اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات418
تعداد شماره‌ها10,005
تعداد مقالات83,625
تعداد مشاهده مقاله78,454,363
تعداد دریافت فایل اصل مقاله55,469,512
غلامی آهنگران, مجید, استادپور, مهرداد, خانی, آنیتا. (1401). ردیابی ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین در اشریشیا‌کلی جدا شده از یک کبوتر با علایم گوارشی: گزارش موردی. نشریه علمی پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی, 15(4), 118-126.
مجید غلامی آهنگران; مهرداد استادپور; آنیتا خانی. "ردیابی ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین در اشریشیا‌کلی جدا شده از یک کبوتر با علایم گوارشی: گزارش موردی". نشریه علمی پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی, 15, 4, 1401, 118-126.
غلامی آهنگران, مجید, استادپور, مهرداد, خانی, آنیتا. (1401). 'ردیابی ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین در اشریشیا‌کلی جدا شده از یک کبوتر با علایم گوارشی: گزارش موردی', نشریه علمی پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی, 15(4), pp. 118-126.
غلامی آهنگران, مجید, استادپور, مهرداد, خانی, آنیتا. ردیابی ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین در اشریشیا‌کلی جدا شده از یک کبوتر با علایم گوارشی: گزارش موردی. نشریه علمی پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی, 1401; 15(4): 118-126.

ردیابی ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین در اشریشیا‌کلی جدا شده از یک کبوتر با علایم گوارشی: گزارش موردی

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی
دوره 15، شماره 4 - شماره پیاپی 60، آذر 1401، صفحه 118-126    اصل مقاله (854.41 K)
نوع مقاله: مقاله پژوهشی
نویسندگان
مجید غلامی آهنگران* 1؛ مهرداد استادپور2؛ آنیتا خانی3
1بخش بهداشت و بیماری های طیور، دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
2دانش آموخته دانشکده‌ دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.
3دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
چکیده
زمینه و هدف: اشریشیاکلی به عنوان فلور در دستگاه گوارش تمام خونگرم‌ها و از جمله کبوتر یافت می‌شود. این باکتری دارای ژن‌های حدت زیادی است که از جمله می‌توان به شیگاتوکسین و اینتیمین اشاره کرد. اینتیمین مسئول اتصال اشریشیاکلی به سلول‌های مخاطی روده بوده و شیگاتوکسین باعث مرگ سلول می‌شود. هدف از مطالعه اخیر بررسی حضور این ژن های حدت در اشریشیاکلی جداشده از یک مورد عفونت گوارشی در کبوتر به منظور امکان بیماریزایی اشریشیاکلی با منشا کبوتر در انسان می باشد.
مواد و روش ها: سوآب کلواکی از یک کبوتر با علایم گوارشی ارجاع شده به کلینیک دامپزشکی تهیه شد. ﭘﺲ از ﻛﺸﺖ و ﺧﺎﻟﺺﺳﺎزى، ﺑﺎ ﺗﺴﺖﻫﺎى ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻰ ﺑﻪ ﺗﺄﻳﻴﺪ ﻣﻮارد آﻟﻮدﮔﻰ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻰ ﭘﺮداﺧﺘﻪ ﺷﺪ. ﺳﭙﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﺨﺮاج DNA ﺑﻪروش ﺟﻮﺷﺎﻧﺪن، ﺑﻪ ردﻳﺎﺑﻰ ژنﻫﺎى ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ، اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ و زﻳﺮ واحدﻫﺎى ١ و ٢ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ (stx1 و stx2) ﭘﺮداﺧﺘﻪ ﺷﺪ. ژن های مورد نظر با پرایمر های اختصاصی و براساس تکثیر ژن های هدف با طول قطعه مشخص (به ترتیب 165، 890، 614 و 779 جفت بازی) مورد شناسایی قرار گرفتند.
نتایج: ﻧﺘﺎﻳﺞ ﻧﺸﺎن داد سویه اشریشیاکلی جدا شده از کبوتر با علایم اسهال واجد ژن‌های حدت شیگاتوکسین 1 و اینتیمین بوده و فاقد ژن کد کننده همولیزین و شیگاتوکسین 2 می‌باشد.
نتیجه گیری: نتایج نشان داد ژن‌های حدت شیگاتوکسین 1 و اینتیمین در کبوتر واجد علایم گوارشی قابل ردیابی است. لذا با توجه به این نتایج، بر خلاف تصورات قبلی، ممکن است پرندگان منشا اشریشیاکلی شیگاتوکسوژنیک باشند و ممکن است علایم اسهال در کبوتر با حضور اشریشیاکلی واجد ژن شیگاتوکسین و اینتیمین در ارتباط داشته باشد که لازم است برای اثبات آن بررسی‌های بیشتری انجام شود.
کلیدواژه‌ها
ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ؛ اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ؛ ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ؛ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻰ؛ کبوتر
اصل مقاله

 

ردیابی ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین در اشریشیا‌کلی جدا شده از یک کبوتر با علایم گوارشی: گزارش موردی

مجید غلامی آهنگران1، مهرداد استادپور2، آنیتا خانی2

1- دانشیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده‌ دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران. نویسنده مسئول: mgholami6@gmail.com

2-. دانش آموخته دانشکده‌ دامپزشکی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.

