بررسی تغییرات متابولیتی و آنزیمی اشک زنان در دوره قاعدگی

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 4، دوره 13، شماره 1 - شماره پیاپی 48، دی 1398، صفحه 13-23   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

وهب جعفریان^{* 1}؛ زهرا بیانی²

¹زیست شناسی دانشگاه زنجان زنجان ایران

²قران و احادیث واحد زنجان، دانشگاه ازاد اسلامی ، زنجان ایران

چکیده

زمینه و هدف: اشک انسان ترکیب پیچیده­ای از پروتئین­ها، آنزیم­ها، چربی­ها، متابولیت­ها و الکترولیت­ها است که افزون بر تمیز و شفاف نگه داشتن سطح چشم، در تغذیه چشم نقش دارد. هدف از این پژوهشبررسی تغییرات متابولیتی و آنزیمی اشک در زنان در دوره قاعدگی است
روش کار: دامنه سنی زنان مورد آزمایش 18 تا 24 سال بود و از سلامت جسمی و بینایی کامل و رژیم غذایی مشابهی در دوره یک ماهه پیش از نمونه­گیری برخوردار بودند. نمونه­های اشک زنان به عنوان تیمار در روز سوم قاعدگی و نمونه های شاهد سه روز پس از اتمام قاعدگی تهیه گردید. برخی از پروتئین­های اشک نیز تحت آنالیز توسطFPLC  وRP-HPLC  قرار گرفتند. در این پژوهش، تغییرات بیوشیمیایی از قبیل تغییر در آنزیم­های لیزوزیم، پراکسیداز، آلفا آمیلاز، تیروزیناز، و تغییر در متابولیت­هایی مانند گلوکز، فسفر و کلسیم موجود در اشک زنان در طول دوران قاعدگی و حالت طبیعی بررسی و مقایسه شد.
یافته ها: نتایج بیوشیمیایی نشان داد که میزان غلظت پروتئین­ها(کمّی و کیفی (SDS-PAGE)) و آنزیم­های لیزوزیم، پراکسیداز، تیروزیناز در زنان قاعده نسبت به حالت­های طبیعی آن­ها افزایش یافت، ولی میزان آلفاآمیلاز، گلوکز، فسفر، و کلسیم در اشک در دوره قاعدگی کمتر بود.
نتیجه­گیری: بنابر این پژوهش، کاهش گلوکز، فسفر و کلسیم موجود در اشک را می­توان به عنوان شاخصی در مطالعات مقایسه­ای و تشخیص طبی در زنان در شرایط قاعدگی در نظر گرفت.

