم کوآنزیم کیو 10 اثر قابل ملاحظه ایی بر بهبود علائم رفتاری داشت. در مدل سلولی دوز 20 میکروگرم کوآنزیم کیو 10 اثرقابل ملاحظه ایی بربهبود سلول های مبتلا نداشت. اما؛ دوز25 میکروگرم کوآنزیم کیو 10 اثر قابل ملاحظه ایی بربهبود سلول های مبتلا داشت.
نتیجه گیری:درمان با کوآنزیم کیو10 به جهت ضد التهابی و آنتی اکسیدانی می تواند مرگ سلول های دوپامینرژیک دربخش جانوری و سلول های اولیه کاتکول آمینرژیک دربخش سلولی راتوسط سم 6 – هیدروکسی دوپامین کاهش دهد.

کلیدواژه‌ها

سلول کاتکول آمینرژیک؛ 6 – هیدروکسی دوپامین؛ پارکینسون؛ کوانزیم کیو10

اصل مقاله

بیماری پارکینسون Parkinson’s disease (PD) یــک اختـلـال مزمــن پیشــرونده و تخریــب کننــده­ی عصبــی اســت که به عنــوان دومیــن بیمــاری تخریــب کننــده ی عصبــی رایــج در بیــن افــراد پــس از بیمــاری آلزایمــر می باشــد. میــزان شــیوع ایــن بیمــاری در افــراد بالای 50 ســال تقریباً 2 درصـد گـزارش شـده اسـت(20،7). پارکینســون ثانویــه در اثــر مســمومیت بــا منگنــز ، مســمومیت بــا مونوکســید کربــن ، ضربه ی مزمــن و مـداوم بـه سـر و برخـی مـواد مخـدر تزریقـی ممکـن اسـت ایجـاد گـردد کـه علائمـی مشـابه بـا پارکینسـون را دارد. در ســال 1817 دانشمند بر یتانیایی دکتـر جیمـز پارکینسـون اولیـن گزارش های مربـوط بـه بیمــاری پارکینســون را ارائــه داد(17). بیمـاری پارکینسـون همـراه بـا اختـلالات حرکتـی می باشـد کــه می تــوان بــه ســفتی عضلانی ، لــرزش در حــال اسـتراحت ، آکینـزی، برادیکینــزی، مشـکل در شـروع حـرکات ، ضعــف در حفــظ تعــادل و تغییـر حـالت چهــره بــه هنــگام صحبــت کــردن اشــاره کــرد(17). در اثــر ایــن بیمــاری 50 تــا 70 درصــد نورون­هــای دوپامینرژیــک ناحیـه متراکــم جســم ســیاه Substantia Nigra(SN) تخریــب می شــوند(6). عــلاوه بــر نورون هــای دوپامینرژیــک ســایر جمعیت هــای نورونــی نیــز کــه شــامل بخش هایــی از لوکــوس ســرلئوس، هســته­های رافــه ای و هســته حرکتــی پشــتی واگ، قشرســینگولیت  Cingulateو پیــاز بویایی هم تخریب می شوند(16، 9). ایــن بیمــاری ناشــی از یــک عــدم تعــادل بیــن تحریــک و مهــار در هسته هــای قاعــده ای است(پوتامن، هسته دم دار، جسم سیاه، هسته زیر تالاموسی، گلو بــوس پالیــدوس) که با افزایش استیل کولین نسبت به دوپامین و مهــار دوپامینــی پوتامــن می باشــد(11). 6 - هیدروکسی دوپامین یــک آنالــوگ هیدروکسـیله شـده از انتقـال دهنـدۀ عصبـی دوپامیـن اسـت. ایـن ترکیـب توسـط Senob در سـال 1959 ایزولـه شـد. آثـار بیولوژیکـی آن اولیـن بـار توسـط Porter و همکارانـش بررسـی شد. آن ها نشان دادنــد کــه 6 - هیدروکســی دوپامیــن قــادر بـه القـاء کاهـش نورآدرنالیـن در سیسـتم عصبـی خودمختـار و قلــب اســت. هم­چنیــن ایــن ســم قــادر بــه تخریــب پایانه­هــای نورونی در سیســتم ســمپاتیک می­باشـد(19). نورون هــای دوپامینرژیــک حــاوی ســطوح معنــی داری از دوپامیـن، هیـدروژن پراکسـید و آهـن آزاد می باشـند کـه یـک واکنـش غیـر آنزیمـی بیـن ایـن عناصـر ممکـن اسـت منجـر بــه شــکل گیری 6 - هیدروکســی دوپامیــن گــردد. 6 - هیدروکسی دوپامین آسـیب بـه نورون هـای دوپامینرژیک جسـم مخططـی - جسـم سـیاه را از طریـق تولیـد هیـدروژن پراکســید و رادیکال هــای هیدروکســیل القــاء می کنــد(3). یـک ترکیـب بنزوکینـون محلول در چربی آندروژن است که به طور طبیعی در بیشتر بافت­های بدن یافت می شود. از مهم­تـرین مـواد مـورد نیـاز جهت سلامتی و حیات سلول ها است که جهت تولید انـرژی داخل سلولی ضروری است(1). کوآنزیم Q10 در تولید ATP در سلول نقش دارد و در زنجیره ی انتقال الکترون در چرخه ی تنفسی باعث انتقال الکترون­ها از مولکول های احیاءکننده به پذیرنده های الکترون در میتوکندری می شود و بیشترین مقدار آن نیز در غشای داخلی میتوکندری موجود است. کوآنزیم Q10 هم­چنین دارای خاصیت ثابت شده ی آنتی اکسیدانی و ضد رادیکال آزاد می­باشد که این خاصیت حدود 50 برابر بیشتر از ویتامین E است و در نتیجه از آسیب اکسیداتیو و پراکسیداسیون چربی های غشاء و هم­چنین آسیب های ژنوم در سلول جلوگیری می کند. امروزه از کوآنزیم Q10 در درمان بیماری های نارسایی قلبی ، بیماری­های اعصاب مثل آلزایمر و پارکینسون، اختالالت باروری، نارسایی ایمنی، بیماری­های پوست، بیماری های چشم و دیابت استفاده می شود. هم­چنین ثابت شده است که عوارض جانبی کوآنزیم Q10 بسیار اندک و ناچیز است. این ترکیب در داخل بدن به طور طبیعی سنتز شده ولی میزان آن با افزایش سن، کاهش می یابد(4). کوآنزیم Q10 یـک مولکـول لیپوفیلیـک اسـت. وجـود آن در واکـنش هـای آنزیمی فسفریلاسیون اکسـیداتیو لازم اسـت. کـوآنزیم Q 10 ، علاوه بر انتقال الکترون­ها در زنجیره تنفسی میتوکندریایی، در برخی از اعمال اصلی سلول از قبیـل انتقـال الکتـرون در غشـا پلاسـمایی و لیزوزومی، تعدیل آپوپتوز، انتقال پروتون، مهار پراکسیداســـیون لیپیـــدی و در مـــواردی بـــه عنـــوان عامـــل پرواکســیدان مطــرح اســت(14). هم­چنــین، در مــوش هــای فاقــد آپولیپوپروتئین E، کوآنزیم Q10 مانع وقوع آتروسکلروز مـی شـود(8). از طرف دیگر، شـواهد بیـان­گر نقـش حفـاظتی کـوآنزیم Q10 در سلول­های عصبی اسـت. چنـان کـه در شـرایط ایسـکمی و توکسیسیتی، کوآنزیم Q10 با مهار استرس اکسـیداتیو مـانع آسـیب رسیدن به نورون ها می­شـود(13). بـه عـلاوه، در مـوش صـحرایی، کوآنزیم Q10 با اثـر بـر اسـیدوز منـتج از لاکتـات و تولیـد ATP و تعدیل نسبت فرم اکسید و احیا شده گلوتاتیون و فعالیت سوپراکسید دیسموتاز اثر حفاظتی خود را در مدل ایسـکمی القـا شـده از طریـق آندوتلین اعمال می­کند. از آن­جایی که کوآنزیم Q10 به عنوان یک جمـع کننـده رادیکـال هـای آزاد دارای اثـرات آنتـی اکسـیدانی است، در اختلالات منتج از ایسکمی-رپرفیـوژن مغـز کـه بـه دنبـال تجمع رادیکـال هـای آزاد اکسـیژنی و متابولیسـم غیرطبیعـی انـرژی حادث می شود، مـی توانـد نقـش حفـاظتی خـود را از طریـق بهبـود متابولیسم انرژی مغز ایفا نماید(21).

