تعداد نشریات | 418 |
تعداد شمارهها | 10,005 |
تعداد مقالات | 83,629 |
تعداد مشاهده مقاله | 78,552,180 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 55,724,963 |
بررسی تاثیر خاصیت ضدسرطانی عصاره گیاه کاکوتی (Ziziphora) بر میزان بیان ژن (CLDN1) Claudin-1 در رده سلول های سرطانی معده (AGS) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
دوره 16، شماره 4 - شماره پیاپی 64، آبان 1402، صفحه 29-43 اصل مقاله (1.63 M) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نوع مقاله: مقاله پژوهشی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
زهرا دیلمی خیابانی* 1؛ سارا نیری2 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1گروه زیست شناسی ، دانشکده علوم پایه و فنی و مهندسی، دانشگاه ازاد اسلامی، واحد زنجان، زنجان، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2گروه زیست شناسی- دانشگده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی زنجان، واحد زنجان، زنجان ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
زمینه وهدف: کلودین ها) (claudin پروتئین های ساختاری و عملکردی اتصالات محکم در سلول های اپیتلیال هستند. الگوهای بیان تغییر یافته از اعضای مختلف claudin در انواع بیماری ها، به ویژه در سرطان ها، به اثبات رسیده است. گزارش شده است که در سرطان معده claudin-1، 22 برابر افزایش بیان را نشان داده است. هدف از این مطالعه بررسی میزان بیان ژن claudin-1 در سلولهای آدنوکارسینومای معده پس از تیمار سلولها با عصاره گیاهی کاکوتی می باشد. مزیت این عصاره داشتن خاصیت ضد سرطانی و عدم وجود عوارض جانبی میباشد مواد و روش ها: سلولی آدنوکارسینومای معده (AGS) در پلیت های 12 چاهکی با 10% FBS و در دمای 37 درجه سلسیوس و انکوباتور 5% CO2 و رطوبت 85% کشت داده شدند. سلولها با غلظت های 800 , 1200 , 2000 μg/ml از عصاره آبی کاکوتی به مدت 48و 72 ساعت تیمار شده سپس استخراج RNA، سنتز cDNA با استفاده از کیت انجام گردید. در نهایت بررسی میزان بیان ژن claudin-1 با پرایمرهای اختصاصی و Real time PCR انجام شده و از ژن GAPDH به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. آنالیز دادهها با CTΔΔ-2 محاسبه گردید و معنی دار بودن نتایج با T-test بررسی شد. نتایج: آنالیز نتایج نشان داد که در تیمار 48 ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظت μg/ml 800 و 1200 به ترتیب 7 برابر و 3/2 برابر و در تیمار 72 ساعت، در غلظت μg/ml 800 و 1200 به ترتیب کاهش 5.8 برابر و 10 برابر کاهش در بیان ژن claudin-1 مشاهده گردید و هیچ تغییر معنی داری در غلظت 2000μg/ml در هر دو تیمار مشاهده نشد. نتیجه گیری: با توجه به نتایج حاصل، تاثیر تیمار 72ساعت در سلول های AGS با غلظت μg/ml 1200 عصاره کاکوتی در کاهش بیان ژن 1- claudinبه عنوان ژن درگیر در سرطانزایی، بیشتر میباشد. در این مطالعه، ژن claudin-1 بهعنوان یکی از عوامل در بدخیمی تومور با تاثیر عصاره کاکوتی به طور قابل توجهی کاهش بیان را نشان داده است. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 claudin-؛ سرطان معده؛ سلول های AGS؛ کاکوتی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
