ارزیابی پارامترهای اسپرمی و سطح استرس اکسیداتیو در مردان نابارور آستنوتراتوزو اسپرمی تحت درمان با ان- استیل سیستئین

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 3، دوره 13، شماره 2 - شماره پیاپی 49، فروردین 1399، صفحه 27-38   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

راحیل جنتی فر¹؛ کاظم پریور^{* 1}؛ محمد حسین نصر اصفهانی²؛ نسیم حیاتی رودباری¹

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

²پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فناوری تولید مثل، اصفهان، ایران

چکیده

زمینه و هدف:مردان نابارور دارای سطوح بالاتری از گونه های فعال اکسیژن(ROS)  نسبت به مردان بارور هستند.سطح بالایROS  در اسپرم می تواند باعث اختلال در عملکرد اسپرم، آسیب DNA اسپرم و کاهش توان تولید مثلی در مردان شود. در این مطالعه اثران-استیل سیستئین(NAC) برمیزان کیفیت اسپرم، سلامت کروماتین، سطح استرس اکسیداتیو(ROS)و هم­چنین ارتباط بین پارامترهای اسپرم در افرادآستنوتراتوزو اسپرمی بررسی شده است.
روش کار: این مطالعه در مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم، انجام شد. بیماران، شامل 50 مرد نابارور مبتلا به آستنوتراتوزوسپرمی بودند که به مدت 3 ماه به صورت خوراکی(600 میلی گرم در روز)ان - استیل سیستئین دریافت کردند. پس از درمان پارامترهای اسپرم براساس سازمان بهداشت جهانی 2010، سلامت کروماتین به روش TUNL و کرومایسینA3 و میزان استرس اکسیداتیو با رنگ آمیزیH2DCFDA  در اسپرم با وضعیت پیش درمان مقایسه شدند.
یافته‌ها:بعد از درمانبا ان- استیل سیستئین، پارامتر های اسپرمی یافت(05/0>P).میزان قطعه قطعه شدن DNA و کمبود پروتامین در مقایسه با قبل از درمان، کاهش داشته است(05/0>P). سطح استرس اکسیداتیوبه طور معنا داری نسبت به قبل از درمان کاهش یافت. ارتباط معنی داری بین سطحROS ، تحرک و مورفولوژی غیر طبیعی در اسپرم ها مشاهده شد(05/0>P).
نتیجه‌گیری:تجویز ان – استیل سیستئین می تواند پارامترهای اسپرم و وضعیت اکسید کننده / آنتی اکسیدانی را در مردان نابارور بهبود بخشد.