 

کوآنزیم Q10

مواد و روش ها

مدل جانوری پارکینسون:  

45 سرموش کوچک آزمایشگاهی نر بالغ نژاد NMRI با محدوده وزنی 30 گرم از انستیتو پاستور ایران تهیه و در قفس های 4 تایی و تحت شرایط نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و محدوده دمایی 22-25 درجه ی سانتی­گراد نگهداری می شوند. همه ی جانوران دسترسی آزاد به آب و غذای استاندارد را داشته و حداقل 10 روز پس از آداپتاسیون به محیط مورد استفاده قرار می گیرند.

گروه بندی جهت ایجاد مدل جانوری پارکینسون :

در این مرحله موش ها به صورت تصادفی به گروه های زیر تقسیم می شوند :

1 - گروه کنترل : این گروه حلال سالین حاوی 1% اسید اسکوربیک را به صورت تزریقی به درون استرایاتوم سمت چپ مغزخود دریافت خواهند کرد (10 سر).

2 - گروه تیمار : موش های گروه تیمار μg/μl 5 از حلال HDOP  6 - حاوی 1% اسید اسکوربیک را به صورت تزریقی به درون استرایاتوم سمت چپ مغز خود دریافت خواهند کرد (40 سر).

گروه بندی جهت درمان مدل جانوری پارکینسون

در این مرحله در واقع 40 سر موشی که پارکینسون در آن ها ایجاد شده گروه بندی و سپس با دارو ها درمان تیمار گردیدند

1           - گروه کنترل که فقط آب مقطرحلال Q10 رابه صورت گاواژدریافت می نمایند(10 سر).

2           - گروه تیماری با  Q10 با دوزهای (25 , 50 , 100 mg/kg) را به صورت گاواژ دریافت می نمایند (30سر).

حدود 1% اسید اسکوربیک ( ویتامین C ) به محلول گروه کنترل و نوروتوکسین گروه های تیمار در مرحله ایجاد مدل جانوری اضافه می گردید تا در فاصله زمانی چند دقیقه انتقال به سلول های دوپامینرژیک نیگرا، از اکسیده شدن HDOP  6 –جلوگیری نماید. چون دوپامین و مشتقات آن در محیط مایع سریع اکسیده می شوند. در ضمن خود ویتامینC هم ناپایدار است که باید زودتر مصرف شود.

تکنیک اجرایی ایجاد مدل جانوری پارکینسون :

ایجاد مدل جانوری با روش استریوتاکسی :