بررسی تاثیر خاصیت ضدسرطانی عصاره گیاه کاکوتی (Ziziphora) بر میزان بیان ژن (CLDN1) Claudin-1 در رده سلول های سرطانی معده (AGS) سارا نیری1 ، زهرا دیلمی خیابانی2 1- دانش آموخته کارشناسی ارشد ، گروه زیست شناسی ، واحد زنجان، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی زنجان، ایران. 2- استادیار گروه زیست شناسی ، واحد زنجان، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی زنجان، ایران. نویسنده مسئول:zahra.deilami@gmail.com
تاریخ دریافت:21/05/1402 تاریخ پذیرش: 13/07/1402 چکیده زمینه وهدف: کلودین ها) (claudin پروتئین های ساختاری و عملکردی اتصالات محکم در سلول های اپیتلیال هستند. الگوهای بیان تغییر یافته از اعضای مختلف claudin در انواع بیماری ها، به ویژه در سرطان ها، به اثبات رسیده است. گزارش شده است که در سرطان معده claudin-1، 22 برابر افزایش بیان را نشان داده است. هدف از این مطالعه بررسی میزان بیان ژن claudin-1 در سلولهای آدنوکارسینومای معده پس از تیمار سلولها با عصاره گیاهی کاکوتی می باشد. مزیت این عصاره داشتن خاصیت ضد سرطانی و عدم وجود عوارض جانبی میباشد مواد و روش ها: سلولی آدنوکارسینومای معده (AGS) در پلیت های 12 چاهکی با 10% FBS و در دمای 37 درجه سلسیوس و انکوباتور 5% CO2 و رطوبت 85% کشت داده شدند. سلولها با غلظت های 800 , 1200 , 2000 μg/ml از عصاره آبی کاکوتی به مدت 48و 72 ساعت تیمار شده سپس استخراج RNA، سنتز cDNA با استفاده از کیت انجام گردید. در نهایت بررسی میزان بیان ژن claudin-1 با پرایمرهای اختصاصی و Real time PCR انجام شده و از ژن GAPDH به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. آنالیز دادهها با CTΔΔ-2 محاسبه گردید و معنی دار بودن نتایج با T-test بررسی شد. نتایج: آنالیز نتایج نشان داد که در تیمار 48 ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظت μg/ml 800 و 1200 به ترتیب 7 برابر و 3/2 برابر و در تیمار 72 ساعت، در غلظت μg/ml 800 و 1200 به ترتیب کاهش 5.8 برابر و 10 برابر کاهش در بیان ژن claudin-1 مشاهده گردید و هیچ تغییر معنی داری در غلظت 2000μg/ml در هر دو تیمار مشاهده نشد. نتیجه گیری: با توجه به نتایج حاصل، تاثیر تیمار 72ساعت در سلول های AGS با غلظت μg/ml 1200 عصاره کاکوتی در کاهش بیان ژن 1- claudinبه عنوان ژن درگیر در سرطانزایی، بیشتر میباشد. در این مطالعه، ژن claudin-1 بهعنوان یکی از عوامل در بدخیمی تومور با تاثیر عصاره کاکوتی به طور قابل توجهی کاهش بیان را نشان داده است. کلمات کلیدی: 1 claudin-، سرطان معده ، سلول های AGS، کاکوتی
مقدمه: سرطان معده چهارمین سرطان شایع و دومین عامل مرگومیر براثر سرطان میباشد(1) یک عاملmulti factorial یا چندعاملی بوده که عفونت هلیکوباکترپیلوری وعوامل محیطی چون مصرف دخانیات ، الکل، تغذیه، سطح بهداشت، سابقه فامیلی و مواجه یکسان اعضای یک خانواده با عوامل خطر محیطی در شکلگیری آن تاثیرگذار است. ازسوی دیگر وجود زمینهی ژنتیکی، جهشها مانند جهش در پروتوانکوژنها، غیرفعال شدن ژنهای تعمیرDNA و ژنهای سرکوبگر و... میتوان اشاره کرد(2). بیش از 90 درصد مرگومیرهای سرطانی به دلیل متاسـتاز رخ میدهند. تومورهای اولیه میتوانند توسط جراحی یا درمانهای مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطانهـایی که به مرحله متاستاز رسیدهاند به درمان مقاوماند. خـصوصیت مقاومـت، دلیـل فراوانـی مـرگ را درمیـان افـراد دارای متاستاز نشان میدهد(6،3،4،5). چند مرحلهای بودن فرآیند متاستاز نشان از یک برنامـه دقیـق و پیچیـده دارد. شـناخت ژنهـا و پروتیینهای کلیدی دخیل و نشان دادن ارتباط آنها با هم و با بیماری نکته اصلی در شـناخت و درمـان سـرطانهـای مهاجم است. مطالعه ژن Claudin در سرطانها به ویژه سرطان معده از اهمیت بالایی برخوردار است چرا که تحقیقات نشان داده claudin1-4 و claudin6 افزایش بیان دارند(7،8). در این میان در سرطان معده ژن claudin-1 تا 22 برابر افزایش بیان را نشان داده است(9). Claudinها جزء اجزای ساختاری و عملکردی ضروری اتصالات tight میباشد. اتصالات tight عملکردی سد مانند دارند که در عبور یونها، آبها، ماکرومولکولهای مختلف و حتی سلولهای سرطانی نقش تنظیمی دارد.Claudinها نقش مهمی در تنظیم نفوذپذیری و حفظ قطبیت سلولی در سلولهای اپیتلیال(10،11) و اندوتلیال(12) دارند. CLDN1 در بافت سرطان معده تظاهر مییابد که بیان آن با تهاجم و متاستاز تومور در ارتباط است و آن به عنوان یک عامل پیشآگهی برای نشان دادن نتیجهی ضعف میتواند مورد استفاده قرار گیرد(13،14). گزارشهای قبلی نشان داد که claudin1 فعال کننده MMP-2 وMMP-9 میباشد که افزایش دهنده متاستاز و تهاجم سلول است(15،16،17). Anoikis شکل خاصی از آپوپتوز است هنگامیکه سلولها از ماتریکس خارج سلولی جدا شود رخ میدهد که یک مکانیسم کلیدی در حفظ هموستاز و توسعه بافت است(18). عدم اجرای برنامه anoikis ممکن است منجربه زنده ماندن سلول تحت شرایط توقف یا تکثیردر محل نابجا شود. این بینظمی در اجرای anoikis بهعنوان یک مشخصه پدیدار شدن سلولهای سرطانی درنظر گرفته میشود که منجربه ایجاد متاستاز در اندامهای دور می شود(19،20). Claudin1، anoikis سلول را در سرطان روده بزرگ، از طریق تنظیم بیان E-cadherinو بتا کاتنین وسیگنالینگ SRC را تنظیم میکند(21،22). درواقع یک تعامل متقابل بین کلودین1 و بتا کاتنین وجود دارد (21،23،24).نقش claudin1 و بتا کاتنین در تومور معده و متاستازباعث شد تحقیقات بیشتری در این زمینه صورت بگیرد. تعدادی از محققان با از کار انداختن بیان کلودین1 ، به وسیله القا سلولهای anoikis مانع رشد تومور ومتاستاز در شرایط invivo و invitro در سلولهای سرطان معده شدند و سپس متوجه شدند که کلودین1 مقاومت سلولهای anoikis را از طریق القا بیان بتا کاتنین غشائی افزایش میدهد که به دنبال آن تجمع سلولها القا میشود و فرآیند آپوپتوز مهار میشودو با انجام ازمایشی به این نتیجه رسیدند که کاهش بیان Claudin1
در سلولهای سرطان معده متاستاز را سرکوب میکند. (25).ژن claudin در بافت سرطان معده بیانش افزایش مییابد میتوان از آن به عنوان یک عامل پیش آگهی استفاده کرد(13،23،26،27،28).