کلیدواژه‌ها

ناباروری؛ ان- استیل سیستئین؛ استرس اکسیداتیو؛ آستنو تراتوزو اسپرمی

اصل مقاله

ناباروری به عنوان عدم توانایی بچه دار شدن پس از 1 سال مقاربت بدون جلوگیری توسط زوجین در سن تولیدمثلی می باشد. براساس گزارشات سازمان بهداشت جهانی (WHO) 15% زوج ها درگیر مشکل ناباروری بوده که در این میان نسبت کل ناباروری با علت مردانه (Male factor) حدود 46% می باشد(23). یکی از مهم­ترین دلایل ناباروری مردان اثرات منفی ناشی از استرس اکسیداتیو می­باشد. اسپرم بسیار مستعد ابتلاء به استرس اکسیداتیو است زیرا غشاء سلولی آن غنی از اسید های چرب غیر اشباع بوده و در نتیجه بیشتر در معرض آسیب های القاء شده توسط اکسیژن و پراکسیداسیون لیپیدی قرار می گیرد(22). علاوه بر این اسپرم بالغ به دلیل از دست دادن بخش زیادی از سیتوپلاسم خود طی فرآیند اسپرماتوژنز، فاقد آنزیم های سیتوپلاسمیک و مکانیسم های دفاعی آنتی اکسیدانی می باشد(23). عامل اصلی ایجاد استرس اکسیداتیو تولید بیش از حد گونه های واکنشی اکسیژن (Reactive Oxigen Species) یا ROS می باشد که به عنوان عامل مخرب و آسیب رسان به سلول ها و بافت ها شناخته شده است(1). استرس اکسیداتیو زمانی رخ می ­دهد تولید ROS بیش از مکانیسم های دفاعی آنتی اکسیدانی طبیعی بدن باشد و باعث صدمه به بیومولکول­ها مانند لیپیدها، پروتئین‌ها و DNA می‌شود. شواهد نشان می­دهند که در حال حاضر آسیب اسپرم به واسطه ROS یک آسیب شناسی مشترک معنی دار در 30-80  درصد از موارد است(2). اتیولوژی آسیب DNA اسپرم چند عاملی است: ممکن است به دلیل عوامل داخلی(به عنوان مثال کمبود پروتامین، سطوح گونه های فعال اکسیژن اضافی و آپوپتوزیس)، و یا عوامل خارجی شامل داروها، شیمی درمانی، سیگار کشیدن، التهاب دستگاه تناسلی، افزایش دمای بیضه(مثلاً حمام گرم، سونا و مشاغل جوشکاری، نانوایی، رژیم غذایی بد، استفاده از الکل، چاقی، رانندگی طولانی مدت و واریکوسل) باشد(12). افراد نابارور دارای آستنوتراتواسپرمی(کاهش تحرک و مورفولوژی اسپرم) تحت درمان به روش IVF یا ICSI به علت آسیب شدید اسپرم، جنین‌های حاصله از کیفیت مناسبی برخودار نبوده و در صورت انتقال این جنین‌ها میزان حاملگی در آنان نسبت به افراد با آسیب کمتر اسپرم، کاهش می‌یابد و این خانواده‌ها به علت هزینه‌های درمانی سنگین، با مشکلات روحی – روانی زیادی دست به گریبان هستند(12). بنابر این، بررسی آسیب‌های DNA اسپرم مخصوصاً در مردان نابارور می‌تواند به استراتژی های درمانی جدید کمک نماید و میزان موفقیت روش های کمک باروری(ART)  را افزایش دهد (21) .استراتژی درمانی با استفاده از آنتی اکسیدان ها به دو روش انجام میگیرد1) خوراکی (Oral)  برای مدت چند ماه قبل از شروع سیکل  ART. 2) In Vitro که به صورت مکمل در داخل محیط کشت در طی پروتکل ART. این دو روش استفاده از آنتی اکسیدان ها به ترتیب باعث به حداقل رساندن منابع درونی (Endogenous) و بیرونی (Exogenous) تولید کننده ROS  می شوند. بنابر این آنتی اکسیدان ها در ART نقش مهم و کلیدی بازی می کنند به طوری که در مردان نابارور تحت درمان با روش های IVF یا ICSI ، سطوح بالای ROS سمینال با مورفولوژی اسپرم، میزان زنده مانی اسپرم و درصد لقاح رابطه منفی نشان داد در حالی که سطوح آنتی اکسیدان سمینال همبستگی مثبتی با میزان لقاح داشت(3). ان- استیل سیستئین( NAC ) از مشتقات پایدار اسید امینه سیستئین است که گروه تیول این ماده اثر آنتی اکسیدانی داشته و قادر به خنثی سازی رادیکال های آزاد است )10). محققان بر این باورند که عمل آنتی اکسیدانی ان – استیل سیستئین از توانایی آن در تحریک سنتز GSH منشا می گیرد و سطح GSH  درون سلولی را حفظ می­کند و سبب پالایش  ROS می شود. ان – استیل سیستئین به سرعت د- استیله شده و به سیستئین تغییر می کند. بنابراین، ممکن است با فراهم کردن سوبسترای سنتزGSH  سطح GSH را افزایش دهد(13، 10). در واقع به عنوان یک عامل مهم در حفاظت از ساختمان بیولوژیکی سلول ها در برابر رادیکال های آزاد محسوب می گردد(4). مطالعه محققی به نام Halil Ciftci و همکارانش در سال) 2009( بر روی ان –استیل سیستئین به عنوان یک آنتی اکسیدان بر بیماران اولیگوزو اسپرمی نشان داد که سه ماه پس از مصرف mg/kg/day 600 از این دارو به طور روزانه باعث افزایش تحرک و هم­چنین کاهش وزیسکوزیته در این بیماران گردید. در ادامه تحقیق مشخص گردید که میزان ROS  در سطح سرمی کاهش یافت(7). بنابراین هدف از این مطالعه بررسی میزان کیفیت اسپرم(پارامترهای اساسی اسپرم)، سلامت کروماتین، سطح استرس اکسیداتیو و هم­چنین ارتباط درصد ROS با پارامترهای اسپرمی می باشد که در مردان نابارور آستنوتراتوزومی پس از درمان با NAC مورد بررسی قرار می گیرد.

