اثر ترمیم کنندگی عصاره آبی- الکلی کرم خاکی بر زخم پوستی در ماهی طلایی (Carassius auratus gibelio)

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

دوره 16، شماره 2 - شماره پیاپی 62، اردیبهشت 1402، صفحه 65-82   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

مهران عربی^{* 1}؛ علیرضا شمس آبادی²

¹گروه علوم جانوری٬ دانشکده علوم پایه٬ دانشگاه شهرکرد٬ شهرکرد، ایران

²گروه علوم جانوری٬ دانشکده علوم پایه٬ دانشگاه شهرکرد٬ شهرکرد، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: فرآیند ترمیم زخم شامل مجموعه‌ای از روندهای برنامه‌ریزی شده مولکولی و سلولی است. هدف از انجام مطالعه حاضر ارزیابی توان ترمیم‌کنندگی عصاره آبی- الکلی کرم‌‌های خاکی (EBE) در بهبودی زخم تجربی در پوست ماهیان طلایی (Carassius auratus gibelio) بوده است.

مواد و روش‌ها: ماهیان طلایی (با سه تکرار مستقل و 14 قطعه در هر گروه) برای یک دوره 14روزه˓ به 5 گروه تقسیم-بندی شدند: 1) شاهد منفی (بدون زخم)٬ 2) شاهد کاذب (شم): زخم با تیمار حلال EBE: مخلوط روغن کرچک و وازلین سفید٬ 3) شاهد مثبت: زخم با تیمار پماد فنی‌تویین سدیم 1 درصد˓ 4) زخم با تیمار پماد حاوی 1 میلی‌گرم از EBE٬ 5) زخم با تیمار پماد حاوی 10 میلی‌گرم از EBE. در ادامه˓ ارزیابی‌های ماکروسکوپی و میکروسکوپی˓ سنجش میزان کلاژن (محتوی هیدروکسی‌پرولین) در پوست˓ همراه با تعیین فعالیت لیزوزیمی در سرم خون ماهیان به انجام رسید.

نتایج: بررسی نتایج نشان داد که تیمار 1 میلی‌گرم از EBE˓ موجب افزایش قابل ملاحظه‌‌ای در قطر اپیدرم٬ سنتز و آرایش رشته‌های کلاژن˓ کاهش التهاب در درم˓ و نیز در میزان هیدروکسی‌پرولین پوست و فعالیت لیزوزیمی سرم خون نسبت به سایر گروه‌ها شده است.

نتیجه‌گیری: نتایج ما نشان داد که کاربرد EBE با دوز 1 میلی‌گرم در گرم می‌تواند به عنوان یک ترکیب دارویی موثر در ترمیم زخم پوستی در جانوران به ویژه آبزیان مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

ماهی؛ زخم؛ کرم خاکی

اصل مقاله

مقدمه

       فرآیند ترمیم زخم (Wound healing) برای حفظ استحکام و یکپارچگی پوست به منظور مقابله با از دست­دادن آب بدن٬ خونریزی و دفع هجوم میکروب­های بیماری­زا مهم و حیاتی بوده و دربرگیرنده روندهای پیوسته و تنظیم­شده سلولی و مولکولی˓ همراه با مهاجرت­های گسترده سلولی در بافت آسیب دیده است. وسعت زخم، محل ایجاد آن و تاثیر عوامل محیطی٬ همگی می­توانند موجب تغییر در روند ترمیم زخم و مدت زمان انجام آن گردند. ترمیم زخم شامل چهار مرحله اصلی انعقاد خون٬ التهاب٬ تکثیر٬ و بازآرایی بافتی است. مرحله خونریزی و انعقاد خون کوتاه بوده و در مرحله التهاب در نتیجه تاثیر تنظیم­کننده­های شیمیایی موضعی٬ رگ­های خونی گشاد و نفوذپذیر شده که در نتیجه آن مهاجرت سلول­های چند­هسته­ای سیستم ایمنی از خون به موضع زخم جهت مقابله با میکروب­ها به انجام می­رسد. در ادامه٬ افزایش سنتز و تاثیر فاکتورهای رشد و سایتوکین­ها در موضع زخم موجب تکثیر و بازآرایی­های سلولی و بافتی (سنتز کلاژن، تشکیل بافت گرانوله، بازسازی اپیتلیوم و انقباض زخم) و به دنبال آن بهبودی سریع­تر زخم شده که گاه هفته­ها تا ماه­ها به طول می­انجامد (1˓2). از نظر ماندگاری٬ زخم­ها بر دو نوع حاد و مزمن هستند. زخم مزمن همراه با رویدادهای پاتوفیزیولوژیکی متعدد بوده و لذا مدت زمان بیش­تری را برای درمان و ترمیم کامل نیاز دارد (3).

      مطالعات نشان داده که به دلیل وجود موارد عفونی فراوان در محیط­های آبی˓ ترمیم زخم در آبزیان می­بایست با سرعت کافی به انجام برسد (4). پوست در ماهیان به عنوان یک اندام چندکاره در فرآیندهایی نظیر دریافت­ حس٬ تنفس٬ تنظیم اسمزی و دفع وارد عمل گردیده و سلول­های اپیتلیالی آن در ترمیم زخم مشارکت فعال دارند (5˓6). از آن جایی که اپیدرم پوست در ماهی در جلوگیری از بروز شوک اسمزی و نفوذ میکروب­ها نقش مهمی دارد لذا ترمیم سریع و کامل زخم­های پوستی به منظور ادامه فعالیت جانور و کاهش مرگ و میر˓ ضروری و حیاتی است. مواد ضدعفونی­کننده مثل آگلوتینین، لیزوزیم، پروتیین واکنش­دهنده C، آنزیم پراکسیداز و پپتیدهای ضد­میکروبی متنوع در مایعات بین سلولی اپیدرم و موکوس ترشح شده بر روی اپیدرم ماهیان وجود دارند که نقش مهمی را در مقابله با عوامل بیماری­زا ایفا می­کنند. زخم­ پوستی در ماهیان شایع بوده و عوامل زیادی نظیر عفونت­های میکروبی و انگلی، جراحات ناشی از برخورد با وسایل صیادی˓ حمله پرندگان شکاری، حمل و نقل، مسمومیت­ شیمیایی، کمبود اسید­های چرب و ویتامین­ها در ایجاد آن دخالت دارند. در این میان اپیدرم با ایجاد پوشش در محل زخم˓ در برقراری هومئوستازی و ادامه­یابی فرآیندهای زیستی بدن ماهی نقش تعیین­کننده­ای دارد (4˓7). وجود عفونت­های باکتریایی موجب طولانی شدن مدت زمان ترمیم زخم شده که در بیش­تر موارد با درمان­های آنتی­بیوتیکی قابل رفع است (8). ترمیم زخم در ناحیه درم و عضلات زیر آن به مراتب طولانی­تر از ناحیه اپیدرم است (9). نتایج مطالعات نشان داده شد که ساختار درم در ماهیانی که ویتامین  Cبیشتری دریافت نموه­اند˓ به دلیل مشارکت این ویتامین در سنتز رشته­های کلاژن٬ بهبودی بیشتری داشته است (10). در ماهیانی که جراحت­های پوستی­شان پس از آلودگی با عوامل میکروبی به زخم­های عمیق تبدیل شده٬ میزان مرگ و میر به طور معنی­داری افزایش می­یابد (11). در سال 2003 مشخص گردید که افزودن مقادیر کافی از ویتامین­ C به جیره غذایی ماهی قزل­آلا رنگین­کمان موجب تسریع ترمیم زخم­های برشی در آنان می­شود. این ویتامین در شکل­گیری بافت جدید و بازآرایی­های سلولی در محل زخم٬ نقش مهمی را برعهده دارد (12). نوع بخیه­زنی نیز در درمان زخم پوستی و سرعت ترمیم آن موثر است به طوری که استفاده از بخیه ساب­کوتیکولار در مقایسه با انواع دیگر بخیه­ها در زخم برشی پوست ماهی طلایی نتایج بهتری را به دنبال داشته و موجب تسریع ترمیم زخم شده است (13).