استریوتاکسی :Stereotaxy روشی با کم­ترین تهاجم و دقت بیشتر، برای جراحی مغز و اعصاب است که در آن مختصات سه بعدی نقطه مورد نظر بررسی و محل دقیق تزریق مشخص می شود. در این پژوهش به منظـور تزریق 6 - هیدروکسی دوپامین درون استرایاتوم، کـانول که از سـر سـوزن شماره 21 ساخته شده است، با روش جراحـی استریوتاکسی درناحیه مغـز مـوش قرار داده می شود. بـدین منظـور مـوش هـا پـس از بی هوشـی بـه وسـیله مخلوط کتـامین بـا دوز 100 mg/kg و زایلازیــن با دوز 10 mg/kg به صورت تزریق داخل صفاقی تحـت عمـل جراحـی قرار خواهند گرفت. سر حیوان توسط میله جلویی مهار و میله های کناری داخل هر دو گوش قرار گرفته و حیوان در دستگاه استریوتاکس ثابت و بی حرکت می ماند. موهای ناحیه پشتی جمجمه تراشیده شده وبا پنبه و الکل پوست سر ضدعفونی می شود. یک برش نیم سانتی در ناحیه ایجاد کرده و باپنبه الکلی چربی های محل را پاک نموده تا نقطه برگما(محل اتصال استخوان های آهیانه وپیشانی) و لامبدا(محل اتصال استخوان های آهیانه وپس سری) در یک امتداد به طورواضح دیده شود. نشان­گر دستگاه روی نقطه برگما و سپس لامبدا قرارمی گیرد. بـه کمـک دسـتگاه استریوتاکـسی USA ,Stoelting  و طبق اطلس آموزشی(Watson and Paxinos ) مختصات مغز موش برای ناحیه AP: +0.04 cm , ML: ±0.18 cm , DV: −0.35 cm  پیدا شده و کانول جای گذاری می شود( ML محور میانی - جانبی، DV محور پشتی - شکمی، AP محور قدامی – خلفی). جهت بررسی محل دقیق کانول برای تعدادی از موش­ها مرکب و یا رنگ متیلن بلو تزریق شده و سپس با برش بافتی محل دقیق قرار گیری کانول و تزریق 6 - هیدروکسی دوپامین( OHDA-6 )، مشخص می­شود. بر اساس مدل تعریف شده در مطالعات( تمرینی  قبلی و تجربی ) برای پارکینسون، کانول گذاری و تخریب استرایاتوم فقط یک­طرفه و در نیمکره چپ انجام می­شود. پس از سوراخ کردن محل مورد نظر به کمک دریل دندانپزشکی، 5 میکروگرم نوروتوکسین  6- OHDA  در یک درصد اسید اسکوربیک به صورت یک طرفه درون SNc با استفاده از سرنگ هامیلتون 5  میکرولیتری تزریق شد. به منظور جلوگیری از بازگشت محلول محتوی  6- OHDAبه درون سرنگ و برای انتشار بهتر محلول در منطقه ی SNc، سرسوزن به مدت 1 دقیقه پس از تزریق در جای خود ثابت ماند.

تهیه محلول نوروتوکسین6- OHDA:

نوروتوکسین 6- OHDAازشرکت TOCRIS آمریکایی خریداری شد. بـرای ایـن منظــور می تــوان نوروتوکســین را در دوز 6 میکروگــرم در 2 میکرولیتـر محلـول نمکـی 9/0 % و یک درصد ویتامین C حـل کرد.

 تست های تاییدی مدل پارکینسون :

الف ) تست های رفتاری :

1 - چرخش ناشی از تزریق آپومورفین: یک هفته بعد از ایجاد مدل پارکینسونی، آپومورفین هیدروکلراید  با دوز mg/kg 5/. وزن موش به صورت داخل صفاقی تزریق خواهد شد. حیوانات از 10 دقیقه قبل از شروع آزمایش به یک محفظه استوانه ای مدرج بر حسب زاویه از جنس پلکسی گلاس به قطر 33 و ارتفاع 35 سانتی متر منتقل می شوند. یک دقیقه پس از تزریق آپومورفین، تعداد چرخش در فواصل زمانی 10 دقیقه­ای به مدت کل 60 دقیقه تحت شرایط آرام توسط یک شمارش گر دستی اندازه گیری خواهد شد. با توجه به ناحیه ی آسیب دیده، تعداد چرخش ایپسیلترال(چرخش به سمت چپ) به عنوان عدد منفی و تعداد چرخش کنترالترال(چرخش به سمت راست) به عنوان عدد مثبت در نظر گرفته شده و تعداد خالص چرخش به صورت تفاضل چرخش ها در دو جهت محاسبه می شود. این آزمون طبق روش شرح داده شده توسط Cesario  و همکارانش در سال 1995 صورت می گیرد. در این آزمون موش های پارکینسونی بیش از 30 چرخش در یک ساعت بر خلاف جهت تزریق نوروتوکسین را نشان می دهند. تعداد این چرخش ها در واحد زمان نشان دهنده شدت تخریب نورونی در جسم سیاه و شدت بیماری است.

تکنیک اجرایی ایجاد مدل سلولی پارکینسون:

کشت سلول

1 – تهیه محیط کشت

محیط کشت مورد استفاده در این مطالعه DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) است که به صورت پودر خریداری شد. برای تهیه 100میلی لیتر محیط کشت به مقدار 04/1 گرم پودر RPMI و 2/0گرم پودر بی کربنات وزن کرده باآب دیونیزه شده به حجم 100میلی لیتر رسانده می شود. برای تهیه محیط کامل ، به محیط کشت تهیه شده به مقدار 10 میلی لیتر10% FBS(  Fetal bovine serum ) و 1 میلی لیتر مخلوط آنتی بیوتیک های پنی سیلین و استرپتومایسین(1%) در شرایط استریل اضافه می شود و بعد از تهیه ، داخل یخچال ^oC 4  نگهداری می گردد .

2 - دِفریز یا ذوب کردن سلول ‌ها

از آن­جایی که سلول ها به صورت منجمد در فریزر^oC80- برای کوتاه مدت و تانک ازت ^oC 196-  برای طولانی مدت نگهداری شدند، اولین اقدام برای مطالعه و استفاده از این سلول ها دفریز کردن است که باید بسیار سریع صورت گیرد. میکروویال حاوی استوک سلولی خارج شده از فریزر یا تانک ازت ، در تماس با دست با حرارت ^oC 37 بدن تحت تاثیر قرار می گیرد . درب میکروویال به آرامی باز شده وآن مقدار از سلول که ذوب شده به فالکون منتقل می شود . این عمل تا ذوب شدن کامل و خالی شدن استوک سلولی،به آهستگی پیپتاژ می شود. فالکون حاوی سلول به مدت 6 دقیقه و با سرعت rpm 2000 سانتریفوژ سوسپانسیون سلولی تهیه گردید.