بیان کلودین در برخی سرطانها افزایش و در برخی سرطانها کاهش مییابد ولی طی مطالعات انجام شده در بسیاری از سرطانها شاهد بیان بیش از حد کلودین هستیم(29،30،31،32). گزارش شده که بیان دوباره کلودین-1 منجربه افزایش آپوپتوز در سلولهای سرطانی سینه می شود(33). بنابراین عملکرد کلودینها در سرطان بستگی به نوع بافت و احتمالا به نوع و مرحله سرطان بستگی دارد. به نظر میرسد داروهای گیاهی باتوجه به تاثیر موثر در جلوگیری از رشد تومور و عوارض جانبی کمتر، جایگزین مناسبی برای داروهای شیمیایی میباشند. در این مطالعه،ژن claudin-1 بهعنوان یکی از عوامل در بدخیمی تومور با تاثیر عصاره کاکوتی به طور قابل توجهی کاهش بیان را نشان داده است. مواد و روش ها: شامل عصارهگیری از کاکوتی، تقسیم بندی مواد مورد استفاده در فرایند کشت سلول ، تهیه محیط کشت کامل ، دکمپلمان کردن FBS ، پاساژ سلولی ، شمارش سلولی ، کشت سلولهای AGS در پلیت ۱2 چاهکی ، تیمار عصاره کاکوتی با دوزها و زمانهای مشخص ، استخراج RNA ، تعیین غلظت RNA ،سنتز cDNA ،طراحی و سفارش پرایمر، انجام Real time PCR و آنالیز داده ها میباشد. تهیه عصاره آبی کاکوتی عمل عصارهگیری به روش ماسراسیون (خیساندن) انجام گرفت. برگهای خشک شده کاکوتی توسط آسیاب برقی پودر گردید. 50 گرم از پودر گیاه توزین شده و در ارلن ۱ لیتری با 500 میلی لیتر آب مقطر استریل مخلوط گردید. ارلن مذکور جهت حل شدن پلی فنلهای کاکوتی، ۱5 دقیقه در دمای جوش بن ماری قرار گرفته و سپس بر روی شیکر انکوباتور گذاشته شد. پس از گذشت 2٤ ساعت، مخلوط مذکور توسط گاز استریل ٤ لایه و قیف صاف گردید. برای جدا کردن ناخالصیهای موجود در عصاره مورد نظر عمل سانتریفوژ با دور rpm ۳000 و به مدت 20 دقیقه در دمای ٤ درجه سلسیوس انجام گرفت. عصاره صاف شده با استفاده از دستگاه روتاری تغلیظ گردید. سپس توسط فیلتر میکروبی 22/0 میکرونی استریل شده و در میکروتیوپهای استریل تقسیم و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سلسیوس نگهداری شد (34). سلول سرطانی معده (AGS) و پاساژ سلولی سلولهای AGS از انیستیتو پاستور خریداری گردید پس از ورود سلول به اتاق کشت آزمایشگاه علوم و تحقیقات ، به سرعت مراحل Sub Culture انجام شد. شمارش سلولی پس از پاساژ سلولی ، شمارش سلول ها با استفاده از تریپان بلو و لام نئوبار انجام شد. تعداد سلول ها: 105 سلول در پلیت های 12 چاهکی کشت داده شد. کشت سلول ها در پلیت های 12چاهکی در ابتدا سلولها با PBS شستشو و سپس تریپسینه شده تا از سطح فلاسک جدا شوند. سانتریفوژ با دور RPM 1000 به مدت 5 دقیقه انجام شده و رسوب سلولی در مقدار مناسبی از محیط کشت کامل به حالت سوسپانسیون درآمد. در پلیت ۱2 چاهکی ، هر چاهک نیاز بهml 2 محیط کشت کامل و ۱00 مایکرولیتر از سلولهای شمارش شده دارد. یک پلیت با چهار چاهک حاوی سلولهای AGS برای دوزهای 800 ، ۱200 و 2000 مایکروگرم بر میلی لیتر عصاره کاکوتی و کنترل در بازه زمانی ٤8 ساعت و پلیت دیگری به همین ترتیب در بازه زمانی 72 ساعت آماده گشت. تیمار با عصاره کاکوتی 24 ساعت پس از کشت سلول در پلیتهای ۱2 چاهکی ، تیمار عصاره کاکوتی آغاز شده ، زمان طی شده جهت اتصال پروتئینهای سطح سلول به کف پلیت می باشد. یک چاهک بدون اضافه کردن عصاره دارویی به عنوان کنترل جهت بررسی بیان ژنهای مورد مطالعه در حالت عادی در نظر گرفته شد. چاهکهای دیگر با دوزهای 800 ، ۱200 و 2000 مایکروگرم بر میلی لیتر از عصاره کاکوتی تیمار گردید. محیط کشت رویی سلول تخلیه شده و مقادیر محیط کشت کامل و عصاره کاکوتی به هر چاهک مخصوص به خود اضافه شد. مجموع مقادیر ml 2 میباشد. استخراجRNA Total RNA کل سلولهای یوکاریوتی حاوی RNA ریبوزومی(rRNA) ،RNA ناقل(tRNA)و RNA پیامبر(mRNA) میباشد. در این مطالعه استخراج RNA در دوز های ٤8 و 72 ساعته به 2 صورت انجام گرفت. استخراج Total RNA از کیت استخراج RNA از کشت سلول کیت استخراج RNA از کشت سلول با 891620Cat.NO:PR از شرکت سیناکلون خریداری شد. استخراجRNA Total توسط RNX RNX_Plus Solution , 25ml.