اصل مقاله

چشم انسان به وسیله یک پوشش نازک مایع(لایه­ی اشک) پوشیده شده است. لایه­ی اشک چندین نقش ­اساسی در سیستم بینایی دارد که شامل شستشوی چشم و فراهم­کردن مواد غذایی و فاکتورهای رشد برای اپی­تلیوم می­شود و هم­چنین به عنوان سدی در برابر عفونت­های میکروبی محیط چشم به کار می­رود. اشک دارای سه لایه شامل لیپیدی، آبی و موسینی است که هر کدام از این لایه­ها ترکیبات گوناگونی دارند و نقش­های مختلفی را در چشم انجام می­دهند(8).نقش­های اصلی اشک شامل نگهداری سطحی صاف و هموار برای انعکاس نور، روان کردن پلک چشم، روان کردن پرده ملتحمه و قرنیه، تأمین مواد غذایی قرنیه، حذف مواد خارجی از قرنیه و پرده ملتحمه چشم، و دفاع سطح چشمی از پاتوژن­ها از طریق مواد ضد باکتریایی ویژه و غیر ویژه می­باشد(17). اشک­ها از 98 تا 99% آب همراه با 1 میلی‌گرم در لیتر پروتئین تشکیل شده است. مایع اشکی شامل نمک­ها، پروتئین­ها و لیزوزیم بوده و یکی از نقش­های آن نگهداری تونیسیته لایه اشک می­باشد(11). مایع ترشح شده توسط غدد لاکریمال در چشم محلول پیچیده­ای از یون­ها و پروتئین­ها است. پروتئین­های ویژه غده لاکریمال در غلظت­های بالا در اشک وجود دارند و شامل لاکتوفرین، لیپوکالین و لیزوزیم می­باشند. پروتئین­های آمیلاز، پراکسیداز، فعال کننده پلاسمینوژن، پرولاکتین، فاکتور رشد اپیدرمی و رتینول به میزان کمتری در اشک چشم وجود دارند(17). اشک را بر اساس سیستم تحریک به سه نوع: اشکی تحریکی، اشک پایه­ای(بدون تحریک) و اشک احساسی(اشک ناشی از ناراحتی، خوشحالی، ترس و غیره) تقسیم­بندی می­شود. ترکیب لیپیدهای موجود در اشک به طور قابل ملاحظه­ای در افراد مختلف متفاوت است(10). بیش از 60 ترکیب مختلف از پروتئین­های اشک انسان شناسایی شده است. چنین گزارش شده است که مقادیر نسبی پروتئین­های موجود در اشک یک شخص بسته به روش جمع­آوری متفاوت می­باشد. برخی از متابولیت­های اشک شامل گلوکز، پیرووات، لاکتات و اوره اشک شناسایی شده است(16). در اشک نیز الکترولیت­هایی مانند سدیم، کلر و پتاسیم وجود دارد. هم­چنین اشک انسان متأثر از حالات مختلف بدن قرار می­گیرد. داروهای سیستمیک بر سرعت جریان اشک و بر روی ترکیبات آن اثر می­گذارند(21). قاعدگی در زنان همراه با تغییر در میزان هورمون­های استروژن و پروژسترون رخ می­دهد. سطح هورمون استروژن در طی تخمک­گذاری و مرحله لوتئال افزایش می­یابد، در حالی که میزان هورمون پروژسترون کمی پیش از تخمک­گذاری افزایش و بلافاصله در مرحله لوتئال به سرعت کاهش می­یابد. در این دوران نیز زنان از لحاظ روحی در وضعیت نامتعادلی قرار دارند(7). تغییر در لایه اشک و فراسنجه­های مربوط به قرنیه از جمله انحنای قرنیه و ضخامت قرنیه نیز تحت تأثیر تغییرات هورمونی در طی دوره قاعدگی در زنان در چندین پژوهش گزارش شده است(21، 13، 10). افزون بر این، هورمون استروژن می­تواند باعث تغییر در عملکردهای فیزیولوژیک قرنیه چشم توسط بازجذب سدیم، جلوگیری از آب و در نتیجه ورم بافت مربوطه شود(6). تاکنون گزارشی بر روی برخی تغییرات بیوشیمیایی موجود در اشک در دوره قاعدگی نشده است. هدف از این پژوهش بررسی تغییرات بیوشیمیایی اشک شامل پروتئین­ها، متابولیت­ها و الکترولیت­های آن در زنان در دوره عادت ماهیانه و مقایسه آن با حالت طبیعی است تا بتوان در تشخیص­های طبی از نشانگرهای این تغییرات استفاده نمود.

مواد و روش­ها

نمونه­برداری از اشک

در این پژوهش، 30 نفر از دانشجویان دختر به طور تصادفی با دامنه سنی 18 تا 24 سال ساکن خوابگاه نرگس دانشگاه گیلان که از رژیم غذایی تقریباً یکسانی استفاده می­نمودند و سابقه بیماری خاصی نیز در مورد چشم­هایشان وجود نداشت، انتخاب شدند. نمونه­گیری در روزهای سوم دوره قاعدگی و سه روز بعد از دوره انجام شد. نمونه­ها پس از جمع­آوری به میکروتیوب­های 200 میکرولیتری منتقل و تا زمان انجام آزمایش در یخچال با دمای 20- درجه سلسیوس نگهداری شدند.

سنجش­های بیوشیمیایی

روش­های الکتروفورزی

برای بررسی میزان کیفی و کمّی پروتئین­های موجود در اشک زنان در دوره قاعدگی و حالت طبیعی از الکتروفورز SDS-PAGE، طبق روش لاملی(14) استفاده شد. رنگ­آمیزی ژل­ها با استفاده از کوماسی بریلینت بلو(250-G) انجام گرفت. زایموگرام آنزیم آلفا آمیلاز با استفاده از الکتروفورز به روش PAGE انجام شد.