 فنی­تویین (Phenytoin) نوعی داروی ضد­صرع بوده که به صورت موضعی نیز به عنوان پماد با نام تجاری Dilantin برای تسریع در ترمیم زخم‌ پوستی، زخم­ پای دیابتی، زخم بستر، زخم عمیق و جای عمل استفاده می­شود. مصرف موضعی فنی­تویین باعث افزایش ماده خارج سلولی و پروتیین بافت پیوندی، کاهش فعالیت کلاژناز˓ افزایش سنتز کلاژن˓ کاهش ادم˓ افزایش فعالیت فیبروبلاستی و شکل­گیری بافت گرانوله شده که تمامی این اثرات منجر به تسریع ترمیم زخم می­شوند (14˓15).      هم­چنین فنی­تویین میزان آنژیوژنز (رگ­زایی) را به کمک فاکتورهای رشد FGF و VEGF در محل ترمیم زخم افزایش می­دهد (16). کاربرد پماد فنی­تویین موجب بهبودی زخم پای دیابتی و کاهش زمان بستری این بیماران می­شود (17). در سال 1393 تیم تحقیقاتی ما نشان داد که می­توان از پماد فنی­تویین در ترمیم زخم برشی در پوست ماهی طلایی استفاده موثر نمود (18). در مطالعه حاضر نیز پماد فنی­تویین سدیم 1 درصد گروه شاهد مثبت (با تاثیر مثبت بر روند ترمیم زخم) جهت تحریک روند ترمیم زخم و مقایسه آن با سایر گروه­های تیماری مورد استفاده قرار گرفته است.

      در بسیاری از کشورها از درمان­های سنتی شامل عصاره­های جانوری و گیاهی جهت تسریع روند ترمیم زخم استفاده می­شود. وسعت زخم، محل ایجاد آن و تاثیر عوامل محیطی موجب تغییر در روند ترمیم زخم شده که با تاثیر عصاره­های مذکور قابل تعدیل است. بر اساس برآوردهای سازمان بهداشت جهانی (WHO)˓ بیش از نیمی از مردم دنیا به اثرگذاری درمان­های سنتی اعتقاد داشته و از آنان استفاده می­کنند (19˓20). از قرن­ها پیش در کشورهای شرق آسیا به ویژه چین از دیلانگ (Dilong) یا عصاره کرم­های خاکی (EBE) به عنوان یک عامل ضد تب، ضد تشنج، ادرارزا، ضد­ آلرژی و کاهش­دهنده فشار خون استفاده می­­شده است (21). کرم­های خاکی با ایجاد تغییر در خواص فیزیکوشیمیایی خاک٬ تغییر در جمعیت­های میکروبی٬ برقراری جریان­های آبی و هوارسانی کافی موجب افزایش حاصلخیزی خاک می­شوند. کرم­های خاکی شامل بیش از 7000 گونه بوده و مصارف غذایی و پزشکی دارند (22˓23). مولکول­های زیستی متعددی با فعالیت فیبرینولیتیکی٬ میتوژنیک٬ ضد انعقادی٬ آنتی­اکسیدانی٬ ضد تب٬ ضد میکروبی و ضد سرطان در عصاره کرم­های خاکی وجود دارند که قدرت درمانگری این عصاره را در طب سنتی تضمین نموده­اند (24). از خواص آنتی­اکسیدانی و نیز تنظیم­کنندگی عصاره کرم­های خاکی در درمان زخم معده و محافظت از کبد در موش ­رت استفاده شده است (25˓26). بررسی­ها نشان داده که خواص ضد­میکروبی مایع سلومی کرم خاکی مربوط به وجود ترکیبات فعال نظیر فتیدین­ها و لیزوزیم در آن بوده که بر علیه طیف گسترده­ای از میکروب­های بیماری­زا در سطح بدن کرم­های خاکی وارد عمل می­شوند (23).

 

      مولکول­های زیستی موجود در EBE در روند ترمیم زخم مداخله نموده و موجب تسریع در بهبود زخم می­شوند (27). از سوی دیگر مشخص شده که با تاثیر ماکرومولکول­های موجود در کمپلکس گلیکوپروتیینی G-90 از این عصاره میزان سنتز فاکتورهای رشد EGF و FGF را در موضع زخم افزایش داده که در نتیجه آن ترمیم زخم با سرعت و کیفیت بهتری به انجام می­رسد (28). در همین راستا٬ Mataušić-Pišl و همکاران توان ترمیم­کنندگی زخم­ها را برای EBE در مدل جانوری رت به اثبات رسانده­اند (29). در سال 2001 نشان داده شد که خاصیت آنتی­اکسیدانی کمپلکسG-90  موجب محافظت از سلول­های اپیتلیال و فیبروبلاست در برابر آسیب­های اکسیداتیو ناشی از اثر پراکسید ­هیدروژن در محیط کشت می­شود (30).

  از آن جایی که تاکنون در منابع علمی استفاده از EBE در ترمیم زخم­های پوستی آبزیان گزارش نشده٬ مطالعه حاضر به منظور ارزیابی قدرت ترمیم­کنندگی EBE بر زخم تجربی ایجاد شده در پوست ماهی طلایی (Carassius auratus gibelio) طراحی و به انجام رسیده است.