موادوروش ها

نوع مطالعه حاضر، کاربردی است. پس از تأئید طرح در کمیته اخلاقی، رضایتنامه آگاهانه اخذ و اطلاعات بیماران(نام، نام خانوادگی، سن، مدت زمان ازدواج و غیره ) به صورت محرمانه نگهداری شد. این مطالعه به روش مورد شاهدی است که با نمونه گیری تصادفی از بین 50 بیمار مرد نابارور(آستنوتراتوزواسپرمی) در محدوده سنی 20-40 سال که توسط پزشک متخصص ارولوژیست تایید شده و برای درمان به مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم مراجعه کردند، انتخاب شدند. مردانی که دارای واریکوسل، سابقه جراحی واریکوسل، بیماری سیستمیک و یا در حال مصرف دارو برای بیماری سیستمیک، سابقه شیمی درمانی یا پرتو درمانی، مشکلات آناتومیکی در اندام تناسلی از جمله آتروفی بیضه، تعداد کم اسپرم(الیگو) یا آزوسپرمی، درمان با آنتی آندروژن یا آندروژن یا تستوسترون، درمان با مهار کننده های آروماتاز یا آنتی استروژن، درمان با داروهای ضد افسردگی باشند، از مطالعه حذف شدند. افراد مورد مطالعه ان- استیل سیستئین را با تجویز پزشک روزانه سه قرص( NAC) به صورت 200 میلی گرم روزانه، به مدت سه ماه  مصرف کردند گروه کنترل همین بیماران قبل از مصرف دارو می باشند.  نمونه مایع منی این افراد قبل و بعد از مصرف داروی NAC در فاصله 3-4 پس از مقاربت جنسی جمع آوری شد. هر نمونه پس از ارسال به آزمایشگاه، مدت 20 دقیقه برای مایع شدگی در دمای اتاق(Liquefaction)  قرار گرفت. سپس آنالیز مایع منی بر اساس استانداردها و معیارهای سازمان بهداشت جهانی (8)، به صورت دستی مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان آسیب DNA از طریق روش TUNEL، بررسی میزان پروتامین از طریق رنگ آمیزی CAM3 و سطح استرس اکسیداتیو به روش رنگ آمیزیH2DCFD  انجام گرفت. این پژوهش در مرکز کارآزمایی بالینی با کد IRCT20170830035998N4 ثبت شده است .

ارزیابی پارامترهای اسپرمی

جهت بررسی پارمترهای اسپرمی(غلظت، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری و بر اساس سازمان استاندارد جهانی(2010) صورت گرفت. شمارش اسپرم ها از بر حسب میلیون بر لیتر توسط لام نئوبار انجام شد. بررسی میزان تحرک اسپرم ها بر اساس (WHO2010) اندازه گیری شد. درصد تحرک کل اسپرمی باید کمتراز 40% و حرکت پیشرونده (a+b)  کمتر از 32% باشد .برای بررسی مورفولوژی نرمال اسپرم ها از روش رنگ آمیزی پاپانیکولا استفاده شد(8). در رنگ آمیزی پاپانیکولا، سر به رنگ آبی و قطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی در می آید. جهت بررسی مورفولوژی اسپرم، ابتدا از هر نمونه گسترش تهیه شد سپس به صورت یک جا رنگ آمیزی پاپانیکولا انجام شد. برای هر نمونه یک لام فیکس شده از اسپرم تهیه گردیده و پس از رنگ آمیزی 200 اسپرم توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 بررسی شد.

ارزیابی آسیب DNA با روش TUNEL

میزان آسیب DNA با استفاده ازروش TUNEL ( Apoptosis Detection SystemFluorescein, Promega, Mannheim, Germany) بررسی گردید. ابتدا مایع منی دوبار با بافر فسفات سالین PBS= Phosphate Buffer Saline    شستشو داده شده و پس از تهیه اسمیر بر روی لام و فیکس با پارافرمالدهید %4 ، در معرض هوا خشک می شود.  کیت TUNEL شرکت پرومگا )آلمان( خریداری شد و طبق دستور العمل آن، اسلایدها رنگ آمیزی شدند. در این روش، رنگ فلئورسنت توسط آنزیم rTdT به انتهای قطعات شکسته DNA اتصال می یابد و DNA،fluorescein-12-dUTP  نشان دار می کند. رنگ سبز فلوئورسنت مشاهده شده در ناحیه خلفی سر اسپرم نشانگر اسپرم ها با آسیب  DNA رنگ قرمز نشانگر اسپرم ها با DNA سالم هستند.  در هر نمونه در حدود 500 اسپرم با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنت (BX51, Olympus, Japan  با بزرگنمایی 100 بررسی گردید.