3 - شمارش سلولی با رنگ تریپان بلو

برای شمارش سلول ها با این روش از یک قطره رنگ تریپان بلو و لام نئوبار استفاده شد. در این روش تعداد سلول ها در یک سطح معین با عمق مشخص شمارش شده و غلظت سلولی محاسبه و مقدار محیط برای محاسبات تعداد سلول در نظر گرفته می­گردد. برای شمارش سلولی حجم برابری از رنگ تریپان بلو و سوسپانسیون سلولی تهیه شده ، با هم مخلوط می شوند  .10 ماکرولیتر تریپان بلو و 10 ماکرولیتر از سوسپانسیون سلولی با هم مخلوط شده و 10 ماکرولیتر از این مخلوط روی لام نئوبار به زیر میکروسکوپ منتقل می شود . سلول ها در میکروسکوپ نوری معمولی  invert با بزرگنماییX 10 شمارش می شوند . تعداد سلول های زنده در هر 5 بخش لام شمارش شده و میانگین گرفته می شود

4- تعویض محیط کشت سلول ها

بسته به سرعت رشد و متابولیسم و نوع سلول‌ها ، بعد از مدت زمان مشخصی  سلول‌ها به تعویض محیط کشت نیاز دارند . رشد سلول ها با افت pH از 7 به 5/6 متوقف شده و در محدوده pH  5/6 تا 6 آغاز می شود . تغییر PH 1/0 در یک روز تغییر چندانی در رشد سلول‌ها ایجاد نمی‌کند ولی تغییر 4/0 در اسیدیته نشان دهنده‌ی این است که در فاصله 24 تا 48 ساعت باید مواد غذایی به محیط کشت اضافه شود . اگر سلول‌ها سریع تکثیر شوند و رشد کنند ، مواد غذایی محیط کشت زودتر و بیشتر استفاده می‌شود .اگر محیط کشت داخل فلاسک تغییر رنگ داده باشد نشان دهنده‌ی تغییر pH است . اگر رنگ محیط از قرمز به زرد تغییر کند نشان­گر زمان تعویض محیط است. بنابراین محیط سلول ها بسته به نوع سلول باید هر 48 -24 ساعت تعویض شود . تعویض به این صورت است که فلاسک حاوی سلول ازدستگاه انکوباتور خارج شده و بعد از مشاهده میکروسکوپی ، محیط قبلی داخل فلاسک را دورریز و محیط کشت کامل تازه که دمای آن به ^oC 37 رسیده را با پیپت داخل فلاسک می ریزیم .

5- پاساژ دادن سلول ها

زمانی که سلول‌ ها تکثیر پیدا کند و تراکم سلولی در کف فلاسک به 80% برسد ، موجب کمبود فضای کافی برای رشد و تکثیر سلول ها می شود . بنابراین سلول ها نیازمند فضای بیشتر بوده در این حالت سلول­ها باید به دو یا چند فلاسک مورد نیاز پاساژ داده شوند .

مراحل پاساژ سلول های چسبنده به ترتیب زیر انجام می شود :

1 - فلاسک حاوی سلول را بعد از بررسی میکروسکوپی و اطمینان از عدم آلودگی به  زیر هود لامینار منتقل کرده، و برای حذف باقی مانده سرم جنین گاوی (FBS  )، سلول ها 2 مرتبه با بافرphosphate-buffered saline شسته می شوند . 2 - بافر PBS را از فلاسک خارج نموده ، برای جدا کردن سلول‌ها از کف فلاسک از  (Trypsin-EDTA)1X استفاده می‌شودTrypsin . دارای خاصیت آنزیمی است و موجب کنده شدن سلول ها از ته فلاسک می شود که با EDTA ترکیب شدهTrypsin - EDTA   به صورت منجمد در میکروویال‌های 5/1 یا 2 میلی لیتری در فریزر  ^oC20 - نگهداری می‌شود . به میزان 1/0 میلی لیتر به ازای هر سانتی متر مربع از سطح ظرف ،  Trypsin - EDTA در فلاسک ریخته می شو .

 3 - بعد از گذشت 3 تا 5 دقیقه ، سلول ها از کف ظرف کنده شده و شناور می شوند . پس از مشاهده سلول ها در زیر میکروسکوپ و حصول اطمینان از جدا شدن آن ها ، برای جلوگیری از اثر تخریبی تریپسین بر سلول ها ، به محیط کشت 10% FBS اضافه می شود تا اثر هضم کنندگی تریپسین بر سلول را خنثی کند . محتویات فلاسک بعد از چند بار پیپتاژ ، با پیپت جمع‌آوری شده وداخل یک فالکون 15 ریخته می‌شودوسلول ها به مدت 6 دقیقه با دور2000سانتریفوژ می شود . سپس، محلول حاوی آنزیم تریپسین دورریز می شود وته فالکون پلاک سلولی تشکیل می گردد که با محیط کامل تازه ، به فلاسک های جدید منتقل می شود .

6 - ذخیره و منجمد کردن سلول ‌ها

به دلیل نگه داری سلول ها برای مطالعات بعدی ، جلوگیری از پیری سلول ها و کاهش تغییرات ژنتیکی و مورفولوژی آن ها ، ذخیره کردن سلول ها به صورت منجمد ، بهترین روش می باشد . در این روش سوسپانسیون سلولی باید با غلظت زیاد و در حضور یک cryoprotective مانند DMSO فریز شود.cryoprotective با کاهش نقطه انجماد باعث کاهش سرعت فریز شدن سلول ها می گردد . این انجمادتدریجی، ریسک تشکیل بلورهای یخ و در نتیجه آسیب سلولی را کاهش می دهد . برای تهیه ذخیره سلولی  و فریز کردن ، ابتدا پس از تهیه سوسپانسیون سلولی سلول ها سانتریفوژ می شوند . برای تهیه استوکی  (Stock) به حجم 1میلی لیتر900 ماکرولیترسرم FBS به پلاک سلولی داخل فالکون اضافه شده و پیپتاژ انجام می شود . سپس سوسپانسیون سلولی به میکروویال منتقل شده و 100 ماکرولیتر DMSO به آن اضافه می شود . به سرعت میکروویال حاوی سلول به مدت 1 تا 2 ساعت در فریزر ^oC 20 - قرار داده می شود .بعدبه فریزر ^oC 70- منتقل می شود.در صورت نیاز برای نگه داری طولانی مدت بعد از 24 ساعت به تانک ازت ^oC  196- منتقل می گردد و مشخصات کامل سلولها ثبت می گردد .

