بررسی آلودگی توکسوپلاسما گوندای در شتران استان یزد با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 4، دوره 8، 1 (29) بهار، خرداد 1393، صفحه 383-389   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

علیرضا سازمند^{* 1}؛ موسی توسلی²؛ بیژن اسمعیل نژاد³؛ زهرا اسداللهی⁴؛ علی کاظم نیا⁵؛ سیدحسین حکمتی مقدم⁶

¹مربی، گروه کشاورزی، دانشگاه پیام نور یزد، یزد، ایران.

²استاد، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی ارومیه، ارومیه، ایران.

³استادیار، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی ارومیه، ارومیه، ایران.

⁴دانشجوی دکتری، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران.

⁵تکنسین آزمایشگاه، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی ارومیه، ارومیه، ایران.

⁶استادیار، گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران.

چکیده

   تک­یاخته توکسوپلاسما گوندای یکی از مهمترین عوامل بیماری­های مشترک بین انسان و حیوانات است. لذا در مطالعه­ی­­ مقدماتی حاضر به منظور بررسی آلودگی به این انگل، 50 شتر یک کوهانه­ی نر و ماده در سنین مختلف که توسط دامداران منطقه یزد نگه­داری می­شدند مورد آزمایش قرار گرفتند. همه­ نمونه­های خونی با روش واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) با استفاده از ژن­1Bبررسی شدند. نتایج نشان داد که در هیچ یک از شتران بررسی شده توسط روشPCR آلودگی خونی با توکسوپلاسما گوندای وجود نداشت. مطالعه­­ آزمایشگاهی حاضر اولین تلاش در بررسی آلودگی شترهای ایران به توکسوپلاسما گوندای به روش PCRمی­باشد. انجام تحقیقات بیشتر در دیگر نواحی کشور در فهم اهمیت بیماری لازم به نظر می­رسد. همچنین آلودگی تجربی شترها جهت بررسی سیر بیماری پیشنهاد می­شود. 

کلیدواژه‌ها

توکسوپلاسما گوندای؛ شتر؛ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز؛ ایران

اصل مقاله

مقدمه

   توکسوپلاسما گوندای یک تک­یاخته­­ی تشکیل‌دهندهی­­ کیست از شاخه­ آپی کمپلکسا (Apicomplexa) است که بسیاری از حیوانات خون­گرم را در اکثر مناطق جهان آلوده می­کند. میزبان اصلی این انگل گربه سانان هستند، ولی با تشکیل کیست در بافت‌های میزبان­های واسط از جمله نشخوارکنندگان باعث زیان­های اقتصادی از جمله مرگ زودهنگام جنین، سقط جنین، زایمان زودرس و مرگ نوزادان مبتلا می­شود. انگل ممکن است از طریق بلع اووسیست همراه با آب و غذای آلوده به میزبان­های واسط انتقال یابد. انتقال عمودی از مادر به جنین از طریق جفت نیز روش دیگر آلودگی می­باشد (Tenter et al., 2000). توکسوپلاسموزیس به عنوان یک بیماری زئونوز با انتشار جهانی، اثر جدی روی جنین متولد نشده و اشخاص دارای ضعف سیستم ایمنی دارد. آلودگی به توکسوپلاسما گوندای معمولاً در انسان و حیوانات سالم بدون علائم بالینی می‌باشد، اما گاهی اوقات باعث مسمومیت جنین می­شود. آلودگی زنان باردار می­تواند باعث بیماری­های شدید و کشنده­ای در جنین و نوزاد شامل سقط، آنسفالیت، عقب­ماندگی ذهنی و کوری شود (Cook et al., 2000). آنتی­بادی علیه این انگل در سرم انسان و حیوانات در ایران به طور گسترده­ای شایع (Ghorbani et al., 1978; Hashemi-Fesharaki, 1996; Zia-Ali, et al., 2007) و فراوانی آن در گروه­های مختلف انسانی بین 22 تا 6/74 درصد گزارش شده است (Mostafavi et al., 2011).