مواد و روش­ها

طرح آزمایش

      در مطالعه حاضر از ماهیان طلایی (Carassius auritus gibelio) با میانگین طول 3±16سانتی­متر و محدوده وزنی 2±42 گرم به عنوان مدل جانوری استفاده شده است. برای ایجاد سازش با محیط جدید٬ ماهیان به مدت یک هفته در داخل آکواریوم­های شیشه­ای 50 لیتری با ابعاد 30×40×80 سانتی­متر محتوی آب شهری کلرزدایی شده با دمای 20-18 درجه سانتی­گراد همراه با پمپاژ دایمی اکسیژن و غذای کافی و دوره­های 12 ساعته نور-تاریکی به دور از هر گونه استرس نگهداری شدند. در طول آزمایشات هر 5 روز یک بار آب آکواریوم­ها تعویض می­گردید.

            برای ایجاد زخم تجربی˓ محلول بنزوکایین هیدروکلراید در اتانول (1 گرم در 10 میلی­لیتر) به عنوان داروی بیهوشی استفاده گردید. 1 گرم از محلول نهایی در 1 لیتر آب شهری وارد شد. در ادامه ماهیان جداگانه در محلول بیهوشی قرار داده شدند. بیهوشی ماهیان با مشاهده عدم حرکت در اوپرکولوم (سرپوش آبششی) مشخص گردید. در ادامه ماهیان را از آب خارج نموده و در امتداد خط میانی شکم˓ در بخشی از پوست جلوی باله­ شکمی (با پوست نرم و فلس­های ریز) به کمک پانچ بیوپسی یک زخم برشی تمام ضخامت (Full-thickness) ایجاد گردید. برای ریکاوری˓ جریان آب به درون دهان و آبشش­ ماهیان وارد گردید که در نتیجه آن حرکات آرام و منظم اوپرکولوم ماهی برقرار شد (13).

       در این مطالعه در قالب یک طرح کاملا تصادفی ماهیان طلایی (با سه تکرار مستقل) در 5 گروه تقسیم­بندی شدند: 1) شاهد منفی (بدون زخم)٬ 2) شاهد کاذب یا شم (Sh): زخم تیمار شده با حلال EBE شامل مخلوط روغن کرچک و وازلین سفید (1:1)٬ 3) شاهد مثبت (Ph): زخم تیمار شده با پماد فنی­تویین سدیم 1 درصد˓ 4) زخم تیمار شده با پماد حاوی 1 میلی­گرم از EBE در گرم حلال٬ 5) زخم تیمار شده با پماد حاوی 10 میلی­گرم از EBE در گرم حلال. تمامی گروه­ها شامل 14 قطعه ماهی بودند. دوره زمانی برای انجام تیمارها و بررسی مراحل ترمیم زخم 14روز بود.

 

استخراج عصاره آبی- الکلی کرم­های خاکی (EBE)    

        کرم­های خاکی قرمز کالیفرنیایی (Eisenia fetida) در محلول کلرید سدیم 10 درصد برای یک ساعت˓ کشته و ضدعفونی شدند. در ادامه کرم­ها با قیچی خرد و به کمک روش اولتراسوند هوموژن گردیدند. به مخلوط حاصله 40 میلی­لیتر از متانول و کلروفرم (1:1) اضافه شد و برای یک شب در یخچال نگهداری گردید. پس از اضافه­سازی آب مقطر و ایجاد محلول شیری­رنگ˓ سانتریفیوژ با 4000 دور برای 10 دقیقه به انجام رسید. در لوله­های سانتریفیوژ سه لایه ایجاد شد که لایه جامد و تیره­رنگ وسط (EBE) به کمک دستگاه خشک­کننده انجمادی (Freez-drying) در دمای40- درجه سانتی­گراد برای 7 ساعت خشک و از آن پودر تهیه گردید (31). 

تهیه پماد

     در این مطالعه حلال EBE شامل 1 گرم مخلوط روغن کرچک و وازلین سفید (1:1) بود. برای تهیه پماد بر پایه EBE˓ مقادیر 1 و 10 میلی­گرم از EBE را در مقدار کمی از روغن کرچک حل نموده و سپس با وازلین سفید به خوبی مخلوط نمودیم. در هر نوبت 1/0 گرم از پماد به کمک اسکالپل استریل بر روی زخم­ها گسترده می­شد.

بررسی­های ماکروسکوپی (تغییرات سطح بیرونی زخم­ها)

       برای ارزیابی تغییرات سطح زخم­ها (انقباض زخم) از کولیس دیجیتالی استفاده شد. میزان تغییرات سطح بیرونی زخم­ها با فواصل زمانی هر دو روز یک ­بار پس از ایجاد زخم (روز صفر) برای 14روز مورد اندازه­گیری قرار گرفت. در ادامه با استفاده از نتایج اندازه­گیری­ها و با استفاده از فرمول­های زیر˓ درصد ترمیم زخم­ها در روزها و تیمارهای مختلف محاسبه و مقایسه گردید:

 

 

 × 100

   درصد مساحت زخم - 100 = درصد ترمیم زخم در یک روز مشخص

 

 

بررسی­های میکروسکوپی

      جهت بررسی تغییرات و بازآرایی­های بافتی˓ نمونه­های زخم در پایان 14 روز از پوست ماهیان گروه­های مختلف برداشت گردید. نمونه­ها توسط محلول فرمالین 10 درصد (با یک ­بار تعویض پس از 24 ساعت) فیکس گردیدند. در ادامه از نمونه­ها قالب­ پارافینی تهیه شد. به کمک میکروتوم از قالب­ها برش­های 5 میکرونی تهیه گردید. در تهیه اسلایدهای بافتی٬ تمامی مراحل از جمله رنگ­آمیزی به روش هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) توسط سیستم تمام ­اتوماتیک به انجام رسید. در ادامه٬ اسلایدهای بافتی به کمک میکروسکوپ نوری معمولی مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفتند.