7 - سنجش توان حیاتی سلول ها

یکی از موارد مهم در بحث زیست شناسی سلولی تعیین بقای سلول است . از جمله آزمایش هایی که در این زمینه از اهمیت خاصی برخوردار است سنجش توان حیاتی سلول ها(Cell Viability) تست MTT است . در این تست محلول زرد رنگ تهیه شده از پودر[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) ، توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز سلول های زنده و فعال از نظر متابولیکی ، در مدت 4 ساعت در انکوباتور ، به بلورهای ارغوانی رنگ فورمازان تبدیل می شود .کریستال های فورمازان ساخته شده در آب غیر محلول است و به کمک حلال DMSO حل شده و جذب نوری محلول ارغوانی رنگ به وسیله  دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570  نانومترخوانده می شود . در نهایت به کمک منحنی استاندارد تعداد سلول های زنده محاسبه می شود . برای هر رده سلولی ارتباط خطی بین تعداد سلول ها و جذب نوری محلول نهایی وجود دارد.

8 - ایجاد مدل سلولی پارکینسون :

در این مطالعه نیز نوروتوکسین 6 - هیدروکسی دوپامین به همراه کوآنزیم کیو10در حلال سالین با اضافه کردن 1% اسید اسکوربیک به عنوان محافظ 6 - هیدروکسی دوپامین از اکسیده شدن استفاده می شود . سلول های مورد استفاده محیط کشت از سلول ها ی کاتکولامینرژیک هستند . شبیه سلول های دوپامینی مغز بوده و در حقیقت سلول اولیه سلول های دوپامینی می باشند . در این مدل خود سلول های دوپامینی به دلیل سمیت استفاده نمی شوند .غلظت های استفاده شده برای محلول 6 - هیدروکسی 50 و محلول های کوآنزیم کیو10بادوزهای20 ،   25 ،  30  میکروگرم بود که با فیلتر سرنگی استرلیزه شده و با سمپلر به محیط کشت اضافه می شود.

محیط کشت یک :  فقط محیط کشت سلول ها ی کاتکولامینرژیک.

محیط کشت دو : فقط حلال DMSO .

محیط کشت سه :  6 - هیدروکسی دوپامین به همراه کیو10.

محیط کشت چهار : حلال DMSO به همراه 6 - هیدروکسی دوپامین

محیط کشت پنج : فقط 6 - هیدروکسی دوپامین

محیط کشت شش : حلال DMSO + محلول MTT

بعد از 48 ساعت انکوباسیون به تمام محیط ها محلول MTT اضافه شد.

9 - بررسی اثرات داروها

برای انجام این تست ابتدا سوسپانسیون سلولی تهیه و شمارش سلولی انجام شد که مشخص شود چه تعداد از سلول ها زنده مانده اند . سپس سلول ها به تعداد 5000 در هر چاهک به پلیت 96 خانه ته صاف با محیط کشت کامل منتقل و به مدت 24 ساعت در انکوباتور  CO₂با دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری وپس از 24 ساعت محیط کشت قبلی سلول ها با محیط کشت تازه که تیمارها در آن صورت گرفته بود تعویض شد.

غلظت های مختلف از 6 - هیدروکسی دوپامین و کوآنزیم کیو10 تهیه شده و 1 ماکرولیتر از هر یک از غلظت های تهیه شده برداشته و با محیط کشت کامل به حجم 200 ماکرولیتر رسانده و سپس به داخل چاهک ریخته می شود در ضمن هر تیمار برای خود دارای پنج چاهک است . و بعد پلیت ها به انکوباتور برگردانده می شود . غلظت نهایی ترکیبات برای زمان 48 ساعت تیمار در داخل چاهک برای 6 – هیدروکسی دوپامین 50 ، و برای کوآنزیم کیو 10 دوز25و30  میکروگرم خواهد بود .  درهرپلیت پنج چندچاهک به عنوان کنترل  درنظرگرفته می شود.پس از 48 ساعت پلیت از انکوباتور خارج و محیط کشت حاوی تیمارها تخلیه شده و 200 ماکرولیتر محلول MTT به هر چاهک اضافه می شود ( با غلظت نهایی mg/ml 5/0 ) . اضافه کردن محلول MTT به چاهک ها باید در تاریکی و دور از نور مستقیم انجام شود. سپس، پلیت رابا فوئل پوشانده و به مدت 4 ساعت انکوبه می شود . بعد از 4 ساعت ، بلورهای فورمازان ظاهر شده و به هر چاهک 200 ماکرولیتر DMSO اضافه می شود و بلورهای ارغوانی فورمازان حل شده و جذب نمونه ها در nm570 با دستگاه الایزا اندازگیری می گردد و درصد سایتوتوکسیسیتی 6 - هیدروکسی دوپامین و dose-response دارو محاسبه می شود که کوانزیم کیو10 تا چه حد توانسته از سلول های کاتکولامینرژیک در مقابل نوروتوکسین محافظت کند .

نتایج

بررسی یافته ها و نتایج در بخش جانوری

بر اساس تجزیه و تحلیل آماری مشخص شد که در این پژوهش تفاوت معناداری در گروه تیماری با کوآنزیم کیو10 نسبت به موش­های گروه کنتـرل وجود دارد. یافته های این تحقیق نشان دهنده اثرات نوروتوکسین6 - هیدروکسی دوپامین برجسم سیاه برای ایجاد بیماری پارکینسون با تخریب نورون های دوپامینرژیک است و نیز در این پژوهش به این نتیجه رسیده شد که مصرف داروی کوآنزیم Q10 به علت داشتن خاصیت آنتی اکسیدانتی می تواند از پیشرفت بیماری پارکینسون جلوگیری کند. نتایج حاصل از این پژوهش در دو بخش بررسی می شود.

الف ) ایجاد و تایید بیماری پارکینسون :

تزریق آپومورفین باعث افزایش معناداری در چرخش موش های پارکینسونی در مقایسه با گروه کنترل شده است(001/0>p)(نمودار1). افزایش معنی دار کاتالپسی در گروه های تیماری که به بیماری پارکینسون مبتلا شده اند مشاهده می گردد(نمودار 2).

نمودار3 : بعد از تزریق 6 – هیدروکسی دوپامین به گروه تیمار کاهش معنی داری در تعداد نورون های هسته سابستانتیکا نیگرا نسبت به نورون های گروه کنترل مشاهده می شود(نمودار 3).