 

تاریخ دریافت:29/08/1399                                                                                     تاریخ پذیرش: 22/02/1400

چکیده

زمینه و هدف: اشریشیاکلی به عنوان فلور در دستگاه گوارش تمام خونگرم‌ها و از جمله کبوتر یافت می‌شود. این باکتری دارای ژن‌های حدت زیادی است که از جمله می‌توان به شیگاتوکسین و اینتیمین اشاره کرد. اینتیمین مسئول اتصال اشریشیاکلی به سلول‌های مخاطی روده بوده و شیگاتوکسین باعث مرگ سلول می‌شود. هدف از مطالعه اخیر بررسی حضور این ژن های حدت در اشریشیاکلی جداشده از یک مورد عفونت گوارشی در کبوتر به منظور امکان بیماریزایی اشریشیاکلی با منشا کبوتر در انسان می باشد.

مواد و روش ها: سوآب کلواکی از یک کبوتر با علایم گوارشی ارجاع شده به کلینیک دامپزشکی تهیه شد. ﭘﺲ از ﻛﺸﺖ و ﺧﺎﻟﺺﺳﺎزى، ﺑﺎ ﺗﺴﺖﻫﺎى ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻰ ﺑﻪ ﺗﺄﻳﻴﺪ ﻣﻮارد آﻟﻮدﮔﻰ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻰ ﭘﺮداﺧﺘﻪ ﺷﺪ. ﺳﭙﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﺨﺮاج DNA ﺑﻪروش ﺟﻮﺷﺎﻧﺪن، ﺑﻪ ردﻳﺎﺑﻰ ژنﻫﺎى ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ، اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ و زﻳﺮ واحدﻫﺎى ١ و ٢ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ (stx1 و stx2) ﭘﺮداﺧﺘﻪ ﺷﺪ. ژن های مورد نظر با پرایمر های اختصاصی و براساس تکثیر ژن های هدف با طول قطعه مشخص (به ترتیب 165، 890، 614 و 779 جفت بازی) مورد شناسایی قرار گرفتند.

نتایج: ﻧﺘﺎﻳﺞ ﻧﺸﺎن داد سویه اشریشیاکلی جدا شده از کبوتر با علایم اسهال واجد ژن‌های حدت شیگاتوکسین 1 و اینتیمین بوده و فاقد ژن کد کننده همولیزین و شیگاتوکسین 2 می‌باشد.

نتیجه گیری: نتایج نشان داد ژن‌های حدت شیگاتوکسین 1 و اینتیمین در کبوتر واجد علایم گوارشی قابل ردیابی است. لذا با توجه به این نتایج، بر خلاف تصورات قبلی، ممکن است پرندگان منشا اشریشیاکلی شیگاتوکسوژنیک باشند و ممکن است علایم اسهال در کبوتر با حضور اشریشیاکلی واجد ژن شیگاتوکسین و اینتیمین در ارتباط داشته باشد که لازم است برای اثبات آن بررسی‌های بیشتری انجام شود.

واژه‌های کلیدی: ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ، اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ، ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ، اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻰ، کبوتر

 

 

مقدمه

پرندگان، به عنوان عامل مهمی در انتقال عوامل بیماری‌زا محسوب می‌شوند. وجود مدفوع کبوتر به عنوان منشا باکتریایی می‌تواند عامل مهمی در انتقال انواع مختلف عفونت‌ها باشد. از جمله این عفونت‌ها می‌توان به عفونت‌های ایجاد شده توسط باکتری اشریشیاکلی اشاره کرد (11). اشریشیاکلی در دستگاه گوارش کبوتر به صورت طبیعی وجود دارد و عواملی همچون استرس و عفونت‌های ویروسی و باکتریایی سبب ایجاد شرایطی مناسب جهت ایجاد بیماری توسط این باکتری می‌گردد (13). از میان سویه‌های اشریشیاکلی مولد اسهال، انواع تولید کننده توکسین شیگا یا (STEC) از مهمترین عوامل ایجاد کننده بیماری های معده‌ای – روده‌ای در انسان می‌باشند. این ســویه‌ها علاوه بر ایجاد مسمومیت غذایی در انسان توانایی ایجاد بیماری‌های شــدیدی مانند اســهال خونی، کولیت خونریزی‌دهنده، ســندرم اورمی همولیتیک را دارند. اگرچه ســروتیپ‌های غیر O157 :H7، توانایی ایجاد اورمی همولیتیک را دارند اما مهمترین سروتیپ ایجاد کننده این سندرم O157 :H7 می‌باشــد (14). اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین و اشریشیاکلی انتروپاتوژن از انواع پاتوتیپ بیماری‌زای گوارشی هستند که می‌توانند منجر به عوارض گوارشی در انسان شوند و به عنوان پاتوژن زئونوز بررسی می‌شوند. اشریشیاکلی انتروپاتوژن با چسبیدن و اثرگذاری بر مخاط پوششی روده‌ها منجر به اسهال می‌گردد. این نوع اشریشیاکلی واجد ژن اینتیمین (eae) و پلاسمید eaf است اما اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین علاوه بر اینکه واجد ژن های اتصال و اثرگذاری هستند قادر به تولید شیگاتوکسین نیز می‌باشند که به عنوان یک فاکتور حدت بسیار مهم در اشریشیاکلی مولد اسهال نقش دارند (21). این توکسین‌ها ابتدا از طریق یک گیرنده گلیکولیپیدی به نام gb3به سطح سلول متصل شده و سپس طی فرایند اندوسیتوز وارد سلول شده و طی یک روند آنزیمی با خارج کردن یک آدنین از 28s r RNA بخش 60s ریبوزوم فرایند سنتز پروتئین را در سلول مهار کرده و باعث مرگ سلول می‌شود (17و 19).

