مطالعه تنوع مولکولی باکتری پاستورلا مولتوسیدا در جدایه‌های گاوی و گاومیشی استان آذربایجانشرقی به روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 2، دوره 8، 1 (29) بهار، خرداد 1393، صفحه 367-372   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

جلال شایق^{* 1}؛ علی‌رضا منادی²؛ جلیل دولگری‌شرف³

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، استادیار گروه دامپزشکی، شبستر، ایران.

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، استادیار گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران.

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شبستر، کارشناس ارشد گروه دامپزشکی، شبستر، ایران.

چکیده

   در مقاله حاضر، جهت مطالعه بیشتر تنوع ژنتیکی جدایه‌های باکتری پاستورلا مولتوسیدا جدا شده از گاو و گاومیش تعداد 10 نمونه شامل 8 نمونه گاوی و 2 نمونه گاومیشی با روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی مورد مطالعه قرار گرفت. این روش با استفاده از آنزیم آندونوکلئازHha-I  اجرا و در نتیجه دو نوع الگوی مشخصI و IIتولید شد. در هر دو الگو نمونه‌های گاوی و گاومیشی حضور داشتند. برخلاف مطالعات مشابه تنوع ژنتیکی این جدایه‌ها اندک بود. در ضمن با توجه به مشابهت سویه‌های گاومیشی و گاوی در این مطالعه، پیشنهاد می‌گردد مطالعه دیگری با نمونه‌های بیشتر جهت بررسی امکان انتقال سویه‌های گاوی و گاومیشی در میان هم بررسی گردد.

کلیدواژه‌ها

پاستورلا مولتوسیدا؛ گاو و گاومیش؛ روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی؛ تنوع مولکولی

اصل مقاله

مقدمه

   پاستورلا مولتوسیدا یکی از عوامل باکتریائی بسیار مهم در بیماری‌های گاو و گاومیش بوده  و علاوه بر آن در گوسفند،  خوک و طیور نیز ایجاد بیماری می‌کند. این باکتری در گاو عامل سپتی سمی هموراژیک (Hemorrhagic septicemia) و یکی از عوامل دخیل در تب حمل و نقل و پاستورلوز ریوی گاوی (Bovine pneumonic pasteurellosis) می‌باشد. در گوسفند نیز پاستورلا مولتوسیدا از عوامل دخیل در پاستورلوز ریوی محسوب می‌شود. این بیماری یکی از مشکلات جدی در طب گاو و گوسفند بوده و امروزه تلاش‌های بسیاری در جهت مبارزه و پیشگیری از این بیماری در حال انجام می‌باشد (Quine et al., 2002).

   مطالعه و تعیین تیپ در پاستورلا مولتوسیدا  به هر دو روش فنوتیپی و ژنوتیپی مورد ارزیابی قرار گرفته و سیستم‌های متعددی برای آن مطرح است. اما روش‌های مطالعه فنوتیپی پاستورلامولتوسیدا با ایراداتی روبرو می‌باشند (Towensend et al., 2001). بنابراین، در سال‌های اخیر استفاده از روش‌های شناسائی و دسته‌بندی با روش‌های مولکولی رایج گردیده و تلاش‌های بسیاری در جهت تقسیم‌بندی باکتری بر پایه خصوصیات ژنتیکی در حال انجام است. از روش‌های مهم تعیین ژنوتیپی می‌توان به روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی (Restrictions endonuelease analysis, REA)،   Ribotyping،  Pulsed field gel electrophoresis ،  Multilocus enzyme electrophoresis  و نیز REP-PCR (Repetitive- extragenic plaindormic PCR) اشاره کرد. در میان این روش‌ها روش REA  به تنهائی یا در کنار روش Ribotyping جهت تعیین قرابت اپیدمیولوژیک بین جدایه‌های مختلف شده و میزان صحت حساسیت و اختصاصیت این روش بسیار بالا ارزیابی گردیده است (Blackall and Miffin, 2000).

تاکنون استفاده از روش فوق در مطالعات اپیدمیولوژیک جدایه‌های  پاستورلا مولتوسیدا از طیور، گاو، خوک وگوزن نتایج مطلوبی را در پی داشته است (Davise et al., 2004; Weiser et al., 2003) تاکنون دو مطالعه با این روش در ایران روی جدایه‌های پاستورلا مولتوسیدا در طیور و نیز بز و گوسفند انجام شده است (Jabbari et al., 2002; Shayegh et al., 2011).