از شرکت سیناکلون با C7713 Cat.No: RN خریداری شد. بررسی کمی RNA استخراج شده پس از استخراج کیفیت و غلظت RNAها با دستگاه اسپکتوفتومتر بررسی شد μ 1از RNA استخراج شده به همراه μl 99 آب مقطر سترون دوبار اتوکلاو شده تهیه شده و از محلول فوق , μl 1در کووت ریخته و در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده شد سنتز cDNA در نسخه برداری معکوس ، رشته مکمل mRNA سنتز میگردد. در این تحقیق کیت سنتز cDNAاز شرکت تکاپوزیست با R2046Cat.No:K- و مشخصات: تیوپهای لیوفیلیزه آماده RT دارای آنزیم Cycle Script حاوی شش پار تصادفی خریداری شد. 20 مایکرولیترWater DEPC (diethyl pyro carbonate ) به همراه ۱ مایکرولیتر RNA استخراج شده به تیوپهای کیت RT اضافه شد و به مدت چند ثانیه SPIN گشت و در دستگاه PCR قرار داده شد. پس از اتمام زمان داده شده محصول cDNA حاصل در فریزر 20 - درجه سانتی گراد نگهداری گردید. طراحی پرایمر توالی نوکلئوتیدی مربوط به رونوشت های ژن Claudin-1 و ژن رفرنس GAPDH از مقالات معتبر استخراج شد (260،261) و صحت انها با BLASTو GENE RUNNER تایید شد .
جدول1. توالی پرایمرها
روش مقایسهای -∆∆Ct2 در ارزیابی نسبی از چندین روش متفاوت میتوان استفاده کرد که شامل: ارزیابی نسبی با استفاده از دو منحنی استاندارد، روش ∆∆Ct و روش پافل میباشد که از این بین در این مطالعه از روش مقایسهای ∆∆Ctاستفاده شد. در این روش مقدار Ct هر یک از نمونه ها از مقدار ct ژن استاندارد مورد نظر کسر و تفاوت آن در مقابلct به دست آمده و روند کاهش یا نمونه کنترل ( DDCt) محاسبه شد. میزان بیان ژن با فرمول 2 به توان DDCt – بهدست آمده و روند کاهش یا افزایشی ژن مورد بررسی قرار گرفت
جهت اطمینان یافتن از تحت تاثیر قرار گرفتن یا نگرفتن house keeping gene نسبت ژن موردنظر به ژن مرجع با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد. Ratio = 2 -DCt Sample / 2 -DCt Reference gene برای بررسی میزان بیان ژن از Real Time PCRاستفاده و انالیز اماری برای معنی دار بودن صورت گرفت روش t-test در این روش هر گروه بهطور جداگانه با گروه کنترل مقایسه شد تا معنیدار بودن یا نبودن نتایج مشخص گردد. این کار توسط سایت openepi به صورت آنلاین انجام گرفت. در خانه های این جدول میانگین 2 -DDCt و انحراف معیار وارد شد و P-value برای گروههای تحت تیمار محاسبه گردید. 0.05> P-value نشاندهنده معنی دار بودن کاهش یا افزایش بیان ژن claudin-1 میباشد. نتایج تغییرات بیان ژن claudin1 در سلول های AGSدر دور48 ساعت سلولهای AGS با غلظت 800 , ۱200 و 2000 مایکروگرم بر میلی لیتر از کاکوتی و نمونه کنترل در بازه زمانی ٤8 ساعت تحت تیمار قرار گرفت. استخراج RNA و سنتز cDNA و در نهایت PCR Real Time انجام شد. نتایج به دست آمده از طریق فرمول روش مقایسهای ∆∆Ct مورد آنالیز قرار گرفت. معنی دار بودن دادهها نیز توسطt- test بررسی شد.