پروتئین اینتیمین یک پروتئین 34 کیلو دالتونی غشای خارجی می‌باشد و به وسیله ژن اینتیمین کد می‌شود (12). این پروتئین مسئول اتصال نزدیک باکتری به سلول‌های مخاطی روده و ایجاد آسیب طی مکانیسمی به نام اتصال و تخریب می‌باشد (1). همولیزین از دیگر اگزوتوکسین‌های اشریشیاکلی است که خاصیت سیتوتوکسیک دارد و با ایجاد روزنه در سلول‌ها باعث تجزیه سلول می‌گردد. وجود ژن‌های کد کننده همولیزین مخصوصاً همولیزین A (hlyA) با شدت عفونت رابطه مستقیم دارد به طوری که 78 درصد اشریشیاکلی بیماری‌زای ایجاد کننده عفونت ‌‌های مجاری ادراری واجد این ژن بوده‌اند (6 و 21).

در خصوص اهمیت انتقال آلودگی اشریشیاکلی از طریق مدفوع حیوانات گزارش‌های متعددی وجود دارد. مطالعات اولیه، اهمیت پرندگان وحشی را در انتقال اشریشیاکلی تأیید کرده است (10). در مورد کلاغ و گاو ثابت شده که می‌توانند آب و مراتع را با مدفوع خود آلوده کنند (2، 7و 18).

 به نظر می‌رسد وجود ژن‌های حدت و از جمله شیگاتوکسین، همولیزین و اینتیمین در اشریشیاکلی، اهمیت این انتقال و ایجاد بیماری در میزبان را افزایش می‌دهد. در مطالعه‌ای از 22 ســویه اشریشیاکلی شیگاتوکسوژنیک جدا شــده از بیماران مبتلا به اسهال در مکزیــک توســط  گارسیا و همکاران در سال 2005، اکثر سویه‌ها یا ژن stx2 و یا ترکیبی از ژن‌های stx1 و eaeA را داشته اند، به طوری کـه 9 سویه ژن stx2، 9 سویه ژن‌های eaeA- stx1، 3 سـویه ژن stx1  و یک سویه هم ژن‌های hlyA- eaeA- stx1 را نشان دادند (5) که نشان از اهمیت ژن‌های حدت مورد بررسی در ایجاد بیماری‌زایی در انسان است.  اوﻟﻴﻦ ﺑﺎر ﺑﺮرﺳﻲ آﻟﻮدﮔﻲ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن ﺑﺎ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ در ﺳﺎل ١٩٩٧ ﻣﻄﺮح ﺷﺪ ﻛﻪ ﻓﺮاواﻧﻲ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻮژﻧﻴﻚ در 6/1 درصد ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن وﺣﺸﻲ ذﻛﺮ ﺷﺪ. اﻳﻦ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن در ﺗﻤﺎس ﻧﺰدﻳﻚ ﺑﺎ ﻓﺎرمﻫﺎى ﭘﺮورﺷﻲ ﻃﻴﻮر اﻫﻠﻲ ﺑﻮدﻧﺪ ﻛﻪ ﻣﻲ‌ﺗﻮاﻧﺴﺘﻨﺪ ﺑﺎ ﻣﻬﺎﺟﺮت، اﻣﻜﺎن اﻧﺘﻘﺎل اﻳﻦ ﺟﺪاﻳﻪ را ﺑﻴﻦ ﻓﺎرم‌ﻫﺎ ﻓﺮاﻫﻢ ﻛﻨﻨﺪ (20). علاوه بر آن، در ﻣﻄﺎﻟﻌات ﻗﺒﻠﻲ ژن اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ و ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ در سویه‌های اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ جدا شده از پرندگان ردﻳﺎﺑﻲ ﺷﺪه اﺳﺖ. ﻓﺮاواﻧﻲ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﺟﺪا ﺷﺪه از ﻃﻮﻃﻲﺳﺎﻧﺎن ﺣﺪود 11/17 درصد ﮔﺰارش ﺷﺪه اﺳﺖ و ﻓﺮاواﻧﻲ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻮژﻧﻴﻚ را در ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن ﺳﺎﻟﻢ 6/4 درصد ﺑﻴﺎن ﻛﺮده اﻧﺪ. در آن ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ، 47/8 درﺻﺪ ﻣﺮغ ﻋﺸﻖ، آﻟﻮدﮔﻲ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛلی ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ را ﻧﺸﺎن دادﻧﺪ (9).

 حضور اشریشیاکلی شیگاتوکسوژنیک در دستگاه گوارش کبوترها برای اولین بار توسط کباسی در سال 1993 گزارش شد که سویه‌های اشریشیاکلی را قادر به القای اثر سیتوتوکسیک بر روی سلول ها دانست (15). در پرندگان زینتی، ضیاالدینی و همکاران در سال 1399 ﻧﺸﺎن دادند که 57/18 درﺻﺪ از ﺟﺪاﻳﻪﻫﺎى اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ واﺟﺪ ژن اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ و 28/4 درﺻﺪ واﺟﺪ ژن stx ﺑﻮدﻧﺪ. 85/2 درصد واﺟﺪ ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ و ﺗﻨﻬﺎ ﻳﻚ ﺟﺪاﻳﻪ واﺟﺪ ژنﻫﺎى اﻳﻨﺘﻴﻤﻴﻦ و ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ و stx ﺑﻪﻃﻮر ﻫﻢزﻣﺎن ﺑﻮد. در آن مطالعه اگرچه ﻣﻨﺒﻊ ﻋﻔﻮﻧﺖ مشخص نیست اﻣﺎ به‌ نظر می‌رسد ﻧﮕﻬﺪارى ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن زﻳﻨﺘﻲ در ﻓﺮوﺷﮕﺎهﻫﺎى ﻋﺮﺿﻪﻛﻨﻨﺪه ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن زﻳﻨﺘﻲ در ﻣﺠﺎورت ﻛﺒﻮﺗﺮان اﻫﻠﻲ و وﺣﺸﻲ و احتمال آﻟﻮدﮔﻲ ﻛﺒﻮﺗﺮﻫﺎ ﺑﺎ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ ﻣﻲﺗﻮاﻧﺪ ﻣﻨﺸﺎء ﻋﻔﻮﻧﺖ ﺑﺎﺷﺪ (21).