   اگرچه شترهای یک­کوهانه (Camelus dromedarius) حیوانات چند منظورهی­ مهمی در بخش­های خشک و نیمه خشک دنیا هستند، اما مطالعات کمی روی توکسوپلاسموزیس در این حیوانات انجام شده است. در اکثر مقالات منتشره از تحقیقات توکسوپلاسما در شتر، آزمایش حضور آنتی­بادی علیه این انگل در حیوانات به ظاهر سالم انجام شده است (Hussein et al., 1988; Hilali et al., 1998; Sadrebazzaz et al., 2006; Hamidinejat et al., 2013). در تنها مطالعه­­ انجام شده روی بیولوژی توکسوپلاسما گوندای در شتر، هیلالی و همکاران کیست­های زنده­ی انگل را از بافت­های 38 شتر به ظاهر سالم استخراج کرده و به چهار گربه خوراندند که گربه‌ها اووسیست­های توکسوپلاسما گوندای را در مدفوعشان دفع کردند (Hilali et al., 1995). اگرچه توکسوپلاسموزیس در شتر غالباً بدون نشانه­های بالینی مشخص است، در تنها گزارش بروز توکسوپلاسموزیس بالینی در شترها، یک نفر شتر یک کوهانه 6 ساله ماده با نشانه­های بی­اشتهایی و سقط جنین به بیمارستان آموزشی دامپزشکی ایالت آیووا آمریکا انتقال داده شد که در آزمایشات انگل­شناسی تاکی­زوآیت­های زیادی در شش­ها و ترشحات اکسودایی محوطه جنبی حیوان یافت شد (Hagemoser et al., 1990). طبق آمار وزارت جهاد کشاورزی، حدود 153000 شتر در ایران وجود دارد که 21690 نفر از آنها در استان یزد حضور دارند (Ministry of Agriculture of I.R. Iran, 2010). در این منطقه شترها به منظور تولید گوشت نگه­داری می‌شوند. طبق اطلاعات ما تاکنون گزارشی مبنی بر تشخیص آلودگی شترها به توکسوپلاسما گوندای با روش­های آزمایشگاهی مولکولی وجود ندارد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز برای تشخیص این انگل در نمونه­ها­­ی خون، مایع مغزی-نخاعی و سایر بافت­های بیماران آلوده به کار می­رود (Howe and Sibeley, 1995). بر همین اساس، هدف از مطالعه‌ی حاضر تشخیص توکسوپلاسما گوندای در خون حیوانات به روش PCR و تفکیک سویه­های این انگل به روش RFLP بود.

 

مواد و روش­ها

   در مطالعهی مقدماتی حاضر، از دی ماه 1389 تا فروردین ماه 1390 پنجاه نمونه خون از شترهای نر و مادهی­ 6 ماهه تا 30 ساله جمع آوری شد.

نمونه­ها از دامداری­های حومه و کشتارگاه­های استان یزد به صورت تصادفی جمع آوری شدند. حیوانات در زمان نمونه­گیری هیچ علامت بالینی واضحی از بیماری نداشتند. نمونه­های خونی گرفته شده تا زمان آزمایش در 20- درجه سلسیوس نگه­داری شدند.

   استخراج DNA از نمونه­های خون با روش ارائه شده توسط فوئنتس و همکاران و با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت Fermentas آلمان انجام شد (Fuentes et al., 1996). بدین صورت که 100 میکرولیتر از نمونه خون با 100 میکرولیترمحلول کافت­گر حاویmM Tris-HCl 10، mM MgCl₂ 5/1، mM KCl 50، 1/0 میلی گرم ژلاتین به­ازای هر میلی­لیتر، Tween 20 5/0 درصد و 20 میکروگرم پرتئیناز K مخلوط و به مدت 90 دقیقه در دمای 55 درجه سلسیوس قرار گرفت. سپس برای غیرفعال کردن پرتئیناز K نمونه­ها در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه با دور ×g 12000 سانتریفیوژ شده و مایع رویی به عنوان DNA استفاده گردید. PCR روی حجم 50 میکرولیتر شامل 5 میکرولیتر از بافر PCR x 10حاویmM Tris-HCl 70 (8/8 pH)،(NH₄)SO₄  mM200، Tween 20 1/0 درصد به علاوه­ mM MgCl₂ 2، µM 250 از هر دی­نوکلئوتید تری فسفات، 25/1 واحد بین­المللی DNA Taq polymerase (Fermentas، آلمان)،pM  50 از هر پرایمر 4  ToX (´5- CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG -´3) و 5 Tox (´5- CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT -´3) برای تکثیر قطعه­ 529 جفت بازی از ژن ­1B  توکسوپلاسما گوندای و µL 5 الگوی DNA استخراج شده انجام شد (Homan et al., 2000). تکثیر DNA انگل در ترموسایکلر CP2-003 (Corbett Research، استرالیا) انجام شد. پلیمریزاسیون DNA طی 35 سیکل به این قرار تکمیل شد: دناتوره شدن (denaturation) اولیهی­ نمونه­ها در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت 7 دقیقه و دناتوره شدن سیکل­ها در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، انیلینگ (annealing) اولیه در دمای 55 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، اکستنشن (extension) در 72 درجه به مدت 1 دقیقه و اکستنشن (extension) نهایی در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه انجام شد. DNA کنترل مثبت برای توکسوپلاسما گوندای از انستیتو پاستور تهیه شد. از آب مقطر هم به عنوان کنترل منفی استفاده شد. محصولات PCR با ژل آگاروز 2 درصد الکتروفورز و طبق دستور شرکت سازنده تحت تأثیر آنزیم محدود کننده­ی AluI مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند.

 

یافته­ها

   در پژوهش حاضر، محصولات واکنش زنجیره­ای پلیمراز نشان­گر عدم حضور زوآیت­های توکسوپلاسما گوندای در 50 نمونه­­ خون محیطی شترهای یک کوهانه استان یزد بود. شکل 1 نتایج مربوطه را نمایش می­دهد.