جدول 2 . نتایج تغییر میزان بیان ژن Claudin-1 تحت تیمار با غلظتهای مختلف عصاره کاکوتی در بازه زمانی 48 ساعت
نمودار 1 . نمودار ستونی تغییرات میزان بیان ژن claudin-1 در گروه 48 ساعت
نمودار 2 . نمودار خطی تغییرات میزان بیان ژنclaudin-1 در گروه 48 ساعت
در تیمار 48 ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظت μg/ml 800 بیشترین کاهش بیان این ژن را داریم قابل ذکر است در غلظت μg/ml 1200 نیز کاهش بیان داریم اما با p-value>0.05 معنیدار نیست ولی در غلظت 2000μg/ml تغییری مشاهده نشد. بررسی تغییرات میزان بیان ژن claudin-1 در بازه زمانی 72 ساعت روش کار مشابه آزمایش در گروه ٤8 ساعت میباشد با این تفاوت که در این گروه , زمان طی شده پس از تیمار با عصاره کاکوتی, 72 ساعت میباشد.
جدول 3 . نتایج تغییر میزان بیان ژن Claudin-1 تحت تیمار با غلظتهای مختلف عصاره کاکوتی در بازه زمانی 72 ساعت
نمودار 3 . نمودار ستونی تغییرات میزان بیان ژن claudin-1 در گروه 72 ساعت
نمودار 4 . نمودار خطی تغییرات میزان بیان ژن claudin-1 در گروه 72 ساعت
در تیمار 72 ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظتهای μg/ml 800 و 1200 کاهش معنیدار بیان این ژن را داریم قابل ذکر است در غلظت μg/ml 2000 افزایش بیان داریم که با p-value>0.05 معنیدار نیست.
جدول 4. مقایسه میزان تغییرات بیان ژن claudin-1 در بازه زمانی 72 و 48 ساعت
نمودار5. نمودار ستونی مقایسه میزان تغییرات بیان ژن claudin-1 در بازههای زمانی 48و72 ساعت
نمودار6: نمودار خطی مقایسه میزان تغییرات بیان ژن claudin-1 در بازههای زمانی 48و72 ساعت
آنالیز نتایج نشان داد که در تیمار 48 ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظت μg/ml 800 و 1200 به ترتیب 7 برابر و 3/2 برابر کاهش در بیان ژن claudin-1 مشاهده گردید ولی تغییری در غلظت 2000μg/ml مشاهده نشد. همچنین در تیمار 72 ساعت، در غلظت μg/ml 800 و 1200 به ترتیب کاهش 5.8 برابر و 10 برابر در بیان ژن claudin-1 مشاهده گردید و در غلظت 2000μg/ml افزایش بیان ژن claudin-1 حاصل شد ولی این افزایش معنیدار نبود نتایج مقایسه Ratioو2-DDCt در گروه ٤8 و 72 ساعت , تفاوت محسوسی میان نتایج Ratio و -DDCt2 در میزان بیان ژن claudin-1در غلظت های 800 و ۱200 و 2000 μg/ml از عصاره کاکوتی وجود ندارد و می توان اینطور عنوان کرد که ژن رفرنس در بازه ی ٤8 و 72 ساعت تیمار با عصاره کاکوتی به طور مستقیم تحت تاثیر قرار نگرفته است و به عنوان ژن رفرنس، استاندارد می باشد. بحث نام کلودین برگرفته از کلمه لاتین claudere (به معنی برای بستن) میباشد که این اسم نشاندهنده نقش سدی این پروتئینهاست. کلودینها بهعنوان یکی از مهمترین اجزای اتصالات محکم در سلولهای اپیتلیال است این پروتئینها هموستاز بافت را از طریق تنظیم نفوذپذیری و انتقال سیگنال حفظ میکند.