در کشورهای در‌ حال توسعه، شناسایی عفونت‌های شیگاتوکسوژنیک غیر O157 پیچیده است. در قدم اول، بیشتر تلاش‌ها جهت شناسایی  O157انجام می‌شود و در قدم دوم، آزمایشگاه‌های بالینی باید سموم شیگا را در نمونه‌های مدفوع تشخیص دهند و سپس نمونه‌های مثبت برای بررسی‌های سروتیپی به آزمایشگاه‌های بهداشت عمومی ارسال شوند (7). عامل اصلی حدت در گروه شیگاتوکسوژنیک تولید پروتئین stx1 یا stx2 است. گفتنی است که بیرن و همکاران در سال 2014 گزارش دادند که سندرم اورمیک همولیتیک (Hemolytic Uremic Syndrome) به طور قابل توجهی با سویه‌های شیگاتوکسوژنیک که دارای eae و یا stx2 هستند در ارتباط است.

اگرچه تاکنون بیماری‌زایی اشریشیاکلی توکسوژنیک در دستگاه گوارش پرندگان مورد شک و شبهه است اما در این مطالعه به گزارش موردی ابتلا یک کبوتر اهلی به اسهال و جداسازی و ردیابی اشریشیاکلی و ژن های حدت اینتیمین و شیگاتوکسین پرداخته شده است که می تواند شواهدی بالینی مبنی بر احتمال بیماری‌زایی اشریشیاکلی توکسوژنیک در کبوتر باشد.

مواد و روش‌ها

نمونه گیری

یک قطعه کبوتر چاهی ماده با سن حدود 2 سال و وزن حدود 750 گرم در تاریخ 19 آبان 1398 به کلینیک دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی ارجاع داده شده است. این کبوتر از یک کلنی با حدود 50 کبوتر به کلینیک دامپزشکی

 

 آورده شده است. کبوتر مورد نظر با علایم بی اشتهایی و بی‌حالی معاینه شد. پرنده در طول دو روز گذشته دان قابل توجهی نخورده و قبل از شروع بیماری یک وعده غذایی را به شکل کامل از ضایعات سبزیجات خوراکی استفاده نموده است. در زمان مراجعه چینه دان خالی از مواد غذایی بود. صاحب پرنده قبلا مبادرت به مولتی ویتامین درمانی کرده و بنا به اظهارات او، قبل از این درمان، پرنده هیچ داروی دیگری را دریافت ننموده است. در معاینه دهان و محوطه حلق پرنده ضایعات دیفتریک کرم رنگ مشاهده گردید که با تهیه سواب مرطوب تک یاخته تاژک دار تریکوموناس گالینه مشاهده گردید. در معاینه، پرنده مبتلا به اسهال کف آلود و تا حدودی سبز رنگ بود که مبادرت به نمونه برداری و کشت بر روی محیط مک کانگی گردید. در محیط کشت باکتری سالمونلا جدا نشد اما باکتری اشریشیاکلی به وفور مشاهده گردید. در نمونه برداری از مدفوع، انگل یا تخم انگل مشاهده نگردید. پرنده به صورت علامتی با انروفلوکساسین و کلستین برای مدت 5 روز درمان گردید. یک هفته پس از تجویز دارو حال عمومی پرنده رو به بهبودی بود.

شناسایی اشریشیاکلی

به منظور شناسایی باکتری اشریشیاکلی، از سواب کلواک بر روی محیط مک کانگی کشت داده شد و برای 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در صورت رویت شدن پرگنه‌های لاکتوز مثبت (صورتی رنگ)، از پرگنه‌های مذکور بر روی محیط ائوزین متیلن بلو(Eosin Methylene-Blue)یا EMB  به صورت خطی کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پرگنه‌های لاکتوز مثبت که بر روی محیط  EMB ایجاد جلای سبز فلزی نمودند به صورت اولیه به عنوان باکتری اشریشیاکلی شناسایی شدند. سپس بر روی این پرگنه‌ها تست های افتراقی IMVIC انجام شد. در صورتی که از لحاظ تست‌های بیوشیمیایی تولید ایندول، احیای متیل رد، واکنش Voges - Proskawer  و احیای سیترات به ترتیب به صورت مثبت، مثبت، منفی، منفی بودند به عنوان اشریشیاکلی شناسایی شدند (21).

استخراج  DNA

 برای استخراج DNA از روش جوشاندن استفاده شد (8). از کشت 24 ساعته باکتری در محیط Brain Heart Infusion به عنوان منبع DNA استفاد شد.