ب ) اثرات دوزهای کوآنزیم Q10 بر روی موش های پارکینسونی شده:

تعداد چرخش های ناشی از تزریق آپومورفین به گروه کنترل(آب) و تیمار دریافت کننده دوزهای 25، 50، 100 کوآنزیم Q10 در نمودار 4 نشان داده است.  نتایج به دست آمده نشان می دهد که هر سه دوز Q10 به طور معنی داری تعداد چرخش های ناشی از آپومورفین، نسبت به گروه کنترل دریافت کننده آب، را کاهش داده اند(01/0>p). در خصوص زمان کاتالپسی و مدت زمان بی حرکتی در آزمون تست شنای اجباری دوز 50 Q10کاهش معنی داری نشان داد(نمودار 5 و 6). در خصوص تعداد دفعات ورود موش به بازوی بازوبسته ماز، برای ارزیابی آزمون اضطراب درگروه کنترل دریافت کننده آب و تیمار دریافت کننده دوزهای 25، 50، 100 کوآنزیم Q10 است و این تعداد درگروه تیمار با دوز 50  بیشتر شد که نشانه کاهش اضطراب و بهبود بیماری پارکینسون است(نمودار7). در خصوص درصد زمان گذرانده در بازوی باز ماز گروه کنترل دریافت کننده آب و تیمار دریافت کننده دوزهای 25، 50، 100 کوآنزیم Q10 است و درصد این فعالیت درگروه تیمار با دوز 100 افزایش معنی داری دارد(نمودار8).در خصوص بررسی تعداد نورون ها در هسته سابستنتیا نیگرای گروه کنترل و پارکینسونی تیمار شده با دوزهای 25، 50، 100 کوآنزیم Q10 برحسب mg/kg وزن بدن موش است. که تعداد نورون ها با دوز 100 محافظت بیشتری داشت(نمودار9).

 

 

نمودار 1- مقایسه چرخش ناشی از تزریق آپومورفین درگروه کنترل و گروه پارکینسونی شده با 6-HDOP .

نمودار 2- نتایج تزریق سالین به گروه کنترل و تزریق 6 – هیدروکسی دوپامین به گروه های تیماری و افزایش کاتالپسی در گروه های تیماری که نشان دهنده آن است که به بیماری پارکینسون مبتلا شدند.

 

 

نمودار3 - نتایج شمارش تعداد نورون ها در هسته سابستانتیکا نیگرا بعد از تزریق 6 – هیدروکسی دوپامین به گروه های تیماری است که  نشان می دهد موش های تیمار به بیماری پارکینسون مبتلا شدند. هر ستون نشان دهنده

 Mean±SEM    و P<0.001***  

 

نمودار4- چرخش ناشی از تزریق آپومورفین در موش های  پارکینسونی تیمار شده با آب ودوزهای  25، 50 و 100 میلی گرم بر کیلو گرم  کوآنزیم Q10 هر ستون نشان دهنده Mean±SEM*  p<0.05 و ** p<0.01

 

 

نمودار5 - نتایج حاصل از بررسی رفتارکاتالپسی در گروه کنترل و پارکینسونی تیمار شده با دوزهای 25، 50، 100 کوآنزیم Q10 برحسب mg/kg وزن بدن موشهر ستون نشان دهنده Mean±SEM    و P<0.001*** و ** p<0.01

 

 

نمودار6-نتایج حاصل از بررسی زمان بی حرکتی درشنای اجباری برای تست افسردگی در گروه کنترل و پارکینسونی تیمار شده با دوزهای   کوآنزیم Q10 برحسب mg/kg وزن بدن موش. هر ستون نشان دهنده

 Mean±SEM    و *  p<0.05

 

 

نمودار7- نتایج حاصل از بررسی زمان رفتارفعالیت حرکتی در ماز برای تست اضطراب در گروه کنترل و پارکینسونی تیمار شده با دوزهای  25، 50، 100 کوآنزیم Q10 برحسب mg/kg وزن بدن موش هر ستون نشان دهنده Mean±SEM*  p<0.05 و ** p<0.01

 

نمودار8-نتایج حاصل از بررسی زمان رفتارحضور موش در بازوی باز ماز در گروه کنترل و پارکینسونی تیمار شده با

دوزهای  25، 50، 100 کوآنزیم Q10 برحسب mg/kg وزن بدن موشMean±SEM    

وP<0.001****  p<0.05, ** p<0.01,

 

نمودار9- نتایج حاصل از بررسی تعداد نورونها در هسته سابستنتیا نیگرای گروه کنترل و پارکینسونی تیمار شده با دوزهای

 25، 50، 100 کوآنزیم Q10 برحسب mg/kg وزن بدن موش هر ستون نشان دهنده Mean±SEM    و *  p<0.05

 

بر اساس تجزیه و تحلیل آماری مشخص شد که در این پژوهش تفاوت معناداری در گروه تیماری با کوآنزیم کیو10 نسبت به سلول های گروه کنتـرل وجود دارد. یافته های این تحقیق نشان دهنده اثرات نوروتوکسین 6 - هیدروکسی دوپامین، برسلول های اولیه کاتکول آمینرژیک برای ایجاد بیماری پارکینسون با تخریب نورون های کاتکول آمینرژیک است و نیز در این پژوهش به این نتیجه رسیده شده است که مصرف داروی کوآنزیم Q10 به علت داشتن خاصیت آنتی اکسیدانتی می تواند از پیشرفت تخریب نورون­های کاتکول آمینرژیک وبیماری پارکینسون جلوگیری کند.

آزمون:MTT

در آزمون MTT این تغییررنگ نشان دهنده فعالیت آنزیمی سوکسینات دهیدروژناز میتوکندیایی سلول های زنده است که مشخص کننده تعداد سلول های زنده می باشد و هر چقدر رنگ حاصل بیشترباشد، واکنش و تعدادسلول های زنده نیزبیشتراست(نمودار10 وشکل1).

آزمون تریپان بلوBT :

این آزمون نشان دهنده تعدادسلول های زنده ومرده پس ازتزریق سم OHDA-6 می باشد.این ترکیب به دلیل مقاومت سلول­های زنده، به درون سلول های زنده نفوذ نمی کند ودیواره سلول ها زیرمیکروسکوپ شفاف دیده می شوند. در حالی که سلول های مرده رنگ راجذب کرده ودیواره آن­ها زیرمیکروسکوپ به رنگ تیره دیده می شود(نمودار 11 و شکل 1).