 سنجش محتوی کلاژن پوست (میزان هیدروکسی­پرولین زخم)

      هیدروکسی­پرولین (HP) به عنوان شاخص محتوی کلاژن تام در چرخه سنتز و تغییر (Turn over) کلاژن در پوست

 

است. برای شروع به کمک یک پانچ بیوپسی بخشی از زخم به قطر 5 میلی­متر را جدا نموده و در ازت مایع فریز نمودیم. در ادامه نمونه­ها را برای تمام شب در 2 میلی­لیتر از 2N HCl و در دمای 110 درجه سانتی­گراد وارد نمودیم تا هیدرولیز گردند. روند هیدرولیز توسط 2.5N NaOH خنثی و با آب مقطر دوبار تقطیر به میزان 40 برابر رقیق گردید. به 2 میلی­لیتر از این محلول˓ 1 میلی­لیتر از 0.05 M chloramine-T اضافه و برای 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. به محلول قبلی به میزان 1 میلی­لیتر از محلول 3.15 M perchloric acid افزوده شد و پس از آن برای 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. در ادامه کار˓ 1 میلی­لیتر از محلول 20% p-dimethylaminobenzaldehyde در n-پروپانول به محلول مرحله قبل اضافه شد و سپس 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. در انتها˓ محلول نهایی را سرد گردید و میزان تغییرات جذب نورریHP در طول موج 557 نانومتر ثبت شد (32).

سنجش فعالیت لیزوزیمی سرم خون

      سرم نمونه­های خون گرفته شده از سیاهرگ دمی به کمک سانتریفیوژ جدا گردید. برای این سنجش از روش لیزوپلیت استفاده گردید. 50 میکروگرم در میلی­لیتر از باکتری Micrococcus lysodeikticus در آگاروز 1 درصد با ضخامت 4 میلی­متر بر روی پلیت­ها ریخته شد و بر روی آنان حفراتی با قطر 2 میلی­متر ایجاد گردید. در هر حفره 10 میکرولیتر از نمونه­های سرم خون ماهیان طلایی ریخته شد (سه تکرار مستقل). در ادامه˓ برای شروع فعالیت باکتری­ها˓ پلیت­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد برای 20 ساعت قرار داده شدند. به منظور مشخص­سازی دقیق قطر مناطق روشن (بدون رشد باکتری)، پلیت­ها به برای یک دقیقه با محلول متیل­ ویوله 25/1 درصد رنگ­آمیزی شدند. در انتها قطر مناطق روشن بر اساس میلی­متر اندازه­گیری و مقایسه گردیدند (33).   

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها

      در این مطالعه داده­های حاصل به صورت میانگین± انحراف استاندارد نمایش داده شدند. جهت مقایسه میانگین داده­ها از روش آماری آنالیز واریانس یک ­طرفه (One way-ANOVA) و پس­آزمون Tukey's HSD در نرم­افزارSPSS  استفاده گردید. از نظر آماری سطح 05/0P< معنی­دار در نظر گرفته شد.

نتایج

مشاهدات ماکروسکوپی (بررسی سطح بیرونی زخم ها)                                

      در تمامی گروه­های مورد مطالعه در طی دوره 14روزه ترمیم زخم، در ابتدا یک لایه شفاف روی زخم را پوشش می­داد که به تدریج با پیشبرد مراحل ترمیم زخم˓ شیری رنگ می­شد. کامل شدن لایه شیری­رنگ به منزله ترمیم بهتر و التهاب کم­تر بود. فقط در گروه­های تیمار شده با دو غلظت از EBE ˓ تشکیل لایه شیری همراه با حداقل التهاب بود. نگهداری بیش از یک ماه ماهیان منجر به تشکیل پولک و برگشت پوست به حالت اولیه نگردید (شکل 1).

 

در جدول 1 و شکل­ 2 به ترتیب میزان تغییرات سطح زخم­ها (انقباض زخم) و درصد ترمیم زخم­ها در زمان­ها و تیمارهای مختلف آورده شده­اند. در طول دوره تیمار 14روزه عملکرد پماد حاوی 1 میلی­گرم از EBE در کاهش سطح زخم یا افزایش میزان انقباض زخم در مقایسه با سایر تیمارها بیشتر

 

بوده به طوری که در روز 8 و 14 پس از ایجاد زخم نتیجه ترمیم با این پماد معنی­داری (05/0P<) بوده و درصد ترمیم زخم نیز نزدیک به 100 درصد بود.

 

 

شکل 1. تشکیل لایه­های شفاف (سمت راست) و شیری رنگ (سمت چپ) در محل زخم.

     

 

جدول  1- تغییرات سطح زخم­ها (انقباض زخم) در روزها و تیمارهای مختلف.

دوره تیمار (روز)
14	12	10	8	6	4	2	0
02/0± 13/1  a	01/0± 42/1	61/1± 74/6	12/3± 01/22  a	07/3± 75/23	01/4± 79/24	05/4± 61/27	11/4± 41/29	شم
03/0± 11/1   a	07/0± 11/1	95/0± 38/6	07/4± 38/22 a	13/3± 48/22	14/4± 58/23	67/3± 13/25	32/4± 45/29	فنی­تویین
005/0± 09/0 b	09/0± 05/1	98/0± 86/4	91/2± 34/17 b	71/2± 55/19	17/4± 65/24	01/4± 83/26	22/4± 52/29	1 میلی­گرم EBE
04/0± 65/1 a	06/0± 69/1	07/1± 02/6	12/4± 15/21  a	07/4± 69/23	89/3± 07/24	89/3± 67/24	12/5± 02/29	10 میلی­گرم EBE

• واحد اندازه­گیری میلی­متر مربع است.
• در هر ستون داده­های با حروف غیرهمنام از نظر آماری اختلاف معنی دار (05/0P<) دارند.

 

 

 

 

شکل 2. تغییرات درصد ترمیم زخم­ها در روزها و تیمارهای مختلف.

 

           نتایج مربوط به تغییرات غلظت هیدروکسی­پرولین (سنتز کلاژن) در پوست گروه­های مختلف از ماهیان در پایان 14روز در شکل 3 آورده شده­اند. افزایش غلظت هیدروکسی­پرولین در گروه­های تیمار شده با دو غلظت از EBE بیشتر از سایر گروه­ها بود (05/0P<). در این میان بیشترین میزان حضور هیدروکسی­پرولین˓ در نمونه­های پوست تیمار شده با پماد 1 میلی­گرم از EBE معادل با 85/95 درصد بوده است (05/0P<).

 

 

 

شکل 3. تغییرات غلظت هیدروکسی­پرولین در پوست ماهیان در پایان دوره 14 روزه در تیمارهای مختلف. حروف غیرهمنام اختلاف معنی­دار (05/0P<) دارند.

 

 

      نتایج موجود در شکل 4 میزان تغییرات فعالیت لیزوزیمی در سرم خون ماهیان در پایان دوره 14روزه را نشان می­دهد که میزان آن (قطر مناطق رشد نیافته باکتری در لیزوپلیت) در گروه­های تیمار شده با دو غلظت از EBE معنی­دار بوده است (05/0P<). گروه تیمار شده با پماد 1 میلی­گرم از EBE بیشترین فعالیت لیزوزیمی را به میزان 42/99 درصد به خود اختصاص داده است (05/0P<).