ارزیابی کمبود پروتامین :رنگ آمیزی کرومایسین A3

کرومایسین A3 به عنوان یک فلوروکروم در سایتو ژنتیک استفاده می شود. از آن جایی که این ماده به طور خاص به نواحی غنی از گوانین – سیتوزین اتصال یافته و با جایگاه های مشابه پروتامین در DNA رقابت می کند، بنابراین شدت رنگ CAM3 بیانگر کمبود پروتامین در اسپرم می باشد. این تکنیک مشخص کننده نقص در بسته بندی کروماتین، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته است. در این روش شستشوی مایع منی با PBS توسط سانتریفوژ 3000 دور به مدت 5 دقیقه انجام می شود سپس،50 میکرولیتراز اسپرم های را با 50 میکرولیتر محلول فیکساتیو کارنوی( متانول + اسید استیک) در حرارت 4 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه فیکس و سپس 30-20 میکرولیتر ازاسپرم های فیکس شده روی لام قرار داده اسمیر تهیه می گردد. لام در دمای اتاق خشک شده.100-70 میکرولیتر محلول کرومایسین A3 روی لام در محیط تاریک به مدت 20 دقیقه قرار می گیرد. آنالیز میکروسکوپی لام ها با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنت Olympus  (BX51,Tokyo,Japan) و با استفاده از فیلترهای 20±520 نانومتر و ارزیابی 500 اسپرم در هر لام و بررسی کمبود پرو تامین در هر بار در نمونه ها انجام گرفت. در ضمن بررسی هر فیلد نباید بیش از 40 ثانیه طول بکشد. درصد اسپرم های با رنگ زرد درخشان به عنوان  CMA3⁺ محاسبه شد( اسپرم های ⁺CMA3 اسپرم هایی است که کمبود پروتامین دارند).

ارزیابی سطح استرس اکسیداتیو (ROS)

در این مطالعه ارزیابی اسپرم های ROS مثبت با استفاده از رنگ H2DCFDA ( (DCFH - DA: 2’, 7’-dichlorodihydrofluoresceindiacetat( شرکت (Sigma Co, USA و آنالیز با دستگاه فلوسایتومتری انجام شد. این نشانگر، حساسیت بالایی نسبت بهH2O2  دارد. همان طور که قبلاً در مطالعه کیانی و همکاران(14) توضیح داده شده است رنگ به طور فعال به سلول وارد شده و با عمل استراز سلولی، گروه های دی استات از هم شکافته شده و ترکیب غیر فلوئورسنت DCFH تشکیل می شود. در حضور پراکسید هیدروژن رنگ DCF به DCFH  اکسید می شود و رنگ فلوئورسنت سبز از خود ساطع می کند. این ترکیب قادر به خروج از سلول نیست و با دستگاه فلوسایتومتری قابل ارزیابی است.

تحلیل آماری

داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزار آماری 21  SPSSآنالیز شدند. در این آنالیز از آزمون آماریpaired sample Test  و محاسبه ضریب همبستگی پیرسون استفاده شده و 05/0 > P-valueبه عنوان معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

ابتدا خصوصیات بالینی بیماران مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت که در جدول 1 نشان داده شده است. در تجزیه و تحلیل داده ها، هیچ تفاوت معنی داری از نظر شاخص توده بدنی(BMI) در گروه درمانی با NAC  در مقایسه با قبل از مصرف دارو وجود نداشت(05/0

 

 

جدول1-مقایسه میانگین شاخص توده بدنی قبل و بعد ازدرمان با NAC  در فاصله سنی مردان نابارور آستنو تراتوزو اسپرمی( بین 40-25 سال)

فاکتور اندازه گیری شده	تعداد	قبل از درمان NAC	بعد از  درمان NAC	P-value
شاخص توده بدنی	50	66/1±19/29	63/1 ±13/29	05/0<P

 

 

مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از درمان با NAC

حجم نمونه مایع منی قبل از درمان با NAC  ، 88/0 ± 58/3 بود که بعد از درمان به32/1± 02/4 افزایش یافت(05/0>P). میانگین غلظت اسپرم قبل از درمان80/5±52/46 و بعد از درمان51/6±06/54 گزارش شد(05/0>P). میزان تحرک کل اسپرم ها و تحرک پیشرونده اسپرمی بعد از درمان نسبت به قبل افزایش معنی داری را نشان می دهد(05/0>. P درصد ناهنجاری های مورفولوژی اسپرم که در شکل(4-1) نشان داده شده است قبل از درمان با NAC ، 66/1 ±12/98 بود که به 16/1± 2/94 کاهش یافت که از لحاظ آماری معنی دار است(05/0>P).

مقایسه سلامت DNA  قبل و بعد از درمان با NAC

نمودار 1 نشان دهنده درصد آسیبDNA  به روش TUNEL است که بعد از مصرف داروی آنتی اکسیدان NAC  به طور معنی داری کاهش یافته است (34/1±14/15 vs.47/2 ±34/19 )( 05/0>P). در روش  TUNELکه با میکروسکوپ فلوئورسنت میزان DNA Fragmentation  اندازه گیری شده است درصد اسپرم­هایی که بالاتر از 15 % DFI را نشان داده اند غیر طبیعی می باشند. در این تکنیک اسپرم های با حضور آسیب DNA توسط ماده فلوئورسنت به رنگ سبز قابل مشاهده است( شکل1).