آزمون  PCR

 برای انجام PCR از دستگاه Master Cycler Gradiant استفاده شد.  PCRدر حجم 50 میکرولیتر شامل یک میکرولیترDNA تخلیص شده (حدود 50 نانوگرم)، 10 میلی‌مول تریس هیدروکلریدریک (اسیدیته 4/8)، 10 میلی‌مول کلرید پتاسیم، 3 میلی‌مول کلرید منیزیم، 2 میلی‌مول از هر کدام از پرایمرها، 2/0 میلی‌مول از هرکدام dntp ها و یک واحد  Taq- Polymerase  و مابقی تا 50 میکرولیتر آب دوبار تقطیر استریل (8/33 میکرولیتر) انجام شد. مشخصات پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 آمده است. برای تعیین فاکتورهای حدت در جدایه‌های اشریشیاکلی جدا شده از زوج پرایمرهای معرفی شده توسط فاگان و همکاران در سال 1999 استفاده شد (6). برنامه حرارتی برای انجام PCR  شامل یک سیکل 95 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و 35 سیکل تکراری شامل واسرشت سازی در دمای 95 درجه سانتیگراد در 20 ثانیه، همسرشت سازی در دمای 58 درجه سانتیگراد به مدت 40 ثانیه، گسترش در دمای 72 درجه سانتیگراد برای 90 ثانیه و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه بود. در پایان محصول PCR بر روی ژل آگارز 2 درصد به مدت 40 دقیقه با ولتاژ 100 ولت و 400 میلی آمپر الکتروفورز گردید.

 

 

جدول 1- اختصاصات پرایمرهای مورد استفاده

نام پرایمر

توالی پرایمر

اندازه قطعه (جفت بازی)

EHEC hly

F: ACGATGTGGTTTATTCTGGA

R: CTTCACGTGACCATACATAT

165

stx1

F: ACACTGGATGATCTCAGTGG

R: CTGAATCCCCCTCCATTATG

614

stx2

F: CCATGACAACGGACAGCAGTT

R: CCTGTCAACTGAGCAGCACTTTG

779

eaeA

F: GTGGCGAATACTGGCGAGACT

R: CCCCATTCTTTTTCACCGTCG

890

 

 

نتایج

در این بررسی، در مرحله اول باکتری اشریشیاکلی بر روی محیط مک کانگی و EMB جداسازی شد. با ظهور پرگنه‌های صورتی بر روی مک کانگی و پرگنه‌های سبز با جلای فلزی بر روی EMB  اشریشیاکلی به صورت اولیه شناسایی شد و پس از انجام تست‌های بیوشیمیایی IMVIC مورد تایید قرار گرفت. برای شناسایی ژن‌های حدت، محصول استخراج شده ژنوم باکتری در 3 واکنش زنجیره ای مجزا با پرایمر های اختصاصی تکثیر شد که فقط ژن‌های شیگاتوکسین1 (stx1) و اینتیمین (eae) با طول قطعات 614 و 890 جفت بازی تکثیر و ردیابی شد (شکل 1).

 

 

شکل 1- تصویر ژل الکتروفورز محصول PCR (ستون 1: مارکر 100 جفت بازی، ستون 2: قطعه 614 جفت بازی مربوط به نمونه مثبت واجد ژن stx1، ستون 3: قطعه 890 جفت بازی مربوط به نمونه مثبت واجد ژن eae و ستون 4: کنترل منفی)

 

 

بحث

ﻧﺘﺎﻳﺞ ﻧﺸﺎن داد سویه اشریشیاکلی جدا شده از کبوتر با علایم اسهال واجد ژن‌های حدت شیگاتوکسین 1 و اینتیمین بوده و فاقد ژن کد کننده همولیزین و شیگاتوکسین 2 می‌باشد. نتایج مطالعه اخیر در خصوص ﻋﺪم ردﻳﺎﺑﻲ ژن ﻫﻤﻮﻟﻴﺰﻳﻦ در ﺳﻮﻳﻪ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ واﺟﺪ ژن ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ، با مطالعه ضیاالدینی و همکاران هم راستا است و ﺑﻪﻧﻈﺮ ﻣﻲ رﺳﺪ اﻳﻦ ﺟﺪاﻳﻪ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ واﺟﺪ ژن ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ از ﻧﻮع ﻏﻴﺮ ٧ :H١٥٧O ﺑﺎﺷﺪ. ﭘﻴﺶﺗﺮ ﻧﻴﺰ ﮔﺰارشﻫﺎى زﻳﺎدى ﻣﻨﺘﺸﺮ ﺷﺪه ﻛﻪ ﻧﺸﺎن ﻣﻲ‌دﻫﺪ اﮔﺮﭼﻪ از ﮔﻮﻧﻪﻫﺎى ﻣﺨﺘﻠﻒ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦزا ﺟﺪا ﺷﺪه اﺳﺖ اﻣﺎ در اﻛﺜﺮ ﻣﻮارد ﺳﺮوﺗﻴﭗ ٧ :H١٥٧O ﺟﺪا ﻧﺸﺪه اﺳﺖ. ﻟﺬا ﻃﺒﻖ ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺑﻪدﺳﺖ آﻣﺪه از این مطالعه و ﺳﺎﻳﺮ ﻣﻄﺎﻟﻌات مشابه ﺑﻪﻧﻈﺮ ﻣﻲرﺳﺪ ﻓﺮاواﻧﻲ ﺟﺪاﻳﻪﻫﺎى اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ غیر ١٥٧O در ﻣﺪﻓﻮع ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن از ﻣﻮارد ٧ :H١٥٧O ﺑﻴﺶﺗﺮ ﺑﺎﺷﺪ. اﻳﻦ ﻳﺎﻓﺘﻪ اﻫﻤﻴﺖ ﻣﻮﺿﻮع اﻧﺘﻘﺎل اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﻤﺎس ﺑﺎ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن را دوﭼﻨﺪان ﻣﻲﻛﻨﺪ. ﭼﺮا ﻛﻪ ﻣﻤﻜﻦ اﺳﺖ ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن در ﺣﺎﻟﻲﻛﻪ ﻫﻴﭻﮔﻮﻧﻪ ﻋﻼﺋﻢ ﺑﺎﻟﻴﻨﻲ ﻧﺪاﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﻨﺪ ﻣﻨﺒﻊ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ از ﻧﻮع ﻏﻴﺮ ٧ :H١٥٧O ﺑﺎﺷﻨﺪ (16).