تعیین غلظت پروتئین کل

غلظت پروتئین کل با استفاده از روش برادفورد(5) و رسم منحنی استاندارد در حضور آلبومین سرم گاوی محاسبه شد.

اندازه­گیری الکترولیت­ها و گلوکز اشک

اندازه­گیری فسفر بر اساس روش اسپکتروفتومتری انجام و جذب نمونه­ها در طول موج 630 نانومتر قرائت شد و میزان فسفر به روش زیر به دست آمد:

 

اندازه­گیری میزان کلسیم اشک بر اساس روش های اسپکتروفتومتری صورت گرفت و جذب نمونه­ها در 570 نانومتر قرائت شد و میزان کلسیم بر طبق رابطه مقابل به دست آمد.

 

 

برای اندازه­گیری گلوکز با استفاده از روش اسپکتوفتومتری در طول موج 546 نانومتر انجام گرفت و غلظت نمونه­ها از طریق معادله زیر محاسبه شد:

Glucose=

تعیین فعالیت آنزیم­ها

برای اندازه­گیری میزان فعالت آنزیم آمیلاز از روش جونگ استفاده و جذب نمونه ها در طول موج 540 نانومتردر حضور نمونه شاهد تعیین ‌شد(12). فعالیت آنزیم پراکسیداز بنابر روش سریری و همکاراناندازه­گیری و سرعت واکنش آنزیمی به­صورت تغییرات جذب علیه زمان (ΔA / min) در طول موج 510 نانومتر(مربوط به ماکزیمم جذب کروموژن - ضمیمه) ثبت گردید(18). جهت تعیین فعالیت آنزیمی، تغییرات جذب علیه زمان ΔA /min) یا (OD به عدد ثابت 58/6 تقسیم می­شود. برای سنجش فعالیت آنزیم تیروزیناز از سوبسترای دوپامین هیدروکلراید استفاده و تغییرات جذب بر زمان در طول موج 510 نانومتر محاسبه و با ضرب عدد حاصل در عدد ثابت 017/0 فعالیت آنزیمی به دست آمد(9). 

کروماتوگرافی

 برای آنالیز پروتئین­های موجود در نمونه­های اشک در دو حالت قاعدگی و طبیعی، از دستگاه HPLC(Waters Co. USA) استفاده شد. جهت انجام از دستگاه HPLC بعد از تعیین غلظت نمونه ها، 25 میکروگرم پروتئین را به ستون C18 با سرعت 700 میکرولیتر بردقیقه با حلال­های مورد استفاده شامل آب(80%)، متانول(10%)، استونیتریل(5%) و n-هگزان(5%) با شیب غلظتی برای مدت 60 دقیقه بارگذاری شده و با توجه به توانایی نرم­افزار GhromGate، از 4 طول موج280، 254، 220 و 214 نانومتر برای تشخیص پروتئین­ها استفاده شد. از آن­جا که استاندارد هیچ کدام از پروتئین­های موجود در اشک در اختیار نبود، بعد از به دست آوردن پیک­ها برای آن­که مشخص شود هر پیکی متعلق به کدام پروتئین است، از الکتروفورز استفاده شد. به طوری که در بخش Waste دستگاه HPLC  تک تک پیک­ها جمع­آوری، و جهت افزایش غلظت ترکیب در نمونه­های جمع شده این کار ده­ها مرتبه انجام شد، تا پروتئین­ها در الکتروفورز قابل مشاهده باشند.  از آن جایی که هیچ استانداردی مربوط به پروتئین لیزوزیم اشک وجود نداشت، بنابراین جهت تهیه نمونه استاندارد از FPLC استفاده شد. پس از انجام کروماتوگرافی، فعالیت آنزیم لیزوزیم در فرکشن­های هر پیک سنجیده و فرکشن­هایی که حاوی آنزیم لیزوزیم بودند به عنوان استاندارد در HPLC جهت تعیین محل دقیق پیک لیزوزیم مورد استفاده قرار گرفت.