مقایسه کمبود پروتامین قبل و بعد از درمان با NAC

محتوای کمبود پروتامین طبیعی در گروه درمانی قبل از مصرف دارو 09/1± 33/47 بوده و بعد از مصرف دارو 28/1± 77/42 می باشد که اختلاف میانگین مشاهده شده معنی دار است(05/0>P). کرومایسین A3  (CMA3) به عنوان یک فلوروکروم در سایتو ژنتیک استفاده می شود. از آن جایی که این ماده به طور خاص به نواحی غنی از گوانین – سیتوزین اتصال یافته و با جایگاه های مشابه پروتامین در DNA رقابت می کند، بنابراین شدت رنگ CAM3 بیانگر کمبود پروتامین در اسپرم می باشد. این تکنیک مشخص کننده نقص در بسته بندی کروماتین، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته است. درصد اسپرم های با رنگ زرد درخشان به عنوانCMA3+ محاسبه شد. اسپرم­های+ CMA3 اسپرم هایی است که کمبود پروتامین دارند.

مقایسه سطح ROS  قبل و بعد از درمان با NAC

 کاهش معنی داری در میزان و سطح استرس اکسیداتیو( ROS) در اسپرم افراد نابارور آستنوتراتوزو اسپرمی بعد از مصرف داروی  NAC مشاهده شد. سطح استرس اکسیداتیو با استفاده از رنگ آمیزی DCFH-DA  و تکنیک فلوسایتومتری اندازه گیری شد که نشان داده شده است که سطح  ROS از(89/2±55/34) به(68/3±22/26) کاهش یافت(05/0>P)(نمودار3).مقایسه ارتباط میزان سطح استرس اکسیداتیو و پارامترهای اسپرمی

آزمون همبستگی پیرسون مشخص کرد که بین میزان سطح  ROSو میزان تحرک و مورفولوژی اسپرم ها ارتباط معناداری می تواند وجود داشته باشد. نتایج حاصل از همبستگی در جدول3 آمده است. این آزمون نشان می­دهد که بین میزان سطح ROS و درصد تحرک اسپرم رابطه معکوس معنادار وجود دارد، هم چنین بین میزان سطح ROS و درصد مورفولوژی غیرنرمال اسپرم همبستگی مستقیم معنادار وجود دارد.

 

 

 

 

 

 

جدول 2-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از درمان با  NAC

فاکتور اندازه گیری شده	قبل از درمان NAC	بعد از  درمان NAC	P-value
حجم (ml)	88/0 ± 58/3	32/1± 02/4	05/0>P
غلظت اسپرمی( ×106 )	80/5±52/46	51/6±06/54	05/0>P
تحرک  کل اسپرمی(%)	20/5±42/36	91/5±18/458	05/0>P
تحرک پیشرونده اسپرمی( (%)(a+b	81/1±60/20	63/1±54/24	05/0>P
مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم(%)	66/1 ±12/98	16/1± 2/94	05/0>P

 

 

 

 

 

 

تفاوت معنی داری بین قبل و بعد از درمان NAC در پارامترهای اسپرمی مشاهده شد که از لحاظ آماری معنی داراست (05/0>P).

 

نمودار 1- بررسی میزانآسیب DNA  به روش TUNEL قبل و بعد از درمان با NAC .

میزان DNA Fragmentation  بعد از مصرف داروی NAC  به طور معنی داری کاهش یافته است(05/0>p).

                                            

                                     

A                                                                                                                                            B

شکل1- بررسی میزان شکست   DNAدر اسپرم با انجام روشTUNEL .در شکلA  میزان شکستDNA  قبل از درمان با NAC  را نشان می دهد و در شکل B میزان شکست DNA بعد از درمان با  NACاست(رنگ سبز فلوئورسنتنشان دهنده اسپرم هایی با آسیب DNA می باشد).

 

نمودار2- بررسی میزان کمبود پروتامین قبل و بعد از مصرف NAC. .

این نمودار نشان می دهد که بعد از درمان با NAC میزان کمبود پروتامین کاهش یافته است (05/0>P).

 

 

 

                                                                                          

     

 

 

A                                                                                               B

شکل2-بررسی کمبود پروتامین  با رنگ آمیزی کرومایسین A 3: اسپرمهابارنگزردفلوئورسنت درخشاندرناحیهخلفیسر مثبت      CMA3+نشانگراسپرمهاباکمبودپروتامین است .سر منفینشانگراسپرمهابا CMA3- رنگزردکمرنگپروتامینطبیعیهستند .در شکل A  میزان کمبود پروتامین قبل از درمان با NAC را نشان می دهد و در شکل B میزان کمبود پروتامین بعد از درمان با NAC است.