در مطالعه اخیر اشریشیاکلی جدا شده واجد ژن stx1 بود که مطابق یافته بیرن و همکاران ممکن است از بیماری‌زایی کمتری برخوردار باشد. بیرن و همکاران در سال 2014 گزارش دادند که سندرم اورمیک همولیتیک (Hemolytic Uremic Syndrome) به طور قابل توجهی با سویه‌های شیگاتوکسوژنیک که دارای eae و یا stx2 هستند در ارتباط است. در این مطالعه نیز بیشتر جدایه‌ها دارای ژن  stx1 بودند (3). بهرحال جداسازی اشریشیاکلی واجد ژن‌های حدت شیگاتوکسین و اینتیمین از کبوتر واجد علایم گوارشی این تصور را القا می‌کند که ممکن است اشریشیاکلی جدا شده در ایجاد این علایم گوارشی نقش داشته باشد. قبلاً کورکسون و ﻫﻤﻜﺎران در ﺳﺎل ٢٠١٣ ﻋﺪم وﺟﻮد ﮔﻴﺮﻧﺪهﻫﺎىGlobotriaosylceramide   را روى ﺳﻠﻮلﻫﺎى paneth در ﻣﺨﺎط روده، دﻟﻴﻞ ﻋﺪم ﺣﺴﺎﺳﻴﺖ و ﻋﺪم ﺑﺮوز ﻋﻼﻳﻢ ﻛﻠﻴﻨﻴﻜﻲ در ﭘﺮﻧﺪﮔﺎن آﻟﻮده ﺑﻪ اﺷﺮﻳﺸﻴﺎﻛﻠﻲ ﻣﻮﻟﺪ ﺷﻴﮕﺎﺗﻮﻛﺴﻴﻦ ﺑﻴﺎن ﻧﻤﻮدﻧﺪ (4).

نتیجه گیری

 لذا با توجه به شواهد بالینی موجود، مطالعات بیشتر و دقیق‌تری حتی به شکل چالش تجربی لازم است تا نقش اشریشیاکلی توکسوژنیک در ایجاد علایم گوارشی در پرندگان مشخص شود. به طور کلی، با توجه به اهمیت اشریشیاکلی توکسوژنیک در ایجاد عوارض گوارشی در انسان، کبوتر می‌تواند به عنوان ناقل این اجرام بیماری‌زا مطرح باشد.

تعارض منافع

نویسندگان مقاله تعارض در منافع ندارند.

 

 

 