7.نمودار ستونی مقایسه نتایج Ratioو -DDCt2 ژن claudin1 در گروه 48 ساعت
نمودار8. نمودار خطی مقایسه نتایج Ratio و -DDCt2 ژن claudin1 در گروه 48 ساعت
نمودار9. نمودار ستونی مقایسه نتایج Ratioو -DDCt2 ژن claudin1 در گروه 72 ساعت
نمودار10 . نمودار خطی مقایسه نتایج Ratioو -DDCt2 ژن claudin1 در گروه 72 ساعت
کلودینها پروتئینهایی هستند که در اتصالات محکم سلولی دخیل هستند و برای نگهداری از اپیتلیوم طبیعی(نرمال)، به ویژه در ساختار سدمانند، قطبیت سلولی و انتقال سیگنال مهم هستند. اختلال در تنظیم بیان این ژنها در بسیاری از سرطانهای مختلف شناسایی شده است(35). بر اساس بیولوژی تومور، کاهش بیانCLDN1 منجر به تخریب اتصالات محکم و از دست دادن چسبندگی سلول به سلول می شود که باعث پیشرفت تومور میشود (36)، اما اهمیت بالینی آن در سرطان معده پیچیدهتر است. شواهدی وجود دارد که تعدادی از کلودینها، از جملهCLDN1 ، بیانشان افزایش مییابد، زیرا بافت معده به متاپلازی روده و سرطانی شدن زودرس معده منجر میشود. طبق مطالعات Zavala-Zendejas VE و همکارانش ،نقش CLDN1 را در فرایندهای متاستاتیک از طریق فعال شدن متالوپروتئینازها، کاهش آپوپتوز و افزایش مهاجرت را در سرطان تخمدان و کولون گزارش کردند.(37) در مطالعهای که در سال 2011 توسط Marimuthu و همکارانش انجام گرفت مشخص شد که از 24 عضو از claudinانسان claudin-1 ،22 برابر و claudin-4 و claudin-6 هر کدام 3 برابر در سرطان معده افزایش بیان داشتند و همچنین دریافتند که 4ژن درگیر در سرطان معده که افزایش بیان دارند با اتصال به claudin-1 تشکیل یک شبکه یا مجموعه را میدهند.(9) طبق مطالعات Lars L Eftang و همکارانش مشخص شد که بیان بیش از حد claudin-1 وIL-8 با عفونت حاد هلیکوباکترپیلوری و تومورزایی در سلولهای اپیتلیال معده در ارتباط است.(35) Jie Huang و همکارانش با انجام آزمایشی میزان بیان claudin-1 را یکبار افزایش و بار دیگر کاهش دادند تا نقش claudin را در سرطان معده و پیشرفت تومور بررسی کنند آنها مشاهده کردند که کاهش بیان این ژن در شرایط آزمایشگاهی(In vitro)، مهار و کاهش مهاجرت و تهاجم و تشکیل کلنی در شرایط in vivo (داخل بدن) نیز مهار تومورزایی و متاستاز را در پی دارد همچنین آنها گزارش کردند که کاهش یا افزایش بیش از حد CLDN1 باعث تغییراتی در بتاکاتنین غشائی در سلولهای سرطانی معده میشود (بتا کاتنین تنظیم کننده مهم چسبندگی سلول-سلول است) آنها مشاهده کردند که بیان کلودین-1 با بیان بتاکاتنین در بافت سرطان معده درارتباط است و گزارش کردند که تنظیم بیان بتاکاتنین توسط کلودین-1 ممکن است یک مسیر کلیدی در روند anoikis سلول سرطانی معده باشد (25). همچنین هاف من و همکاران نیز گزارش کردند که یکپارچگی تماس سلول-سلول می تواند به حفظ بقای سیگنال بتاکاتنین و SRC ، PI3K/AKT و جلوگیری از anoikis کمک کند. مطالعه حاضر با هدف تأیید خاصیت ضد سرطانی عصاره گیاه کاکوتی بر سلول های سرطانی بوده است و ما در تحقیقات خود اثر عصاره کاکوتی را بر ژن claudin-1 بررسی کردیم و شاهد کاهش این ژن در دوزهای μg/ml800 و 1200 بودیم. پیشبرد واکنش های پیوسته به سمت مرگ سلرلی در سلول های غیر طبیعی و سرطانی قطعاً همراه با کاهش یا افزایش برخی از ژن های درگیر در این روند بوده است، اما این پروسه نیازمند مطالعات دیگری برای شناخت ژن های تاثیر پذیر بر عصاره ضد سرطانی کاکوتی بوده است. بر طبق آزمایشات انجام شده آنالیز نتایج نشان داد که در بازه زمانی 48 ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظتهای μg/ml 800 و 1200 کاهش در بیان ژن claudin-1 مشاهده گردید که در دوز μg/ml 800 این کاهش بیان محسوستر از دوز 1200 بود به نحوی که در دوز μg/ml 800 از تیمار 48 ساعته 7 برابر و در دوز