 

مواد و روش­ها

   تهیه جدایه‌ها: در مطالعه حاضر تعداد 10 جدایه حاصل از پنومونی گاو که در آزمایشگاه میکربیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شبستر قبلاً مورد مطالعات بیوشیمیائی قرار گرفته و به روش مولتی پلکس PCR  تایید و نیز از نظر کپسولی تعیین تیپ شده بود (Shayeh et al., 2010a)، تهیه شد (جدول 1). 

    استخراج:DNA  روش استخراج DNA برای همه جدایه‌ها با استفاده از پروتکل بلاکال و همکاران، با اصلاحاتی به شرح ذیل انجام گردید (Blackall et al., 1995). ابتدا 2 تا 3 پرگنه پاستورلا مولتوسیدا در محیط BHI broth  (مرک) ، داخل لوله‌های درپیچ دار به ابعاد 12×16 کشت داده شده و در دمای 37 درجه سلسیوس  با حرکت ملایم به‌مدت 24ساعت انکوبه شدند. لوله حاوی باکتری درrpm 6000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند. مایع رویی بیرون ریخته شد و یک میلی‌لیتر  از بافر فسفاته نمکی (PBS) به پلیت حاصله افزوده گردید. در مرحله بعد محتوای لوله به یک میکروتیوب 5/1 میکرولیتری تمیز ریخته شده، مجدداً در g1000 به‌مدت 10 دقیقه به‌منظور شستشو سانتریفیوژ انجام گرفت. این عمل 3 بار تکرار شد. سپس مقدار یک میلی‌لیتر از بافر سالین 85/0 درصد وEDTA  05/0 مولار به آن افزوده و به‌شدت  ورتکس شد. در مرحله بعد مقدارl µ1000  از محلول لیزوزیم (فرمنتاز) با غلظتی برابرmg/ml 20 به میکروتیوب فوق  افزوده گردیده و در داخل بن ماری با  دمای 37 درجه سلسیوس  به‌مدت 60 دقیقه انکوبه و سپس به آرامی مخلوط گردید. مقدارl  µ100  از محلول  SDS25 درصد به  میکروتیوب فوق  افزوده و دوباره به آرامی مخلوط شد. در مرحله بعد مقدارl µ10 از محلول پروتئیناز k  با غلظتی برابر  mg/ml 4/21 به  میکروتیوب فوق  افزوده شده و در داخل یخ به مدت 15دقیقه انکوبه و سپس به آرامی مخلوط گردید. میکروتیوب فوق در داخل بن‌ماری با  دمای 65 درجه سلسیوس به‌مدت 25 دقیقه انکوبه و  مقدارl µ 5/10 ازمحلول  RNase با غلظتی برابر mg/ml 10به میکروتیوب فوق  افزوده و در داخل بن‌ماری با  دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 30 دقیقه  انکوبه و سپس  به آرامی سر و ته گردید. در مرحله بعدی مقدارl µ 800  از محلول کلروفرم-فنل (1 به 1) به عصاره فوق افزوده شده و با احتیاط و به آرامی مخلوط گردید. پس از آن میکروتیوب فوق در rpm 14000 به‌مدت 5 دقیقه در 4 درجه سلسیوس سانتریفیوژ شد. فاز رویی داخل میکروتیوب به یک میکروتیوب 5/1 میلی‌لیتری جدید و تمیز انتقال داده شد. مقدار 25/0 حجم کلی از محلول استات سدیم 3 مولار به محتوای میکروتیوب فوق افزوده و به آرامی مخلوط شد. مقدار 5/2 برابر حجم کلی از اتانول مطلق با دمای 20- درجه سلسیوس به محتوای میکروتیوب فوق افزوده و به آرامی مخلوط گردیده و در فریزر 20- درجه سلسیوس به‌مدت 30 دقیقه انکوبه گردید. پس از انکوباسیون، میکروتیوب‌ها در دور rpm  14000 به‌مدت 5 دقیقه در 4+ درجه سانتریفیوژ گردیدند. اتانول با وارونه قرار دادن میکروتیوب حاوی DNA استخراج شده، خارج و تا  خشک شدن کامل در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. پس از آن مقدار µl 100 آب  دیونیزه  به آن اضافه  و به آرامی با سمپلر مخلوط شد. پس از استخراج بلافاصله غلظت DNA استخراج شده با اسپکتروفتومتر در طول موج‌های 280 و 260 نانومتر محاسبه گردید.