نتایج

نتایج بررسی کیفی پروتئین اشک

نتایج آزمون ژل الکتروفورز  SDS-PAGE پروتئین­های موجود در اشک زنان در دوران قاعدگی و در حالت طبیعی در شکل 1 نشان داده شده است. در بررسی­های انجام شده با استفاده از الکتروفورز مشاهده شد که در هنگام قاعدگی میزان پروتئین­های اشک افزایش یافت. هم­چنین باندهای الکتروفورزی با استفاده از نرم افزار Total Lab مورد بررسی قرار گرفت(شکل 2).  نتایج مربوط به آنالیز پروتئین­های اشک نمونه­های شاهد(پس از قاعدگی یا حالت طبیعی) و تیمار(دوره قاعدگی) با استفاده از دستگاه HPLC در شکل3 نشان داده شده است. همان­گونه که در این مشخص شده است، پروتئین­ لاکتوفرین، لیزوزیم، و لیپوکالین در نمونه­های اشک موجود در زنان در دوره قاعدگی نسبت به حالت طبیعی افزایش یافت. نتایج الگوهای الکتروفورزی آلفا آمیلاز اشک نشان­دهنده وجود سه باند بود که در شکل4 مشخص می­باشد. مقایسه این باندها نیز با استفاده از نرم افزار Total Lab صورت گرفت. در تمامی نمونه­های مورد آزمایش، مقدار این آنزیم در اشک زنان در دوره قاعدگی کاهش یافت.

 

 

 

 

شکل1-  نمونه ژل الکتروفورز پروتئین­های موجود در اشک زنان در دوران قاعدگی و در حالت طبیعی با استفاده از بافر نمونه غیر احیایی و رنگ آمیزی با کوماسی بلو. مارکر پروتئینی SM0431 مورد استفاده قرار گرفت. شماره­های 2، 4 و 6 مربوط به نمونه­های اشک در دوره قاعدگی و شماره های 1، 3 و 5 مربوط به نمونه­های اشک در حالت طبیعی هستند.

 

بررسی تغییرات غلظت پروتئین تام، متابولیت­ها و الکترولیت­ها

نتایج آزمایش­های انجام گرفته در مورد میانگین غلظت کل پروتئین در جدول 1 آورده شده است. با استفاده از منحنی استاندارد، BSA و معادله خط، غلظت پروتئین کل(تام) در نمونه­های اشک در زنان در دوره قاعدگی و حالت طبیعی بررسی گردید. نتایج حاکی ازافزایش غلظت پروتئین تام در دوره قاعدگی می باشد. نتایج به دست­آمده نشان داد که غلظت گلوکز، فسفر و کلسیم در اشک زنان در دوره قاعدگی به طور چشم­گیری نسبت به نمونه­های مشابه در دوره پس از قاعدگی(حالت طبیعی) کاهش یافت، ولی غلظت پروتئین کل در دوره قاعدگی بیشتر از حالت طبیعی بود(جدول 1).

اندازه گیری فعالیت آنزیم­های اشک

در بررسی­های انجام شده میزان فعالیت آنزیم­های پراکسیداز، تیروزینار و لیزوزیم در نمونه­های موجود در اشک زنان در دوره قاعدگی نسبت به حالت طبیعی افزایش یافت(جدول 2).

 

 

 

 

شکل2- نتایج الکتروگرام نمونه 1 تا 6 ژل الکتروفورز. شماره­های 2، 4 و 6 مربوط به نمونه­های اشک در دوره قاعدگی و شماره های 1، 3 و 5 مربوط به نمونه­های اشک در حالت طبیعی هستند.

کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا(HPLC)

بررسی بیوشیمیایی پروتئین­های اشک با استفاده از دستگاه HPLC نشان داد که همانند روش برادفورد، غلظت پروتئین کل در اشک زنان در دوره قاعدگی نسبت به دوره پس از قاعدگی(حالت طبیعی) افزایش یافت. پس از به دست آوردن پیک­های کروماتوگرام، شناسایی پیک­ها، با تزریق نمونه و جمع­آوری آن­ها و تغلیظ نمونه­های مورد نظر، الکتروفورز نمونه­های فوق انجام گرفت. در نهایت دو پیک، یعنی پیک­های مربوط به لیزوزیم و لاکتوفرین تشخیص داده شدند. در این پژوهش، لیزوزیم انسانی از طریق FPLC نیز تخلیص و به عنوان استاندارد در HPLC مورد استفاده قرار گرفت

 

 

 

 

 

 

 

شکل3- مقایسه الکتروگرام(1) نمونه اول و دوم، (2) نمونه سوم و چهارم. نمونه پروتئین موجود در اشک زنان در دوره قاعدگی با خط سبز و در دوره پس از قاعدگی(حالت طبیعی) با خط قرمز رنگ نشان داده شده است.