μg/ml 1200 به میزان 2.3 برابر کاهش بیان رخ داد ولی در دوز μg/ml 2000 تاثیری مشاهده نشد. با بررسی تغییرات بیان ژن در بازهی زمانی 72ساعت سلولهای AGS با عصاره کاکوتی در غلظت μg/ml 800 کاهش بیان با محاسبه 0.05 با انجام آزمایشات بر طبق t-test کاهش بیان ژن claudin-1 در دوز μg/ml 800 از تیمار 48 ساعته و در دوزهای 800 و 1200 μg/ml از تیمار 72 ساعته با محاسبه p-value>0.05 معنیدار بوده اما در دوز μg/ml 1200 از تیمار 48 ساعته بیمعنی بوده است. همچنین در دوز μg/ml 2000 از هر دو بازه زمانی 48 و 72 ساعت افزایش بیان رخ داد که بیمعنی گزارش شد. نتیجهگیری با توجه به افزایش مصرف گیاهان دارویی و خطرات مصرف با دور غیر موثر و گاها سمی این ترکیبات نتایج بدست آمده طبق تحقیق حاضر می تواند مورد استفاده شرکت های دانش بنیان برای تولید داروهای گیاهی با عصاره کاکوتی در دوزهای مناسب برای بهبود و کنترل پیشرفت بیماری در بیماران مبتلا به سرطان معده قرار گیرد. تعارض منافع نویسندگان مقاله تعارضی در منافع ندارند
فهرست منابع
The study of Ziziphora Extract on Claudin1 Gene Expression in Cancerous Cell line AGS. Sara Nayyeri1, Zahra Deilami Khiabani2
1- Master of Science, Faculty of Basic Sciences, Zanjan Branch, Islamic Azad University, Zanjan, Iran 2- Assistant Professor, Faculty of Basic Sciences, Zanjan Branch, Islamic Azad University, Zanjan, Iran. Corresponding author: zahra.deilami@gmail.com
Received:2023.08. 12 Accepted: 2023.10.05 AbstractBackground & Aims: Claudins are the main structural and functional proteins of tight junctions in epithelial cells. The altered expression patterns of different claudin members have been demonstrated in a variety of diseases, particularly in cancers. It has been reported that claudin 1 is overexpressed 22-fold in gastric adenocarcinoma. Considering the least side effect of herbal extracts, in this study we have evaluated claudin-1 gene expression in AGS cells treated with ziziphora extract. Materials and Methods: The AGS cells were incubated 37°C containing 5% CO2 with 85% humidity DMEM with 10% FBS . The cells were treated with concentrations of 800, 1200, 2000 μg /ml of ziziphora for 48 and 72 hours. Extraction of RNA, synthesis of cDNA has been done using kit. The study of claudin-1 gene expression was performed by Real time PCR and also GAPDH gene was used as the internal control. Data analysis was performed with 2 - ΔΔCT and statistically analyzed by T-Test . Results: The results of Real time PCR data have shown in 48 hours treatment, reduction of 7 and 2.3 fold with concentrations of 800 and 1200 μg /ml of ziziphora respectively and in 72 hours treatment, reduction of 5.8 and 10 fold have seen in concentrations of 800 and 1200μg /ml of ziziphora, respectively and there was no significant change in concentration of 2000μg / ml in both treatments. Conclusion: Ziziphora extract in 1200 μg /ml concentration, reduced the expression of claudin-1 remarkably. Claudin-1 may become therapeutic targets for cancer treatment and ziziphora as a herbal extract decreased the expression rate of claudin1significantly, in lower concentrations treatment.
Keywords: Claudin-1 ,Gastric cancer, AGS cells, ziziphora
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 169 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 46 |