 

مقایسه ارتباط میزان سطح استرس اکسیداتیو و پارامترهای اسپرمی

آزمون همبستگی پیرسون مشخص کرد که بین میزان سطح  ROSو میزان تحرک و مورفولوژی اسپرم ها ارتباط معناداری می تواند وجود داشته باشد. نتایج حاصل از همبستگی در جدول3 آمده است. این آزمون نشان می­دهد که بین میزان سطح ROS و درصد تحرک اسپرم رابطه معکوس معنادار وجود دارد ،هم­چنین بین میزان سطح ROS و درصد مورفولوژی غیرنرمال اسپرم همبستگی مستقیم معنادار وجود دارد.

 

 

 

 

 

 

نمودار3- مقایسه سطح ROS در اسپرم قبل و بعد از درمان با NAC، مقایسه میزانROS نشان می دهد که بعد از درمان با NAC کاهش معنی داری مشاهده می شود(05/0>P).

 

جدول3-ارتباط معنی دار بین سطح ROS و میزان تحرک و اسپرم های غیر طبیعی

پارامترها		ROS
		R	p
تحرک اسپرم(%(	قبل	0.319-	0.02
	بعد	0.386. -	0.002
مورفولوژی غیرنرمال اسپرم(%)	قبل	0.301	0.03
	بعد	0.323	0.01

 

                                                                         

A                                                                    B                             

شکل3-Aارتباط معنی دار مستقیمی بین سطح ROS و مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم وجود دارد .B: ارتباط معنی دار  معکوسی بین سطح ROS و تحرک اسپرم وجود دارد

 

 

 

بحث ونتیجه گیری

 