 

نمودار10- نتایج حاصل ازبررسی تغییررنگ درتستMTT.

مقایسه گروه سلولی کنترل که دارو و HD-6 دریافت نکردند، گروه سلولی دریافت کننده فقط  HD-6 و گروه های تیماری

دریافت کننده HD-6 و کوآنزیم کیو 10با دوزهای25، 20و30 میلی گرم.Mean±SEM  P<0.001*** و ** p<0.01

 

 

نمودار12-نتایج حاصل ازبررسی تعداد نورون های زنده درمحیط کشت سلولی بارنگ آمیزی تریپان آبی TB.

مقایسه گروه سلولی کنترل که دارووHD-6 دریافت نکردند، گروه سلولی دریافت کننده فقط HD-6 و گروه های تیماری

دریافت کننده HD-6 وکوآنزیم کیو10بادوزهای25،20و30 میلی گرمMean±SEM  P<0.001***

 

 

 

شکل 1- نتایج حاصل ازبررسی تعداد نورون های زنده و مرده درمحیط کشت سلولی بارنگ آمیزی تریپان آبی BT و تستMTT

d :سلول های مرده در روش BT، c : سلول های زنده در روش BT، a: سلول های زنده در روش MTT،b : سلول های مرده در روش MTT

 

 

بحث و نتیجه گیری

درآزمون آپومورفین موش های پارکینسونی بیش از 30 چرخش در یک ساعت بر خلاف جهت تزریق نوروتوکسین را نشان دادند. تعداد این چرخش ها در واحد زمان نشان دهنده شدت تخریب نورونی در جسم سیاه و شدت بیماری است(39). درتست میله برای سنجش کاتالپسی اگردر مدت زمان کمتری، دست موش از روی میله بردارد، یعنی؛ هنوز به طور شدید به بیماری پارکینسون مبتلا نشده است و این زمان هر چه بیشتر باشد، بیشتر پارکینسونی شده است(92). در تست اضطراب افزایش مدت زمان حضور جانور در بازوی باز به عنوان معیاری برای کاهش اضطراب و کاهش حضور آن به عنوان افزایش اضطراب در نظر گرفته می شود. در تست شنا افــزایش زمــان بــی حرکتــی Immobility  را معــادل افسردگی و کاهش آن به عنوان اثر بخشی درمان ضد افسردگی ارزیابی می شود. نتایج این تحقیق نشان می دهد که تیمار با Q10  بصورت معنی داری باعث کاهش زمان بی حرکتی و کاتالپسی، افزایش فعالیت های حرکتی و کاهش چرخش ناشی از آپومورفین شده است که نشان دهنده اثرات محافظتی کوآنزیم Q10 در برابر آسیب های ناشی از بیماری پارکینسون می باشد. سلول های پارکینسونی بعد از درمان با Q10 محافظت شدند. علت اصلی بیماری، تخریب نورون های دوپامینرژیک بخش متراکم جسم سیاه در مغز میانی و کاهش غلظت دوپامین در پایانه های جسم مخطط است.ازآن­جا که افزایش مصرف اکسیژن با استرس اکسیداتیو همراه خواهد بود، مغز بافتی است که به علت نیاز زیاد به اکسیژن ، بیشتر در معرض آسیب های ناشی از استرس اکسیداتیو قرار می گیرد .استرس اکسیداتیو یکی از عواملی است که در تخریب نورون های دوپامینرژیک در بیماری پارکینسون نقش دارد. هم­چنین مطالعات آزمایشگاهی نشان دادند که سرم و مایع مغزی – نخاعی بیماران پارکینسونی سطوح بالاتری از IL-12 ، TNF-α ، IL-1β را دارا می باشد(19). از طرفی نورون­های دوپامینرژیک جسم سیاه به عوامل پیش برنده التهابی و میانجی های اکسیداتیوحساسیت بیشتری دارند . چون غلظت گلوتاتیون داخل سلولی در این نورون ها نسبت به سایر سلول ها کمتر است(4). مطالعات نشان داده است که صدمات ناشی از استرس اکسیداتیو و رادیکال های آزاد نقش مهمی در تخریب نورون های جسم سیاه دارد . برای پیشگیری و درمان بسیاری از بیماری ها از جمله پارکینسون مصرف آنتی اکسیدانت ها موجب کاهش خطر ابتلا می شود.کوآنزیم Q10 دارای خاصیت ثابت شده ی آنتی اکسیدانی و ضد رادیکال آزاد می باشد. دربخش سلولی بعد از ایجاد پارکینسون، برای سنجش مقداردرمان بیماری دونوع آزمون برای مشخص شدن بقای سلول های اولیه محیط کشت انجام گرفت.