 

 

شکل4- زایموگرام آنزیم آلفاآمیلاز اشک در زنان در دو دوره قاعدگی و پس از قاعدگی(حالت طبیعی). شماره­های 2، 4 و 6 مربوط به نمونه­های اشک در دوره قاعدگی و شماره های 1، 3 و 5 مربوط به نمونه­های اشک در دوره پس از قاعدگی هستند.

 

 

شکل5- الکتروگرام نمونه 1 تا 6 ژل مربوط به آنزیم آلفا آمیلاز(نگاره 4). شماره­های 2، 4 و 6 مربوط به نمونه­های اشک در دوره قاعدگی و شماره های 1، 3 و 5 مربوط به نمونه­های اشک در حالت طبیعی هستند.

 

 

جدول 1- میزان پروتئین کل و برخی عناصر موجود در اشک زنان در دوره قاعدگی و پس از قاعدگی(حالت طبیعی)

فسفر (mg%)	کلسیم (mg/dl)	گلوکز (mg/dl)	پروتئین کل (mg/mL)	مراحل نمونه­گیری
78/1	1/1	62//7	31/6	دوره قاعدگی
5/2	36/2	37/17	74/5	حالت طبیعی

 

جدول 2- میزان برخی آنزیم­های موجود در اشک زنان در دوره قاعدگی و پس از قاعدگی(حالت طبیعی)

لیزوزیم (µmol/min)	تیروزیناز (µmol/min)	پراکسیداز (µmol/min)	مراحل نمونه­گیری
0011/0	0021/0	00096/0	دوره قاعدگی
00082/0	0011/0	00038/0	حالت طبیعی

 

 

 

 

            شکل6- بررسی بیوشیمیایی پروتئین­های اشک با استفاده از دستگاه HPLC. (مشکی) نمودار مربوط نمونه اشک زنان در دوره قاعدگی و (قرمز) مربوط به دوره پس از قاعدگی (حالت طبیعی).

 

 

بحث و نتیجه گیری

 