 

 

 

شکل 4. تغییرات فعالیت لیزوزیمی سرم خون ماهیان در پایان دوره 14 روزه در تیمارهای مختلف.  حروف غیرهمنام اختلاف معنی­دار (05/0P<) دارند.

 

مشاهدات میکروسکوپی

 پوست طبیعی در گروه شاهد منفی دارای اپیدرم ضخیم همراه با سلول­های درشت ترشح­کننده موکوس و لایه درم با بافت گرانوله و رشته­های کلاژن فراوان و منظم بدون التهاب (عدم حضور سلول­های التهابی) است (شکل 5).

 

 

شکل 5. پوست در گروه شاهد منفی (بدون زخم). –D درم ، B – تیغه پایه، M – سلول موکوسی˓ S- اپیدرم. لایه اپیدرم وسیع همراه با بافت گرانوله و کلاژن کافی در درم. التهاب و سلول­های التهابی وجود ندارند (40×).

 

 

در انتهای تیمار 14روزه در پوست ماهیان گروه شاهد کاذب (شم) ترمیم زخم به طور کامل صورت نگرفته و درجات خفیفی از التهاب و هجوم سلول­های التهابی مشاهده می­شود. لایه اپیدرم نازک بوده و بازسازی در آن به خوبی انجام نشده است. در درم بافت گرانوله تا حدی شکل گرفته و رشته­های کلاژن نیز تا حد کمی آرایش منظم دارند (شکل 6).

 

 

شکل 6. پوست در گروه شاهد کاذب (شم) در پایان 14 روز تیمار با حلال عصاره. –D درم ، S-اپیدرم. لایه اپیدرم نازک است. التهاب خفیف، همراه با هجوم سلول­های التهابی. بافت گرانوله سازمان یافته همراه با افزایش کلاژن در درم (40×).

 

در شکل 7 مشخصات پوست ماهیان گروه شاهد مثبت (تیمار با فنی­تویین) در انتهای 14روزه آورده شده است. در این گروه ترمیم زخم ناقص همراه با درجات خفیفی از التهاب و هجوم سلول­های التهابی در درم است. لایه اپیدرم کمی ضخیم­تر از گروه شم بوده ولی کماکان ساختار آن ناقص است. در درم بافت گرانوله به میزان کافی شکل گرفته و آرایش رشته­های کلاژن نسبت به گروه شم کمی منظم­تر شده است.

 

 

 

شکل 7. پوست در گروه شاهد مثبت (تیمار با فنی­تویین) در پایان 14 روز. –D درم ، E-اپیدرم. لایه اپیدرم نازک است. التهاب خفیف همراه با بافت گرانوله کافی و نظم کلاژنی در درم (40×).

 

 

شکل 8 نشان­دهنده ترمیم پوست در تیمار 1 میلی­گرم از EBE در پایان دوره 14 روزه است. ظاهر برش تقریبا مشابه با گروه بدون زخم (شاهد منفی) است. اپیدرم با ساختاری کامل و ضخیم­تر از گروه­های شم و شاهد مثبت شکل گرفته است.

در اپیدرم سلول­های موکوسی ظاهر شده­اند. در لایه درم التهاب بسیار کم و خفیف وجود دارد و سلول­های التهابی دیده نمی­شوند. در مقایسه با گروه­های شم و شاهد مثبت˓ آرایش و جهت­یابی رشته­های کلاژن به خوبی صورت گرفته و بافت گرانوله رشد کافی و مناسب دارد.

 پایان 14روز در پوست زخم تیمار شده با 10 میلی­گرم از EBE˓ اپیدرم ساختاری ناقص­تر (ضخامت کم­تر و بدون سلول­های موکوسی) در مقایسه با پوست تیمار شده با 1 میلی­گرم از EBE داشته اما در مقایسه با سایر گروه­ها به وضعیت پوست نرمال نزدیک­تر است. در لایه درم نیز در مقایسه با تیمار 1 میلی­گرم از EBE˓ التهاب وجود داشته و توسعه بافت گرانوله و تجمع منظم رشته­های کلاژن به خوبی صورت نگرفته است (شکل 9).

 

 

شکل 8. پوست در گروه تیمار 14 روزه با 1 میلی­گرم از EBE. –D درم ، B – تیغه پایه ، M – سلول موکوسی˓ S-اپیدرم.               لایه اپیدرم با ساختار کامل و بافت گرانوله و کلاژن کافی و منظم با التهاب بسیار خفیف در درم (40×).

 

 

شکل 9. پوست در گروه تیمار 14 روزه با 10 میلی­گرم از EBE. –D درم ، E-اپیدرم. رشد ناقص اپیدرم همراه با بافت گرانوله ناقص و توده کلاژن نامنظم و التهاب خفیف در درم (40×).

 

 

بحث

      با مرور نتایج مطالعات قبلی مشخص شده که تاکنون از EBE در ترمیم زخم­های پوستی آبزیان استفاده نشده است. در مطالعه حاضر با بررسی نتایج ارزیابی­های ماکروسکوپی (تغییرات سطح زخم) و میکروسکوپی (بازسازی اپیدرم و درم) نمونه­های زخم مشخص گردید که استفاده از پماد حاوی 1 میلی­گرم از EBE در گرم حلال موجب ترمیم بهتر زخم تجربی در پوست ماهیان طلایی نسبت به سایر گروه­ها به ویژه گروه تیمار شده با فنی­تویین سدیم 1 درصد (داروی موثر بر ترمیم­ زخم در پزشکی) شده است. در این ارتباط غلظت بالاتر ازEBE  (10 میلی­گرم در گرم حلال) واجد چنین اثری نبوده˓ لذا می­توان عنوان نمود که تاثیر EBE در ترمیم زخم به صورت وابسته به غلظت نیست.