   اجرای روش REA با استفاده از آنزیم HhaI: پس از تنظیم غلظت DNA استخراج شده به میزان 5 میکروگرم روش REA پیشنهاد شده توسط Sambrook (1995)،  به‌مدت 3 ساعت مورد هضم آنزیمی با آنزیم HhaI قرار داده و پس از خنثی‌سازی آنزیم طبق بروشور کارخانه سازنده مقدار 20میکرولیتر از DNA هضم شده با 4 میکرولیتر از 6xLoading Dye solution  مخلوط و به‌صورت افقی در ژلی از آگارز با غلظت  7/0 درصد در 25 ولت و به‌مدت 16 ساعت الکتروفورز گردید. ژل حاصله به‌مدت 30 دقیقه در اتیدیوم بروماید، رنگ‌آمیزی و سپس با استفاده از دستگاه UV Thech عکس­برداری گردید.

 

یافته­ها

   روشREA با استفاده از آنزیم HhaI: نتایج حاصل از استخراج DNA پس از ارزیابی با روش اسپکتروفتومتر و الکتروفورز نشان از استخراج با نتایج مطلوب و غلظت مناسب داشت. نتایج حاصل از اجرای روش تعیین تیپ REA پس از استخراج DNA رضایت‌بخش بوده و الگوهای حاصل از هضم آنزیمی در شکل 1 ارائه شده­اند. بررسی الگوهای حاصله از REA  وجود 2 الگو (I و II) را نشان می‌دهد. هر دو الگوی حاصله بین جدایه‌های به‌دست آمده از گاو و گاومیش مشترک بودند (جدول 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل1-M : نشانگر فاژی لامبدا، I: الگوی شماره I ،II: الگوی شماره II

 

جدول 1- نمونه‌های مورد استفاده و نتایج حاصله

شماره جدایه	میزبان جدا شده	ژنوتیپ کپسولی	الگوی REA
1	گاو	A	I
2	گاومیش	D	I
3	گاو	B	I
4	گاو	A	II
5	گاو	A	II
6	گاومیش	A	II
7	گاو	A	II
8	گاو	B	II
9	گاو	B	II
10	گاو	B	II

 

بحث و نتیجه­گیری

   مطالعه حاضر، اولین مطالعه ژنوتیپی درخصوص جدایه‌های پاستورلا مولتوسیدای گاوی و گاومیشی در ایران با روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی است. نتایج تنها دو نوع الگوهای حاصله از روش مذکور را نشان می‌دهد. این نتایج در مقایسه با نتایج مطالعات مشابه در ایران (Jabbari et al., 2002; Shayegh et al., 2011) بیان می‌دارد که جدایه‌های گاوی و گاومیشی برخلاف جدایه‌های گوسفندی و بزی و همچنین جدایه‌های طیور دارای تنوع ژنتیکی کمتری می‌باشند و در تیپ­بندی به این روش به الگوهای کمتری تعلق می‌گیرند.

   شایق و همکاران (2011) در مطالعه جدایه‌های بزی و گوسفندی توانسته‌اند آنها را به ترتیب در 5 و 6 گروه تقسیم‌بندی نمایند (Shayegh et al., 2011). مطالعه جباری و همکاران (2002) نیز تنوع بیشتری را در میان جدایه‌های طیور در کشور نشان می‌دهد (Jabbari et al., 2002).

   نتایج این مطالعه با یافته‌های  دیویس در سال 2004روی جدایه‌های گاوی مغایرت دارد.   در مطالعه دیویس (2004)  این تنوع بیشتر گزارش شده است و شاید این امر به‌دلیل محدود بودن نمونه‌های گاوی و گاومیشی در مطالعه حاضر باشد (Davise et al., 2004).