امروزه رادیکال های آزاد اکسیژنی(ROS) و مباحث مرتبط با آن، جایگاه ویژه ای را در تحقیقات و درمان بسیاری از بیماری ها پیدا کرده اند، به گونه ای که در خصوص اثرات این مولکول های بیوشیمیایی و چگونگی عملکرد آن ها بر سلول های بدن، تحقیقات گسترده ای در انجام است. طی سال های اخیر در زمینه باروری اثرات مثبت و منفی رادیکال های آزاد اکسیژنی مورد توجه متخصصان این حوزه قرار گرفته و نتایج به دست آمده بیانگر نقش کلیدی این مولکول های فعال در فرایند تولید مثل و باروری است(11).  بسیاری از محققان بر این باورند که استفاده از آنتی اکسیدان درمانی می تواند بر روند درمانی زوج های نابارور تاثیرات مطلوبی بر جای می­گذارد. در بررسی های مختلف آنتی اکسیدان های مختلف با غلظت های گوناگون و به صورت ترکیبی با سایر آنتی اکسیدان ها یا ترکیبات غذایی استفاده شده و عوامل مرتبط با ناباروری و میزان تاثیر و بازدهی آنتی اکسیدان روی آنها ارزیابی شده است(14) . ان – استیل سیستئین (NAC)، آنتی اکسیدان دارای تیول است که از میزان تنش اکسایشی می کاهد.   NACنسبت به گلوتاتیون و سیستئین برتری زیستی دارد بنابراین می توان بیان کرد که ان – استیل سیستئین نوعی آنتی اکسیدان قوی برای پاکسازی کردن رادیکال های آزاد می باشد(10، 8). در مطالعه حاضر پارامترهای اسپرمی افراد آستنوتراتوزو اسپرمی که به مدت سه ماه تحت درمان با داروی NAC قرار گرفته بودند نسبت به قبل از مصرف این دارو مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج این مطالعه نشان داد که پارامترهای اساسی اسپرمی نسبت به قبل از مصرف دارو بهبود معنی داری داشته است(جدول 1). نتایج نشان داد میزان تحرک کلی، حرکت پیشرونده اسپرم(a+b) و مورفولوژی نرمال به میزان معنی داری افزایش یافته است(جدول 1). مطابق با نتایج فوق، صفری نژاد و همکاران در سال 2010 نشان دادند که مصرف این دارو می تواند پارامترهای اساسی اسپرمی از جمله غلظت، تحرک و مورفولوژی نرمال را بهبود ببخشد(20). هم چنین در تحقیق انجام شده توسط Ciftici در سال 2009 نشان داد که غلظت اسپرم ها در افراد نابارور بعد از سه ماه مصرف داروی NAC به طور معنی داری افزایش یافته است(7). هم چنین تاثیر  NAC بر روی غلظت اسپرم ها در مردان نابارور بعد از عمل واریکوسل نیز به اثبات رسیده است(5). در مطالعه حاضر میزان آسیب DNA( DNA fragmentation) در روش TUNEL نشان داد که بعد از مصرف داروی NAC به مدت سه ماه به طور معنی داری کاهش یافته است( نمودار1و شکل 1). درمطالعه ای که Lopes  و همکارانش در سال) 1998( بر روی اثربخشی ان-  استیل سیستئین بر روی پارامترهای اسپرم انجام دادند، نشان دادند میزان آسیب به DNA  در شرایط آزمایشگاهی(in vitro) به میزان قابل توجهی کاهش یافت  که این امر را مرتبط با کاهش در گونه های فعال اکسیژن (NOS) دانستند (15).از جمله روش های متعدد برای ارزیابی کروماتین اسپرم استفاده از رنگ های فلوئورسنت می باشد . رنگ فلوئورسنت کرومومایسین A3 در شیار کوچک DNA به توالی های GC متصل می­شود. بیانچی و همکارانش در سال 1993 این رنگ آمیزی را به عنوان روش مفید جهت تشخیص کمبود پروتامین و وجود بریدگی درDNA  معرفی کردند(6). کمبود پروتامین بر ناهنجاری های فراساختاری کروماتین تاثیر گذار است(19). قابل توجه است که درصد اسپرم های CMA3 مثبت در بیماران نابارور افزایش نشان می دهد. به علاوه بین رنگ آمیزی CMA3 اسپرم و نتایج باروری نیز مشخص شده است. کمبود پروتامین یکی از دلایل اساسی عدم موفقیت در باروری به هنگام استفاده از تکنیک های کمک باروری از جمله ICSI است(19). در این مطالعه همان طور که در نمودار(2)و شکل (2) ملاحظه می شود، محتوای غیرطبیعی پروتامین DNA سه ماه پس از مصرف داروی NAC نسبت به قبل از مصرف دارو کاهش معنی داری وجود دارد و درصد بهبودی حاصل شده (improvement) در محتوای طبیعی پروتامین DNA به خوبی بعد از درمان مشاهده می شود. در مطالعه حاضر، ارتباط معنی داری بین کمبود پروتامین و میزان فراگمنتاسیون DNA در فراد نابارور آستنو تراتوزو اسپرمی مشاهده شد. در تایید این پژوهش در مطالعه ای که نصر و همکارانش در افراد مبتلا به واریکوسل انجام دادند ، نشان دادند که در افراد مبتلا به واریکوسل بعد از عمل واریکوسلکتومی مصرف NAC  باعث شد که اسپرم های دارای کمبود پروتامین به طور قابل توجهی بهبود یابند (16). این بدان معنا است، یکی از عواملی که در پتانسیل باروری بیماران تاثیر دارد در سطح هسته سلول اسپرماتید می باشد و بهبودی محتوای طبیعی پروتامین پس از استفاده از آنتی اکسیدان ها می تواند باعث کاهش آسیب یا شکستگی DNA شود(17).در مطالعه ای که Oeda و همکارانش در سال)1997( انجام دادند، نشان دادند که تیمار با ان – استیل سیستئین در شرایط آزمایشگاهی  (in vitro)باعث افزایش پارامترهای اسپرمی از جمله افزایش میزان حرکت اسپرم ها و هم چنین افزایش واکنش آکروزمی در اسپرم ها گردید و پس از 20 دقیقه انکوباسیون با ان- استیل سیستئین سطح ROS  ها به طور معنی داری کاهش یافت. این مطالعه امیدهای را برای بهبود  پارامترهای اسپرمی درشرایط آزمایشگاهی برای بیماران آستنوتراتوزواسپرمی فراهم می آورد(18). نتایج مطالعه ما در رابطه با سطح ROS قبل و بعد از درمان با NAC  نشان داد که سطح  ROS بعد از درمان به طور قابل توجهی کاهش یافت. هم چنین ارتباط معنی داری بین سطح ROS و پارامترهای اسپرمی(تحرک و موفولوژی غیر نرمال اسپرم ها وجود داشت که نشانگر تاثیر میزان استرس اکسیداتیو بر عملکرد اساسی اسپرم ها و در نتیجه میزان باروری خواهد داشت. با توجه به خاصیت آنتی اکسیدانی NAC از جمله : 1)پاکسازی رادیکال های هیدروکسیل 2) افزایش تولید گلوتاتیون 3) کاهش باندهای دی سولفید و در نتیجه کاهش وزیسکوزیته مایع منی و موکوس که برای باروری اهمیت دارد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد که NAC می تواند بر روی پارامترهای اسپرمی، سلامت کروماتین DNA و کاهش میزان استرس اکسیداتیو تاثیر مثبت داشته باشد و پتانسیل باروری را در افراد نابارور آستنوتراتوزواسپرمی بهبود ببخشد. با این حال، مطالعات بیشتری برای مکانیسم های تنظیمی بیان ژن و ارتباط با پارامترهای اسپرمی نیاز است، که با شناسایی این مکانیسم ها ممکن است بتواند منجر به پیشرفت اهداف درمانی جدید در بیماران آستنوتراتوزو اسپرمی شود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از پرسنل سخت کوش مرکز فوق تخصصی مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی قم که ما را در انجام این مطالعه یاری کردند، تشکر و قدردانی می شود.