      در هم­سویی با نتایج مطالعه حاضر نشان داده شده که مولکول­های زیستی موجود در EBE موجب افزایش بیان ژن

 

برخی فاکتورهای رشد در موضع زخم شده که در نتیجه آن سرعت و کیفیت ترمیم زخم افزایش می­یابد (27˓28). هم­چنین خواص ضد­التهابی˓ ضد­میکروبی و ضد اپوپتوزیس EBE به اثبات رسیده که همگی در بهبود شرایط ترمیم زخم دخالت مستقیم دارند (34˓35). در ساختار بیوشیمیایی EBE کمپلکس­هایی با فعالیت­های آنتی­اکسیدانی و پروتئازی وجود دارند که می­توانند در روند ترمیم زخم نقش مهمی را برعهده داشته باشند (28˓30). از سوی دیگر˓ در تایید قدرت ترمیم­کنندگی EBE˓ استفاده از این عصاره موجب پیشبرد مراحل ترمیم زخم در عصب سیاتیک رت و تاندون در خرگوش ­شده است (36˓37). در زخم­های انسانی نیز مطالعات متا آنالیزی نشان داده که استفاده از EBE موجب تسریع در بازسازی ساختارهای اپیدرمی و کاهش مدت زمان ماندگاری بیماران در بیمارستان شده است (38˓39). در همین راستا˓ کاربرد EBE موجب افزایش سنتز فاکتورهای رشد EGF وFGF در زخم­­های پوستی در موش شده است (28). با توجه به آن که EGF در تحریک تکثیر سلول­های اپیتلیالی و FGF در تحریک رگ­زایی و افزایش تعداد فیبروبلاست­ها در درم نقش دارند (40)˓ لذا در مطالعه حاضر می­توان قدرت ترمیم­کنندگی EBE را به عملکرد مستقیم این دو فاکتور رشد در موضع زخم مرتبط دانست. در همین ارتباط در سال 2007 مشخص گردید که EGF با جمع­آوری و خنثی­سازی رادیکال­های آزاد و کاهش­دهی میزان پراکسیداسیون لیپیدی (LPO)˓ موجب تسریع ترمیم زخم­های دهانی در انسان می­شود (41). با کاهش میزان LPO بر میزان رگ­زایی در موضع زخم افزوده شده که در نتیجه آن سرعت ترمیم زخم افزایش می­یابد (42).

      از دیگر فرآیندهای مهم در ترمیم زخم مهاجرت­های سلولی است. مشخص شده که تیمار با EBE˓ موجب فعال­سازی مسیرهای سیگنال­رسانی ERK1/2 & p38 و PAs & MMP2/9 که نتیجه آن تشدید مهاجرت­های سلولی در موضع زخم است (43). هم­چنین تیمار EBE با فعال­سازی مسیر سیگنال­رسانی PI₃K سبب تکثیر فیبروبلاست­ها شده که می­تواند در بهبود روند ترمیم زخم نقش مهمی را ایفا نماید (44).

 

      کاهش بار میکروبی در موضع زخم از جمله خواص EBE بوده که منجر به ترمیم بهتر زخم­ها می­شود (29). در پژوهش حاضر نیز احتمالا همین روند توانسته با حذف میکروب­های بیماری­زا ترمیم مناسب زخم را باعث گردد. آزمایشات میکروب­شناسی مشخص نموده که استفاده از EBE می­تواند موجب مهار رشد باکتری­های Streptococcus pyogens و Aeromonas hydrophila و قارچ  Candida albicans گردد (45˓46). علاوه بر این مطالعات دیگر نشان داده­ که کاربرد EBE موجب کاهش جمعیت باکتر­های ˓Pseudomonas aeruginosa  Staphylococcus aureus و E. coli شده است (47).

      در مطالعه حاضر میزان حضور هیدروکسی­پرولین (HP) به طور معنی­داری در پوست ماهیان تیمار شده با پماد حاوی       1 میلی­گرم از EBE در گرم در مقایسه با سایر تیمارها افزایش داشته است. HP به عنوان یک اسید امینه ضروری در سنتز رشته­های کلاژن در پوست وارد عمل می­شود. استفاده از EBE در پوست موش با زخم ناشی از سوختگی عمیق درجه 2 موجب افزایش میزان HP و کوتاه­تر شدن زمان ترمیم شده

 

است (48). میزان تغییرات چرخه سنتز کلاژن تام در پوست را می­توان به طور غیرمستقیم با سنجش تغییرات میزان HP تعیین نمود. بین افزایش میزان HP و ترمیم زخم همبستگی مثبت قوی وجود دارد (49). رشته­های کلاژن توسط فیبروبلاست­ها در پوست ترشح شده و به دنبال ایجاد زخم قطعات ناشی از تخریب کلاژن موجب تحریک بازسازی اپیتلیوم˓ رگ­زایی و جذب نوتروفیل­ها به موضع زخم برای مبارزه با میکروب­ها می­شود. سنتز کافی و آرایش طبیعی رشته­های کلاژن در موضع زخم مانع از شکل­گیری اثر زخم یا اسکار در پایان روند ترمیم می شود (50˓51). همان گونه که در قبل نیز ذکر شد EBE سبب افزایش میزان FGF در موضع زخم می­شود (28). بررسی­ها نشان داده که با افزایش میزان FGF در پوست˓ مسیر سیگنال­رسانیc-Jun N-terminal kinase  در فیبروبلاست­ها فعال شده که نتیجه آن افزایش مهاجرت این سلول­ها به موضع زخم و ترشح کلاژن مورد نیاز برای ترمیم زخم است (52). به این ترتیب در پژوهش حاضر می­توان این گونه نتیجه­گیری نمود که احتمالا EBE با افزایش FGF در موضع زخم˓ ضمن تحریک فیبروبلاست­ها موجب افزایش سنتز و ترشح رشته­های کلاژن شده که با سنجش تغییرات افزایشی میزان HP به اثبات رسیده است.

پیدایش زخم در پوست جانوران از انواع استرس­های مزمن بوده که موجب فعال شدن واکنش­های دفاعی بدن مثل افزایش فعالیت لیزوزیمی در مایعات بدن می­شود (53). در مطالعه حاضر استفاده از پماد حاوی 1 میلی­گرم از EBE در ترمیم زخم˓ به طور معنی­داری موجب افزایش فعالیت لیزوزیمی در خون ماهیان در مقایسه با سایر تیمارها شده است. فعالیت لیزوزیمی از جمله شاخص­های ایمنی غیر­اختصاصی در بدن جانوران بوده که در شرایط نامساعد محیطی و به منظور مقابله با عوامل آنتی­ژنیک و بیماری­زا˓ فعالیت آن افزایش پیدا می­کند. لذا هر عاملی که فعالیت این آنزیم را افزایش دهد˓ موجب ایمن­سازی هر چه بیشتر بدن خواهد شد (53). در ماهیان خط اول مبارزه با عوامل آسیب­رسان به بافت­های بدن˓ افزایش فعالیت لیزوزیمی در خون بوده که از اهمیت زیادی برخوردار است زیرا ماهیان سیستم ایمنی اختصاصی ضعیف­تر­ و محدود­تری نسبت به بسیاری از جانوران دیگر دارند (54). مطالعات نشان داده که حتی جابجایی ماهیان از محل پرورش به مناطق دیگر نیز موجب افزایش فعالیت لیزوزیمی در خون و موکوس آنان می­شود (55). بر اساس نتایج مطالعه حاضر مشخص گردید که کاربرد EBE نه تنها باعث بهبود سریع­تر زخم پوستی در ماهیان شده، بلکه با افزایش فعالیت سیستم ایمنی ذاتی به صورت افزایش در فعالیت لیزوزیمی˓ موجب جلوگیری از هجوم عوامل بیماری­زا به موضع زخم در روند ترمیم زخم می­شود. از آن­جایی که بافت­های غنی از گلبول­های سفید به­ ویژه طحال از منابع اصلی تولید و ترشح لیزوزیم در گردش خون هستند (33)˓ لذا احتمال این که برخی از ماکرومولکول­های EBE بتوانند ضمن ورود به خون˓ خود را به فاگوسیت­های خونی نظیر ماکروفاژهای طحال رسانده و آنان را در جهت تولید و ترشح لیزوزیم تحریک نمایند، وجود دارد.