   مطالعه توامان تعلق تیپ‌های کپسولی مختلف به الگوهای مشخص روش برش با آنزیم‌های تعیین حدودی در مطالعه حاضر رابطه خاصی را بین این دو دسته نشان نمی‌دهد. در مطالعات مشابه نیز چنین ارتباطی ملاحظه نگردیده بود. بنابراین نتایج حاصل از این مطالعه نتایج مطالعات قبلی را تصدیق می‌کند (Jabbari et al., 2002; Shayegh et al., 2011).

   ارتباط میان جدایه‌های گاوی با گاومیشی که تنها در دو الگو دیده می‌شوند و شاید احتمال تبادلات جدایه‌ائی میان این دو گونه میزبانی را مطرح سازد. هر چند تعداد بیشتری جدایه از هر دو میزبان برای چنین ادعایی لازم است. برخی از مطالعات امکان چنین رویدادی را در میان دو میزبان گوسفند و بز در حیات وحش (Wesseir et al., 2002; Rudolph et al., 2003) و در گله‌های مخلوط گوسفند و بز در روش سنتی نگه‌داری ایشان در برخی کشورها از جمله ایران (Shayeh, et al., 2010b; Shayegh et al., 2011) محتمل دانسته‌اند. احتمال وجود چنین ارتباطی در میان گاو و گامیش نیز با توجه به سیستم پرورشی سنتی این دو حیوان در ایران نیز دور از ذهن نیست.

   با توجه به نتایج به­دست آمده احتمال تبادل جدایه‌های گاوی و گاومیشی مطرح می­گردد. پیشنهاد می­شود این فرضیه با تعداد جدایه­های بیشتر پاستورلا مولتوسیدا و نیز روش­های دیگر همچون بررسی تشابه توالی sRNA 16 تکرار گردد.

مراجع

• Blackall, P.J. and Mifin, J.K. (2000). A review of Identification and typing of Pasteurella multocida Avian Pathology, 29: 271-287.
• Blackall, P.J., Pahoff, J.L., Marks, D., Fegan, N. and Morrow, C.J. (1995). Characterization of Pasteurella multocida isolates from fowl cholera outbreaks on seven turkey farms. Australian Veterinary Journal, 72(4): 135-138.
• Davies, R.L., MacCorquodale, R. and Reilly, S. (2004). Characterisation of bovine strains 2 of Pasteurella multocida and comparison with isolates of avian, ovine and porcine 3 origin. Veterinary Microbiology, 99: 145-158.
• Jabbari, A.R., Saharee, A. and Esmaily, F. (2002). Characterization of avian Pasteurella multocida isolates by protein profiles and Restrection endonuelase analysis chromosomal DNA. Archive of Razi Institute, 15(1): 143-159.
• Quinn, P.J., Markey, B.K., Carter, M.E., Donnelly, W.J. and Leonard, F.C. (2003). Veterinary Microbiology and Microbial Disease. U.K., London: Blackwell Publishing.
• Rudolph, K.M., Hunter D.L., Forey W.J., Cassirer E.F., Rimler R.B. and Ward A.C.S. (2003). Sharing of Pasteurella spp. Between Free-ranging Bighorn Sheep and Feral Goats. Journal of Wildlife Diseases, 39(4): 897-903.
• Shayegh, J., Atashpaz, S., Zahraei Salehi, T. and Hejazi, M.S. (2010a). Potential of Pasteurella multocida Isolated from Healthy and Diseased Cattle and Buffaloes in Induction of Diseases. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 54: 299-304.
• Shayegh, J., Parvizi, M. and Hejazi, M.S. (2010b). Diversity of Caprine and Ovine Pasteurella multocida Isolates Based on 16s rRNA Gene Sequencing. Iranian Journal of Veterinary Research, 11(4): 373-377.
• Shayegh, J., Mikaili, P., Dolgari Sharaf, J., Kamani, J. and Beheshti, R. (2011). Restriction endonuclease analysis: isolation and identification of ovine and caprine Pasteurella multocida. Research Opinions in Animal and Veterinary Sciences, 1(9): 611-613.
• Weiser, G.C., DeLong, W.J., Paz, J.L., Shafii, B., Price, W.J. and Ward, A.C. (2003). Characterization of Pasteurella multocida associated with pneumonia in bighorn sheep. Journal of Wild Animal Disease, 39: 536-544.