لیزوزیم اشک دارای توانایی تجزیه کردن دیواره­های باکتریایی از طریق هضم آنزیمی مونوپلی ساکاریدهای بافتی آن می باشد. غلظت لیزوزیم در اشک به اندازه کافی بالااست تا برای فعالیت ضد باکتریایی مفید باشد. لیزوزیم بین 20 تا 40 % محتوای پروتئینی اشک را تشکیل داده و در اشک فراوان­تر از دیگر مایعات بدنی مانند بزاق، سرم و ادرار می باشد. هم­چنین این پروتئین قلیایی­ترین پروتئین اشک می باشد(8). بنابر پژوهش­های پیشین، تغییرات هورمونی در طی دوره قاعدگی در زنان موجب تغییر در لایه اشک و انحنا و ضخامت قرنیه می­شود(21، 10). افزون بر این، هورمون مرتبط با دوره قاعدگی مانند استروژن بر عملکردهای فیزیولوژیک قرنیه چشم اثر می­گذارد و باعث تغییر بازجذب سدیم می­شود(6). بنابر تحقیقات انجام­شده، پایدارای و کیفیت لایه اشک نقش مهمی در کیفیت نوری چشم دارد(16). در طی چرخه قاعدگی محتوای برخی از متابولیت­های خون از جمله گلوکز افزایش می­یابد(3). نتیجه مهم دیگر مطالعه حاضر این بود که پروتئین هایی مانند لاکتوفرین، لیپوکالین و لیزوزیم در ترکیب اشک در هنگام قاعدگی افزایش می­یابند. یکی از وظایف اصلی اشک حفاظت چشم در برابر میکرب­ها می­باشد. لایه میانی اشک شامل بسیاری از پروتئین­های ضد میکربی است که از مهم­ترین آن­ها ایمونوگلوبولین­ها(پادتن­ها)، سایتوکاین­ها، لیپوکالین، لاکتوفرین، لیزوزیم و دفنسین­ها می­باشند که توسط غدد موجود در چشم تولید می­شوند( اما این­که این پروتئین­ها از خون سرچشمه می­گیرند مورد سوال است(19).این پروتئین­ها از جمله پروتئین­های سیستم ایمنی ذاتی محسوب می­شوند که از سلول­های ایمنی ذاتی تولید و نقش ضد میکربی ایفا می­نمایند(15). مستندات و مشاهدات بسیاری وجود دارند که نشان می­دهند قاعدگی یک فرآیند التهابی است که با تغییرات اساسی در ساختار اندومتریال رحم به واسطه عملکرد لوکوسیت­های متفاوت درگیر است(2). تقریباً 40 درصد از سلول­های استرومال در فاز ترشحی چرخه قاعدگی(مرحله قبل از قاعدگی) را لوکوسیت­ها تشکیل می­دهند. افت هورمون­های استروژن و پروژسترون در نبود حاملگی و رخ دادن قاعدگی سبب تحریک فراخوانی و گسترش لوکوسیت­ها در اندومتر رحم می­شود(2). پاسخ­های ایمنی ایجاد شده توسط این لوکوسیت­ها که در مرحله قبل از قاعدگی رخ داده و شرایط را برای شروع قاعدگی فراهم می­کنند، اغلب ذاتی هستند و با افزایش چشمگیر ماکروفازها و نوتروفیل­ها و ماست سل­ها مشخص می­شوند. ماکروفازها و نوتروفیل­ها منع غنی پروتئین­های ضد میکربی مانند لاکتوفرین، لیزوزیم و دفنسین­ها می­باشند که حضورشان در طول قاعدگی که سد اپی­تلیالی اندومتر رحم تخریب می­شود، به دفاع علیه حمله میکربی کمک خواهد کرد. ماست سل­ها نیز با ترشح پروتئین­های تجزیه کننده به تخریب ماتریکس خارج سلولی سلول­های اپی­تلیالی رحم کمک می­کنند(15). در زمان قاعدگی افزون بر ایمنی ذاتی، ایمنی اکتسابی نیز فعال می­شود که یکی از مشخصه­های آن افزایش تولید پادتن­هایی مانند IgA و IgG می­باشد که توسط سلول­هایی با نام B سل تولید می­شوند(1). با وجود این­که مقدار پروتئین کل خون در طی قاعدگی و حالت طبیعی تقریباً یکسان است اما مطالعات نشان داده­اند که مقدار این پادتن­ها در خون و در طول قاعدگی نسبت به مرحله تخمک­گذاری بسیار افزایش می­یابند(1). سلول­های ترشح­کننده پادتن در مرحله قبل از تخمک­گذاری حدوداً چهار برابر هستند(1،19). با در کنار هم گذاشتن این اطلاعات می­توان به این نتیجه رسید که در زمان قاعدگی، تغییرات فاکتورهای ایمنی موجود در خون و اشک می­توانند هم­سو باشند زیرا از طرفی ترکیبات خون و همین­طور اشک هر دو تحت تاثیر هورمون های استروژن و پروژسترون قرار می­گیرند(4،20) و از سوی دیگر پروتئین­های اشک می­توانند از خون سرچشمه بگیرند(19). روی هم رفته، بنابر پژوهش حاضر میزان مواد بیوشیمیایی محتوای اشک تحت تأثیر دوره قاعدگی در زنان قرار می­گیرد. به طوری­که میزان غلظت پروتئین­ها(کمّی و کیفی) و آنزیم­های لیزوزیم، پراکسیداز و تیروزینار در زنان قاعده نسبت به حالت­های طبیعی آن­ها افزایش می­یابد. از سوی دیگر، میزان آلفاآمیلاز، گلوکز، فسفر، و کلسیم در اشک در دوره قاعدگی کمتر می­شود. بر اساس یافته­های این پژوهش، کاهش گلوکز، فسفر و کلسیم موجود در اشک را می­توان به عنوان شاخصی در مطالعات مقایسه­ای و تشخیص طبی در زنان در شرایط قاعدگی در نظر گرفت.