نتیجه­گیری

       نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده 14روزه از پماد حاوی 1 میلی­گرم از عصاره آبی- الکلی کرم­های خاکی (EBE) در ترمیم زخم پوستی ماهیان طلایی˓ می­تواند موجب افزایش قابل توجه­ای در بازسازی پوست˓ افزایش انقباض زخم و تقویت سیستم ایمنی ذاتی (فعالیت لیزوزیمی خون) در مقایسه با سایر تیمارها گردد. بنابراین EBE به عنوان

 

یک عامل بیوژنیک     می­تواند به عنوان ترکیب دارویی در ترمیم زخم­های پوستی در جانوران به ویژه آبزیان مورد استفاده موثر قرار گیرد.   

تعارض منافع
     نویسندگان این مقاله هیچ­­گونه تعارضی در منافع ندارند.

مراجع

1. Diegelmann RF, Evans MC. Wound healing: and overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in Bioscience. 2004; 9(1-3): 283-9.
2. Lux CN. Wound healing in animals: a review of physiology and clinical evaluation. Veterinary Dermatology. 2022; 33(1); 91-e27.
3. Barchitta M, Maugeri A, Favara G, San Lio RM, Evola, G., Agodi A, et al. Nutrition and Wound Healing: An Overview Focusing on the Beneficial Effects of Curcumin. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20: 1119.
4. Fontenot DK, Neiffer DL. Wound management in teleost fish: biology of the healing process, evaluation, and treatment. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 2004; 7: 57-86.
5. Le Guellec D, Morvan-Dubois G, Sire J. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 2004; 48(2-3): 217-31.
6. Ángeles Esteban M. An overview of the immunological defenses in fish skin. ISRN Immunology. 2012; 2012: 29.
7. Richardson R, Slanchev K, Kraus C, Knyphausen P, Eming S, Hammerschmidt M. Adult zebrafish as a model system for cutaneous wound healing research. Journal of Investigative Dermatology. 2013; 133(6): 1655-65.
8. Caldwell MD. Bacteria and antibiotics in wound healing. Surgical Clinics of North America. 2020; 100: 757-76.
9. Halver JE. The role of ascorbic acid in fish disease and tissue repair. Bulletin of the Japanese Society for the Science of Fish. 1972; 38: 79-92.
10. Hasanabadizadeh Z, Moradlou AAMH, Rasoul G, Rostami HAK, Narges S. The effects of vitamins injection (A, C, A+C and AD₃E) on wound healing process and some hematological response in common carp, Cyprinus carpio. The Journal of Agriculture and Natural Resources Sciences. 2008; 15(6): 117-24.
11. Lunder T, Sorum H, Holstad G, Steigerwalt AG, Mowinckel P, Brenner DJ. Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio viscosus sp. Nov. and Vibrio wodanis sp. Nov. isolated from Atlantic salmon (Salmo salar) with winter ulcer. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000; 50: 427-50.
12. Wahli T, Verlhac V, Girling P, Gabaudan J, Aebischer C. Influence of dietary vitamin C on the wound healing process in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture. 2003; 225: 371-86.
13. Nematollahi A, Bigham AS, Karimi I, Abbasi F. Reactions of goldfish (Carassius auratus) to three suture patterns following full thickness skin incisions. Research in Veterinary Science. 2010; 89(3): 451-4.
14. Shaw J, Hughes CM, Lagan KM, Bell PM. The clinical effect of topical phenytoin wound healing: a systematic review. British Journal of Dermatology. 2007; 157(5): 997-1004.
15. Vijayasingham SM, Dykes PJ, Marks R. Phenytoin has little effect on in-vitro models of wound healing. British Journal of Dermatology. 1991; 125: 136-139.
16. Pereira, C.A.; Alchorne Ade, O. Assessment of the effect of phenytoin on

 

cutaneous healing from excision of melanocytic nevi on the face and on the back. BMC Dermatology. 2010; 10: 7.

17. Prasad S, Prakash A, Patel S, Lunawat A, Mahore D. A comparative analysis of the efficacy of topical phenytoin with conventional wound dressing in healing of diabetic foot ulcers. International Surgery Journal. 2017; 4(4): 1389-1393.
18. Heydari S, Arabi, M, Nematullahi A, Karimi E, Bigham Sadiq A. Comparative effects of earthworm body extract and sodium phenytoin on suture wound healing in goldfish Carassius auratus. Cells and tissues. 2015 Mar 1;5(4):361-8.
19. Liu E, Gao H, Zhao Y, Pang Y, Yao Y, Yang Z, et al. The potential application of natural products in cutaneous wound healing: A review of preclinical evidence. Frontiers in Pharmacology. 2022; 13: 900439.
20. Vitale S, Colanero S, Placidi M, Di Emidio G, Tatone C, Amicarelli F. Phytochemistry and Biological Activity of Medicinal Plants in Wound Healing: An Overview of Current Research. Molecules. 2022; 27(11): 3566.
21. Cooper EL, Hrženjak T, Grdiša M. Alternative source of fibrinolytic, anticoagulative, antimicrobial and anticancer molecules. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 2004; 17: 237-44.
22. Ahmed N, Al-Mutairi KA. Earthworms Effect on Microbial Population and Soil Fertility as Well as Their Interaction with Agriculture Practices. Sustainability. 2022; 14: 7803.
23. Grdiša M, Gršić K, Grdiša MD. Earthworms-role in soil fertility to the use in medicine and as a food. Invertebrate Servival Journal. 2013; 10(1): 38-45.
24. Cooper, E.L., Balamurugan, M., Huang, C.Y., Tsao, C.R., Heredia, J, Tommaseo-Ponzetta M, et al. Earthworms dilong: Ancient, inexpensive, noncontroversial models my help clarify approaches to integrated medicine emphasizing neuroimmune systems. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2012; 2012: 164152.
25. Prakash M, Balamurugan M, Parthasarathi K, Gunasekaran G, Cooper EL, Ranganathan LS. Anti-ulceral and anti-oxidative properties of earthworm paste of Lampito mauritii, Kinberg on Rattus norvegicus. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2007; 11(1): 9-15.
26. Balamurugan M, Parthasarathi K, Cooper EL, Ranganathan LS. Hypothetical mode of action of earthworm extract with hepatoprotective and antioxidant properties. Journal of Zhejiang University- Science B. 2008; 9: 141-7.
27. Mira G, Terezija H. Glycolipoprotein extract of Eisenia foetida (G-90): A source of biological active molecules. European Journal of Soil Biology. 2007; 43: 104-9.
28. Grdiša M, Popović M, Hrženjak T. Stimulation of growth factor synthesis in skin wounds using tissue extract (G-90) from the earthworm Eisenia foetida. Cell Biochemistry and function. 2004; 22: 373-8.
29. Matausic-Pisl M, Cupic H, Kasuba V, Mikecin AM, Grdisa M. Tissue Extract from Eisenia foetida as a Wound-Healing Agent. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2010; 14(3): 177-84.
30. Grdisa M, Popovic M, Hrzenjak T. Glycolipoprotein extract (G-90) from earthworm Eisenia foetida exerts some antioxidative activity. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2001; 128(4): 821-25.
31. Hrzenjak T, Hrzenjak M, Kasuba V, Efenberger-Marinculić P, Levanat S. A new source of biologically active compounds-earthworm tissue (Eisenia fetida, Lumbricus rubelus). Comparative Biochemistry and