کوآنزیم Q10 یکی از ناقل های انتقال الکترون در زنجیره تنفسی می باشد و می تواند با افزایش توان آنتی اکسیدانی و تولید آنزیم های آنتی اکسیدانی نقش به سزایی در حفاظت از غشاهای سلولی در مقابل رادیکال های آزاد داشته باشد . درمان با Q10 از آسیب نورودژنراتیو ناشی از رادیکال های آزاد تولید شده در مغز ، پیشگیری می کند (10). مصرف مکمل های Q10 به عنوان آنتی اکسیدانت در بهبود اثرات بیماری پارکینسون ، آلزایمر، آتاکسی فردریش و بیماری هانتینگتون و کاهش ریسک ابتلا به بیماری کرونر قلب موثر می باشد . و همچنین باعث کاهش استرس اکسیداتیو و التهاب ناشی از رژیم غذایی ایجاد کننده چاقی در کبد موش شده است (18). در مطالعه تجربی Ogura نشان داده شده است که مصرف کوآنزیمQ10 در آسیب کبد سگ ها با سیستئامین ، می تواند باعث جلوگیری از تولید رادیکال های آزاد و افزایش بقای حیوان شود(12) .مطالعات Beal و همکارانش نشان می­دهد که تیمار روزانه موش ها با دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن از کوآنزیم Q10 ، باعث افزایش فعالیت آنتی اکسیدانی در مغز شده و اثرات محافظتی برای نورون ها را دارد(2). Palmira  و همکارانش در سال 2001 نشان دادند که کوآنزیم Q10 میتوکندریایی می تواند باعث افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی بدن و کاهش آسیب های اکسیداتیو در رت های دیابتی گردد(5).Juan  و همکارانش در سال 2009 گزارش دادند که کوآنزیم Q10 باعث کاهش ایسکمی و آپوپتوزیز و آسیب های عصبی در مثانه خرگوش می­شود(15). نتایج مطالعه حاضر نشان داد مصرف کوآنزیم Q10 می تواند منجر به افزایش فعالیت و توان آنتی اکسیدانی گردد  و در پی آن موجب محافظت سلول از آسیب ناشی از بنیان های فعال اکسیژن می­گردد. نتایج این پژوهش پیشنهاد می کند مصرف کوآنزیم Q10 می تواند نقـش محفاظتی در برابر بیماری پارکینسون و بیماری های عصبی تحلیل برنده را داشته باشد. هم چنین در این مدل سلولی با کاهش آسیب حاصل از رادیکال های آزاد وکاهش مرگ نورون های عصبی ، اثرات محافظتی و ضد التهابی Q10مشخص شد. 

مراجع

.Aly, N. (2012). Reno-protective efficiency of coenzyme Q10 on adriamycin-induced nephro toxicity in rats. J Appl Sci Res, 8; 589.

2.Beal, MF., Matthews, RT., Tieleman, A., Shults, CW. (1998). Coenzyme Q10 attenuates the 1-methyl - 4- phenyl -1,2,3,6- tetra hydropyridine(MPTP) induced loss of striatal dopamine and dopaminergic axons in aged mice. Brain Res, doi:10.1016/S0006-8993(97)01192-X.

3.Blum, D., Torch, S., Lambeng, N., Nissou, M.-F., Benabid, A.-L., Sadoul, R. (2001). Molecular pathways involved in the neuro toxicity of 6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theory in Parkinson's disease. Progress in neurobiology, 65; 135-172.

4.Crane, F.L. (2001). Biochemical functions of coenzyme Q10. Journal of the American College of Nutrition, 20; 591-598.

5.De Luca, C., Kharaeva, Z., Raskovic, D., Pastore, P., Luci, A. (2012). Coenzyme Q10, vitamin E, selenium, and methionine in the treatment of chronic recurrent viral muco cutaneous infections. Nutrition, 28; 509-514.

6.Elbaz, A., Bower, J.H., Maraganore, D.M., McDonnell, S.K., Peterson, B.J., Ahlskog, J.E., Schaid, D.J. (2002). Risk tables for parkinsonism and Parkinson's disease. Journal of clinical epidemiology, 55; 25-31.

7.Hubble, J.P., Cao, T., Hassanein, R., Neuberger, J., Roller, W. (1993). Risk factors for Parkinson's disease. Neurology, 43; 1693-1693.

8.Lenaz, G., Fato, R., Castelluccio, C., Genova, M., Bovina, C., Estornell, E. (1993). The function of coenzyme Q10 in mito chondria. The clinical investigator, 71; S66-S70.

9.Lin, T. K., Liou, C. W., Chen, S. D., Chuang, Y. C., Tiao, M. M., Wang, P. W. (2009). Mito chondrial dysfunction and biogenesis in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Chang Gung Med J, 32; 589-599.

10.Mc Carthy, S., Somayajulu, M., Sikorska, M., Borowy-Borowski, H., Pandey, S. (2004). Paraquat induces oxidative stress and neuronal cell death; neuroprotection by water-soluble coenzyme Q10. Toxicol Appl Pharmacol, 201(1); 21-31.

11.McGeer, P.L., Mc Geer, E.G. (2004). Inflammation and neuro degeneration in Parkinson's disease. Parkinsonism & Related Disorders, 10; S3-S7.

12.Ogura, Y., Takagi, K., Kawarada, Y., Mizumoto, R. (1996). Patho physiological effect of hepatic ischemia and reperfusion after hepatectomy in dogs with obstructive jaundice, focusing on the effect of coenzyme Q10 and styrene-co-maleic acid superoxide dismutase. J. Gastroenterol, 31(3); 379-86.

13.Ostrowski, R., Piotrowski, P., Pańkowska, T., Smiałek, M. (1998). Evaluation of morphological changes after treatment with coenzyme Q10 (CoQ10) in endothelin-1 induced experimental ischemia in the rat. Folia neuropathologica, 36; 185-188.

14.Overvad, K., Diamant, B., Holm, L., Hølmer, G., Mortensen, S., Stender, S. (1999). Coenzyme Q 10 in health and disease. European Journal of Clinical Nutrition, 53; 764.

15.PubMed – NCBI NeurouroL Urodyn. 2009, 28 (4); 339 – 42. doi : 10.1002/nau.20662

16.Savica, R., Rocca, W.A., Ahlskog, J.E. (2010). When does Parkinson disease start? Archives of neurology, 67; 798-801.

17.Schapira, A.H. (2009). Neurobiology and treatment of Parkinson's disease. Trends in pharmacological sciences, 30; 41-47.

18.Sohet, FM., Neyrinck, AM., Pachikian, BD.,de Backer, FC., Bindels, LB., Niklowitz, P.(2009). Coenzyme Q10 supplementation lowers hepatic oxidative stress and inflammation associated with diet-induced obesity in mice. Biochem Pharmacol, 78(11); 1391-400.

19.Thoenen, H., Tranzer, J. (1968). Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxy dopamine. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Pharmakologie und Experimentelle Pathologie, 261; 271-288.

20.Veldman, B., Wijn, A., Knoers, N., Praamstra, P., Horstink, M. (1998). Genetic and environmental risk factors in Parkinson’s disease. Clinical neurology and neurosurgery 100; 15-26.

21.Zhen, R., Wenxiang, D., Zhaokang, S., Xinling, G., Huiming, H., Jingfeng, L. (1994). Mechanisms of brain injury with deep hypothermic circulatory arrest and protective effects of coenzyme Q10. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery, 108; 126-133.