فهرست منابع

  1. 1. Adeli, Z., Firoozeh, F., Zibaei, M., Shakib, P. )2013(. Prevalence of Shiga toxin and Intimine genes in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from urine samples in Lorestan, Iran. FEYZ, 17(2); 188-194.
  2. 2. Awad-Alla, M.E., Abdien, H.M., Dessouki, A.A. )2010(. Prevalence of bacteria and parasites in White Ibis in Egypt. Vet. Ital., 46(3); 277-86.
  3. 3. Byrne, L., Vanstone, G.L., Perry, N.T., Launders, N., Adak, G.K., Godbole, G., et al. )2014(. Epidemiology and microbiology of Shiga toxin-producing Escherichia coli other than serogroup O157 in England, 2009–2013. J. Med. Mic., 63(9); 1181-1188.
  4. 4. Croxen, M.A., Law, R.J., Scholz, R., Keeney, K.M., Wlodarska, M., Finlay, B.B. )2013(. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clin. Mic. Rev., 26(4); 822-880.
  5. 5. Estrada-García, T., Cerna, J.F., Paheco-Gil, L., Velázquez, R.F., Ochoa, T.J., Torres, J., et al. )2005(. Drug-resistant diarrheogenic Escherichia coli, Mexico. Emerg. Infect. Dis., 11(8); 1306.
  6. 6. Fagan, P.K., Hornitzky, M.A., Bettelheim, K.A., Djordjevic, S.P. )1999(. Detection of Shiga-like toxin (stx1 andstx2), intimin (eaeA), and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hemolysin (EHEC hlyA) genes in animal feces by multiplex PCR. Appl. Environ. Microbiol., 65(2); 868-872.
  7. 7. Friesema, I., Van Der Zwaluw, K., Schuurman, T., Kooistra-Smid, M., Franz, E., Van Duynhoven, Y., et al. )2014(. Emergence of Escherichia coli encoding Shiga toxin 2f in human Shiga toxin-producing coli (STEC) infections in the Netherlands, January 2008 to December 2011. Eurosurveillance., 19(17(; 20787.
  8. 8. Gholami-Ahangaran, M., Zia-Jahromi, N. )2014(. Identification of shiga toxin and intimin genes in Escherichia coli detected from canary (Serinus canaria domestica). Toxicol.Indust. Health., 30(8); 724-727.
  9. 9. Gioia-Di Chiacchio, R.M., Cunha, M.P.V., Sturn, R.M., Moreno, L.Z., Moreno, A.M., Pereira, C.B.P., et al. )2016(. Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC): Zoonotic risks associated with psittacine pet birds in home environments. Vet. Microbiol., 184; 27-30.
  10. 10. Guenther, S., Ewers, C., Wieler, L.H. )2011(. Extended-spectrum beta-lactamases producing coli in wildlife, yet another form of environmental pollution. Front. Microbiol., 2; 246.
  11. 11. Haag-Wackernagel, D., Moch, H. )2004(. Health hazards posed by feral pigeons. J Infect., 48(4); 307-313.
  12. 12. Hosseini, S., Ranjbar, R., Zahrayi Salehi, T. )2016(. The Identification of pathogenic Escherichia coli strains to carry intimin gene isolated from various water sources. Iran. J. Med. Microbiol., 10(4); 17-24.
  13. 13. Kimpe, A., Decostere, A., Martel, A., Haesebrouck, F., Devriese, L.A. )2002(. Prevalence of antimicrobial resistance among pigeon isolates of Streptococcus gallolyticus, Escherichia coli and Salmonella enterica serotype Typhimurium. Avian Pathol., 31(4); 393-397.
  14. 14. Mora, A., Blanco, M., Blanco, J.E., Dahbi, G., López, C., Justel, P., et al. )2007(. Serotypes, virulence genes and intimin types of Shiga toxin (verocytotoxin)-producing Escherichia coli isolates from minced beef in Lugo (Spain) from 1995 through 2003. BMC Microbiol., 7(1); 13.
  15. 15. Morabito, S., Dell’Omo, G., Agrimi, U., Schmidt, H., Karch, H., Cheasty, T., et al. )2001(. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli in feral pigeons. Vet. Microbiol., 82(3); 275-283.
  16. 16. Nolan, L.K., Barnes, H.J., Vaillancourt, J.P., Abdul-Aziz, T., Logue, C.M. )2020(. Colibacillosis. In: Disease of Poultry. Swayne, D.E., Boulianne, M., Logue, C.M., McDougald, L.R., Nair, V. and Suarez, D.L. editors. 14th ed., Massachusetts: Wiley-Blackwell, pp: 770-790.
  17. 17. Paton, J.C., Paton, A.W. )1998(. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli Clin. Microbiol. Rev., 11(3); 450-479.
  18. 18. Persad, A.K., Lejeune, J.T. )2015(. Animal reservoirs of Shiga toxin-producing Escherichia coli. In Enterohemorrhagic Escherichia coli and Other Shiga Toxin-Producing E. coli. Am. Soc. Microbiol., 231-244.
  19. 19. Sandvig, K. )2001(. Shiga toxins. Toxicon, 39(11); 1629-1635.
  20. 20. Schmidt, H., Scheef, J., Morabito, S., Caprioli, A., Wieler, L.H., Karch, H. )2000(. A new Shiga toxin 2 variant (Stx2f) from Escherichia coli isolated from pigeons. Appl. Environ. Microbiol., 66(3); 1205-1208.
  21. 21. Ziauddini, A.H., Gholami-Ahangaran, M., Ahmadi-Dastgerdi, A. )2020(. Detection of virulence genes of intimin, hemolysin and shigatoxin in Escherichia coli isolated from Pscittacin. New Cell. Molecul. Biotechnol. J., 10(38); 61-68.

 

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

The detection of virulence genes of shigatoxin and intimin in Escherichia coli isolated from a pigeon with gastrointestinal symptoms: A case report

Majid Gholami-Ahangaran1, Mehrdad Ostadpoor2, Anita Khani2

  1. Associate Professor, Group of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran. Corresponding Author: mgholami6@gmail.com
  2. Graduated of Veterinary Medicine Faculty, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran

 

Received:2020.11. 19                                                                                  Accepted: 2021.05.12

Abstract

Background & Aim : Escherichia coli (E. coli) is found as a flora in the digestive tract of all warm-blooded animals, including pigeons. This bacterium has many virulent genes including shigatoxin and intimin. Intimin is responsible for binding E. coli to intestinal mucosal cells, and shigatoxin causes cell death. The aim of recent study was to investigate the presence of these virulence genes in E. coli isolated from a case of gastrointestinal infection in pigeons in order to determine the possibility of pathogenic E. coli with origin of pigeons in humans.

Materials and Methods: In this regard, to identify virulent genes in E. coli isolated from diarrheic pigeon, a cloaca swab was prepared from a pigeon with diarrhea symptoms. After microbial culture and purification, the infection to E. coli was confirmed by biochemical examinations. Then, DNA was extracted by boiling method and hemolysin, intimin and sub unites of shigatoxin (stx1 & stx2) genes were detected. The target genes were identified by specific primers based on amplification of target genes with specific fragment lengths (165, 890, 614 and 779 bp, respectively).

Results: The E. coli strain isolated from pigeon with symptom of diarrhea had the virulence genes of stx1 and intimin and lacks the genes encoding hemolysin and stx2.

Conclusion: The results showed that the virulence genes of shigatoxin 1 and intimin were detectable in pigeons with gastrointestinal symptoms. According to these results, contrary to previous perceptions, birds may be the source of shigatoxogenic E. coli, and the symptoms of diarrhea in pigeons may be related to the presence of Shigatoxin and intimine in E. coli, which needs to be further investigated.