 

Physiology Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 1992; 102(3); 441-447.

32. Woessner J. The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this amino acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1961; 93: 440-7.
33. Lie O, Evensen O, Sorensen A, Froysadal E. Study on lysozyme activity in some fish species. Diseases of Aquatic Organisms. 1989; 6: 1-5.
34. Balamurugan M, Parthasarathi K, Cooper EL, Ranganathan LS. Earthworm paste (Lampito mauritii, Kinberg) alters inflammatory, oxidative, haematological and serum biochemical indices of inflamed rat. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2007; 11: 77-90.
35. Han CK, Kuo WW, Shen CY, Chen TS, Pai P, Tsai CH, et al. Dilong prevents the high-KCl cardioplegic solution administration-induced apoptosis in H9c2 cardiomyoblast cells mediated by MEK. American Journal of Chinese Medicine. 2014; 42: 1507-19.
36. Wei S, Yin X, Kou Y, Jiang B. Lumbricus Extract Promotes the Regeneration of Injured Peripheral Nerve in Rats. Journal of Ethnopharmacology. 2009; 123(1): 51-4.
37. Bigham-Sadegh A, Arabi M, Karimi E, Karimi I, Oryan A. Tendon Injury Healing with G-90 in a Rabbit Model: Biomechanical and Histopathological Evaluation. Veterinarski Arhiv. 2016; 86(3): 407-20.
38. Bo SP, Pan YJ. Clinical Analysis of Earthworm Sugar Extract Combined with Local Oxygen Therapy to Promote Chronic Wound Healing in 35 Cases. China Practical Medical. 2012; 7(20): 169-70 (Chinese).
39. Wang D, Ruan Z, Zhang R, Wang X, Wang R, Tang Z. Effect of Earthworm on Wound Healing: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Pharmacology. 2021; 12: 691742.
40. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson J. Molecular Biology of the Cells. NY, London: Garland Publishing; 1989.
41. Coşkun S, Güleç EG, Balabanli B, Acartürk F. Effects of epidermal growth factor on lipid peroxidation and nitric oxide levels in oral mucosal ulcer healing: a time-course study. Surgery Today. 2007; 37(7): 570-4.
42. Altavilla D, Galeano M, Bitto A, Minutoli L, Squadrito G, Seminara P, et al. Lipid peroxidation inhibition by raxofelast improves angiogenesis and wound healing in experimental burn wounds. Shock. 2005; 24(1): 85-91.
43. Chang YM, Shih YT, Chen YS, Liu CL, Fang WK, Tasi CH, et al. Schwann Cell Migration Induced by Earthworm Extract via Activation of PAs and MMP2/9 Mediated through ERK1/2 and p38. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011; 2011: 395458.
44. Song S, Wang Y, Ji K, Liang H, Ji A. Effect of earthworm active protein on fibroblast proliferation and its mechanism. Pharmaceutical Biology. 2016: 54(4): 732-739.
45. Mathur A, Verma SK, Bhat R, Singh SK, Prakash A, GBKS Prasad, et al. Antimicrobial Activity of Earthworm Extracts. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2010; 2(4): 364-70.
46. Bhorgin AJ, Uma K. Antimicrobial activity of Earthworm Powder (Lampito mauritii). International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2014; 3(1): 437-43.
47. Punu GP, Ansari A, Jaikishun S, Seecharran D. Effect of Earthworm (Perionyx excavatus) Powder on Selected Bacteria and Fungi. Journal of Advances in Biology & Biotechnology. 2016; 5(2): 1-15.
48. He M, Xie WQ, Cheng G, Li WP, Yu DJ, Jin HF, et al. The therapeutic effects of

 

earthworm extract on deep second-degree burn wound healing. Annals of Palliative Medicine. 2021; 10(3): 2869-79.

49. Qiu L, Jin XQ, Xiang DL, Fu YX, Tian XF. Study on the collagen constitution of hyperplastic scar in different ages and its influencing factors. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2003; 19(4): 236-40 (Chinese).
50. Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, Longaker MT. Wound repair and regeneration. Nature. 2008; 453: 314-21.
51. Reilly DM, Lozano J. Skin collagen through the life stages: Importance for skin health and beauty. Plastic Aesthetic Research. 2021; 8: 2.
52. Song YH, Zhu YT, Ding J, Zhou FY, Xue JX, Hee J, et al. Distribution of fibroblast growth factors and their roles in skin fibroblast cell migration. Molecular Medicine Reports. 2016; 14(4): 3336-42.
53. Anderson DP. Immunostimulants, adjuvants and vaccine carriers in fish, application to aquaculture. Annual Review of Fish Diseases. 1992; 2: 281-307.
54. Kozinenko II, Isaeva NM, Balakhnin I. Humoral factors of nonspecific defense of fish. Journal of Ichthyology. 1999; 39: 394-400.

55. Mock A, Peters G. Lysozyme activity in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), stressed by handing, transport and water pollution. Fish Biology. 1990; 37: 873-85.