مراجع

1.Agarwal, A., Said, TM. (2003). Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human reproduction update, 9(4); 331-45.

2.Agarwal, A., Saleh, RA., Bedaiwy, MA. (2003). Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertility and sterility, 79(4); 829-43.

3.Agarwal, A., Sekhon, LH. (2010). The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility. Human Fertility, 13(4); 217-25.

4.Aruoma, OI., Halliwell, B., Hoey, BM., Butler, J. (1989). The antioxidant action of N-acetylcysteine: its reaction with hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid. Free Radical Biology and Medicine, 6(6); 593-7.

5.Barekat, F., Tavalaee, M., Deemeh, MR., Bahreinian, M., Azadi, L., Abbasi, H. (2016). A preliminary study: N-acetyl-L-cysteine improves semen quality following varicocelectomy. International Journal of Fertility & Sterility, 10(1); 120.

6.Bizzaro, D., Manicardi, GC., Bianchi, P., Bianchi, U., Mariethoz, E., Sakkas, D. (1998). In-situ competition between protamine and fluorochromes for sperm DNA. Molecular human reproduction. 1998;4(2):127-32.

7.Ciftci, H., Verit, A., Savas, M., Yeni, E., Erel, O. (2009). Effects of N-acetylcysteine on semen parameters and oxidative/antioxidant status. Urology, 74(1); 73-6.

8.Cooper, TG., Noonan, E., Von Eckardstein, S., Auger, J., Baker, H., Behre, HM. (2010). World health organization reference values for human semen characteristics. Human reproduction update, 16(3); 231-45.

9.De Vries, N., De Flora, S. (1993). N‐acetyl‐l‐cysteine. Journal of Cellular Biochemistry, 53(S17F); 270-7.

10.Dodd, S., Dean, O., Copolov, DL., Malhi, GS., Berk, M. (2008). N-acetylcysteine for antioxidant therapy: pharmacology and clinical utility. Expert Opinion on Biological Therapy, 8(12); 1955-62.

11.Gharagozloo, P., Aitken, RJ. (2011). The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy. Human Reproduction, 26(7); 1628-40.

12.Halliwell, B., Gutteridge, JM. (2014). Free radicals in biology and medicine: Oxford University Press, USA.

13.Kelly, GS. (1998). Clinical applications of N-acetylcysteine. Alternative medicine review: a journal of clinical therapeutic, 3(2); 114-27.

14.Lanzafame, FM., La Vignera, S., Vicari, E., Calogero, AE. (2009). Oxidative stress and medical antioxidant treatment in male infertility. Reproductive Biomedicine Online, 19(5); 638-59.

15.Lopes, S., Jurisicova, A., Sun, J-G., Casper, RF. (1998). Reactive oxygen species: potential cause for DNA fragmentation in human spermatozoa. Human Reproduction (Oxford, England), 13(4); 896-900.

16.Nasr‐Esfahani, MH., Abasi, H., Razavi, S., Ashrafi, S., Tavalaee, M. (2009). Varicocelectomy: semen parameters and protamine deficiency. International journal of andrology, 32(2); 115-22.

17.Ni, K., Steger, K., Yang, H., Wang, H., Hu, K., Chen, B. (2015). 295 Sperm protamine mRNA ratio and DNA fragmentation index represent reliable clinical biomarkers for men with varicocele after microsurgical varicocele ligation. European Urology Supplements, 14(2); e295.

18.Oeda, T., Henkel, R., Ohmori, H., Schill, WB. (1997). Scavenging effect of N‐acetyl‐L‐cysteine against reactive oxygen species in human semen: a possible therapeutic modality for male factor infertility? Andrologia, 29(3); 125-31.

19.Razavi, S., Nasr‐Esfahani, MH., Mardani, M., Mafi, A., Moghdam, A. (2003). Effect of human sperm chromatin anomalies on fertilization outcome post‐ICSI. Andrologia, 35(4); 238-43.

20.Safarinejad, MR., Safarinejad, S. (2009). Efficacy of selenium and/or N-acetyl-cysteine for improving semen parameters in infertile men: a double-blind, placebo controlled, randomized study. The Journal of Urology, 181(2); 741-51.

21.Showell, MG., Mackenzie‐Proctor, R., Brown, J., Yazdani, A., Stankiewicz, MT., Hart, RJ. (2014). Antioxidants for male subfertility. Cochrane Database of Systematic Reviews, 12; 56-60.

22.Tremellen, K. (2008). Oxidative stress and male infertility—a clinical perspective. Human reproduction update,14(3);243-58.

23.Tvrdá, E., Kňažická, Z., Bárdos, L., Massányi, P., Lukáč, N. (2011). Impact of oxidative stress on male fertility—a review. Acta Veterinaria Hungarica, 59(4); 465-84.