Keywords: E. coli, Intimin, hemolysin, shigatoxin, pigeon

 
   

 

مراجع
  1. 1. Adeli, Z., Firoozeh, F., Zibaei, M., Shakib, P. )2013(. Prevalence of Shiga toxin and Intimine genes in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from urine samples in Lorestan, Iran. FEYZ, 17(2); 188-194.
  2. 2. Awad-Alla, M.E., Abdien, H.M., Dessouki, A.A. )2010(. Prevalence of bacteria and parasites in White Ibis in Egypt. Vet. Ital., 46(3); 277-86.
  3. 3. Byrne, L., Vanstone, G.L., Perry, N.T., Launders, N., Adak, G.K., Godbole, G., et al. )2014(. Epidemiology and microbiology of Shiga toxin-producing Escherichia coli other than serogroup O157 in England, 2009–2013. J. Med. Mic., 63(9); 1181-1188.
  4. 4. Croxen, M.A., Law, R.J., Scholz, R., Keeney, K.M., Wlodarska, M., Finlay, B.B. )2013(. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clin. Mic. Rev., 26(4); 822-880.
  5. 5. Estrada-García, T., Cerna, J.F., Paheco-Gil, L., Velázquez, R.F., Ochoa, T.J., Torres, J., et al. )2005(. Drug-resistant diarrheogenic Escherichia coli, Mexico. Emerg. Infect. Dis., 11(8); 1306.
  6. 6. Fagan, P.K., Hornitzky, M.A., Bettelheim, K.A., Djordjevic, S.P. )1999(. Detection of Shiga-like toxin (stx1 andstx2), intimin (eaeA), and enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hemolysin (EHEC hlyA) genes in animal feces by multiplex PCR. Appl. Environ. Microbiol., 65(2); 868-872.
  7. 7. Friesema, I., Van Der Zwaluw, K., Schuurman, T., Kooistra-Smid, M., Franz, E., Van Duynhoven, Y., et al. )2014(. Emergence of Escherichia coli encoding Shiga toxin 2f in human Shiga toxin-producing coli (STEC) infections in the Netherlands, January 2008 to December 2011. Eurosurveillance., 19(17(; 20787.
  8. 8. Gholami-Ahangaran, M., Zia-Jahromi, N. )2014(. Identification of shiga toxin and intimin genes in Escherichia coli detected from canary (Serinus canaria domestica). Toxicol.Indust. Health., 30(8); 724-727.
  9. 9. Gioia-Di Chiacchio, R.M., Cunha, M.P.V., Sturn, R.M., Moreno, L.Z., Moreno, A.M., Pereira, C.B.P., et al. )2016(. Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC): Zoonotic risks associated with psittacine pet birds in home environments. Vet. Microbiol., 184; 27-30.
  10. 10. Guenther, S., Ewers, C., Wieler, L.H. )2011(. Extended-spectrum beta-lactamases producing coli in wildlife, yet another form of environmental pollution. Front. Microbiol., 2; 246.
  11. 11. Haag-Wackernagel, D., Moch, H. )2004(. Health hazards posed by feral pigeons. J Infect., 48(4); 307-313.
  12. 12. Hosseini, S., Ranjbar, R., Zahrayi Salehi, T. )2016(. The Identification of pathogenic Escherichia coli strains to carry intimin gene isolated from various water sources. Iran. J. Med. Microbiol., 10(4); 17-24.
  13. 13. Kimpe, A., Decostere, A., Martel, A., Haesebrouck, F., Devriese, L.A. )2002(. Prevalence of antimicrobial resistance among pigeon isolates of Streptococcus gallolyticus, Escherichia coli and Salmonella enterica serotype Typhimurium. Avian Pathol., 31(4); 393-397.
  14. 14. Mora, A., Blanco, M., Blanco, J.E., Dahbi, G., López, C., Justel, P., et al. )2007(. Serotypes, virulence genes and intimin types of Shiga toxin (verocytotoxin)-producing Escherichia coli isolates from minced beef in Lugo (Spain) from 1995 through 2003. BMC Microbiol., 7(1); 13.
  15. 15. Morabito, S., Dell’Omo, G., Agrimi, U., Schmidt, H., Karch, H., Cheasty, T., et al. )2001(. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli in feral pigeons. Vet. Microbiol., 82(3); 275-283.
  16. 16. Nolan, L.K., Barnes, H.J., Vaillancourt, J.P., Abdul-Aziz, T., Logue, C.M. )2020(. Colibacillosis. In: Disease of Poultry. Swayne, D.E., Boulianne, M., Logue, C.M., McDougald, L.R., Nair, V. and Suarez, D.L. editors. 14th ed., Massachusetts: Wiley-Blackwell, pp: 770-790.
  17. 17. Paton, J.C., Paton, A.W. )1998(. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli Clin. Microbiol. Rev., 11(3); 450-479.
  18. 18. Persad, A.K., Lejeune, J.T. )2015(. Animal reservoirs of Shiga toxin-producing Escherichia coli. In Enterohemorrhagic Escherichia coli and Other Shiga Toxin-Producing E. coli. Am. Soc. Microbiol., 231-244.
  19. 19. Sandvig, K. )2001(. Shiga toxins. Toxicon, 39(11); 1629-1635.
  20. 20. Schmidt, H., Scheef, J., Morabito, S., Caprioli, A., Wieler, L.H., Karch, H. )2000(. A new Shiga toxin 2 variant (Stx2f) from Escherichia coli isolated from pigeons. Appl. Environ. Microbiol., 66(3); 1205-1208.
  21. 21. Ziauddini, A.H., Gholami-Ahangaran, M., Ahmadi-Dastgerdi, A. )2020(. Detection of virulence genes of intimin, hemolysin and shigatoxin in Escherichia coli isolated from Pscittacin. New Cell. Molecul. Biotechnol. J., 10(38); 61-68.
آمار
تعداد مشاهده مقاله: 48
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 34


سامانه مدیریت نشریات علمی. قدرت گرفته از سیناوب