مراجع

1.Beagley, KW., Gockel, CM. (2003). Regulation of innate and adaptive immunity by the female sex hormones oestradiol and progesterone. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 38(1); 13-22.

2.Berbic, M., Fraser, IS. (2013). Immunology of normal and abnormal menstruation. Women’s Health, 9(4); 387-395.

3.Bennal, AS., Kerure, SB. (2013). Glucose handling during menstrualcycle. International Journal of Reproduction, Contraception, Obstetrics and Gynecology, 2(3); 284-287.

4.Bhatia, A., Sekhon, HK., Kaur, G. (2014). Sex hormones and immune dimorphism. The Scientific World Journal, 2014; 150-159.

5.Bradford, MM. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Journal of Analytical Biochemistry, 72; 248-254.

6.Bowman, WC., Rand, MJ. (1980). Textbook of pharmacology(No. 2nd ed.). Blackwell Scientific Publications.

7.Cavdar, E., Ozkaya, A., Alkin, Z., Ozkaya, HM., Babayigit, MA. (2014). Changes in tear film, corneal topography and refractive status in premenopausal women during menstrual cycle. Contact Lens and Anterior Eye, 37(3); 209-212.

8.Herbaut, A., Liang, H., Denoyer, A., Baudouin, C., Labbé, A. (2019). Tear film analysis and evaluation of optical quality: A review of the literature. Journal francais d'ophtalmologie, 42(2); 21-35.

9.Gutteridge, JM., Paterson, SK., Segal, AW., Halliwell, B. (1981). Inhibition of lipid peroxidation by the iron-binding protein lactoferrin. Biochemical Journal, 199(1); 259-261.

10.Giuffre, G., Di Rosa, L., Fiorino, F., Bubella, DM., Lodato, G. (2007). Variations in central corneal thickness during the menstrual cycle in women. Cornea, 26(2); 144-146.

11.Inada, K., Baba, H., Okamura, R. (1982). Studies of human tear proteins--1. Analysis of tears from normal subjects by crossed immunoelectrophoresis. Japanese Journal of Ophthalmology, 26(3); 314-325.

12.Jung, D.H. (1980). Preparation and application of procion yellow starch for amylase assay. Clinica Chimica Acta, 100(1); 7-11.

13.Kiely, PM., Carney, LG., Smith, G. (1983). Menstrual cycle variations of corneal topography and thickness. American Journal of Optometry and Physiological Optics, 60(10); 822-829.

14.Laemmli, UK. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227; 680–685. 

15.King, A.E., Critchley, H.O., Kelly, R.W. (2003). Innate immune defences in the human endometrium. Reproductive Biology and Endocrinology, 1(1); 116.

16.Montes-Mico, R., Cervino, A., Ferrer-Blasco, T., Garcia-Lazaro, S., Madrid-Costa, D. (2010). The tear film and the optical quality of the eye. Ocul. Surf, 8;185-192.

17.Paulsen, FP., Berry, MS. (2006). Mucins and TFF peptides of the tear film and lacrimal apparatus. Progress in histochemistry and cytochemistry, 41(1); 1-53.

18.Sariri, R., Sajedi, RH., Jafarian, V. (2006). Inhibition of horseradish peroxidase activity by thiol type inhibitors. Journal of molecular liquids, 123(1); 20-23.

19.Schnetler, R., Gillan, WDH., Koorsen, G. (2012). Immunological and antimicrobial molecules in human tears: a review and preliminary report. African Vision and Eye Health, 71(3); 123-132.

20.Sharma, A., Porwal, S., Tyagi, M. (2018). Effect of oral contraceptives on tear film in reproductive age group women. International Journal of Reproduction, Contraception, Obstetrics and Gynecology, 7(3);  861.

21.Versura, P., Fresina, M., Campos, EC. (2007). Ocular surface changes over the menstrual cycle in women with and without dry eye. Gynecological endocrinology, 23(7); 385-390.