 

 

  

 

 

 

 

 

شکل 1- محصول PCR ( bp529) از ژن ­1B تکثیر یافته­ی آلوده به توکسوپلاسما گوندای: ستون M: مارکر 50 جفت باز، ستون PC: کنترل مثبت، ستون­های 1 تا 8: تعدادی از نمونه­های آزمایش شده.

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

   برخلاف دام­های مرزعه مانند گاو، گوسفند و بز، توکسوپلاسموزیس در شترها به طور گسترده­ای مورد بررسی قرار نگرفته است و دانش انگل­شناسان اغلب مبتنی با یافته­های آزمایشات سرم شناسی است که برای سنجش توکسوپلاسموزیس استاندارد هستند. گروه­های تحقیقاتی متعددی در مناطقی از دنیا که شتر پرورش می­یابد، فراونی متفاوتی از شیوع توکسوپلاسموزیس را گزارش کرده­اند. در ایران صدر بزاز و همکاران با آزمایش فلورسنت غیرمستقیم آنتی­بادی­های انگل را در 16/4 درصد شترهای مشهد (Sadrebazzaz et al., 2006) ، و حمیدی نجات و همکاران با روش آگلوتیناسیون اصلاح شده شیوع سرمی 75/14 درصد را در شترهای یزد (Hamidinejat et al., 2013) گزارش کردند. در شترهای مصر و عربستان سعودی هم به ترتیب 4/17 درصد و 16 درصد شیوع سرمی گزارش شده است (Hussein et al., 1988; Hilali et al., 1998).

   واکنش زنجیره­ای پلیمراز که در آن قسمتی از ژنوم DNA توکسوپلاسما گوندای قابل ردیابی است، به دلیل حساسیت و ویژگی کافی، بر دیگر روش­های تشخیصی ارجحیت دارد. دستیابی سریع به نتایج از دیگر مزایای این روش است (James et al., 1996). اگرچه در مورد توکسوپلاسما گوندای از روش PCR اغلب برای ردیابی انگل در بافت استفاده می­شود­، با این حال، خون در دسترس­ترین نمونه­ مورد نیاز برای انجام PCR به منظور تشخیص در موارد انسانی و دامی می باشد (OIE, 2008). حضور و مقاومت توکسوپلاسما گوندای در خون به سویه و نحوهی­ آلوده شدن میزبان بستگی ارتباط دارد. آلودگی میزبان از طریق تاکی­زوآیت، برادی­زوآیت و اسپوروزوآیت اثر قابل توجهی بر زمان حضور انگل در خون و مقاومت آن دارد. حضور انگل در خون در فاز حاد رخ می­دهد و عامل آن تاکی­زوآیت می­باشد (Tavassoli et al., 2013). در مطالعات بر پایه­ی PCR برای ردیابی توکسوپلاسما گوندای، مهمترین مناطق هدف ژن‌های ­1B، 30P (1SAG) و DNA ribosomal S 18هستند. ژن ­1B و DNA ریبوزومال برای پلیمریزه شدن در PCR مناسب هستند زیرا، کپی­های آن­ها در ژنوم توکسوپلاسما وجود دارد به نحوی که ژن ­1B در ژنوم توکسوپلاسما گوندای 35 بار تکرار شده است (OIE, 2008; Jones et al., 2000). کاربرد ژن ­1B مزایای دیگری نیز دارد. از جمله این­که، پرایمر ­1B در گونه‌های قارچی یا باکتریایی پلیمریزه نمی­شود در حالی­که، پرایمرهای ژن 30P کمتر از ژن ­1B اختصاصی هستند. کاربرد ژن ­1B فقط به دلیل ویژگی بالای آن در پلیمریزه کردن توکسوپلاسما گوندای نیست بلکه به دلیل حساسیت بالای آن در تشخیص انگل نیز می­باشد (Jones et al., 2000). با استفاده از همین ژن توسلی و همکاران در سال 1388 نرخ آلودگی پایینی از توکسوپلاسما گوندای در دام­های اهلی ارومیه گزارش نمودند ولی یک سویه از آن را جدا کردند (توسلی و همکاران، 1388). در مطالعه دیگری توسط توسلی و همکاران روی 133 گوسفند و 124 بز از شمال غرب ایران، سه گوسفند مثبت با یک الگوی RFLP یافتند (Tavassoli et al., 2013). در بررسی حاضر ما موفق به شناسایی موردی آلوده به انگل نشدیم که می­تواند به دلیل عدم حضور زوآیت­ها در خون حیوانات مورد بررسی یا مقاومت شتر به این انگل باشد. به عقیده­ ما می­توان با آلودگی تجربی شتر با توکسوپلاسما گوندای به این پرسش­ها پاسخ داد. بنابر این، پایه­ریزی یک مطالعه جهت بررسی سیر بیماری در این حیوان پیشنهاد می­شود.

   در پایان، همان‌گونه که اهمیت توکسوپلاسموزیس در پیشینهی تحقیق ذکر شده است، توکسوپلاسما گوندای باعث حدود 21 درصد از کل مرگ و میرهای ناشی از پاتوژن­های غذایی در ایالات متحده آمریکا می­باشد و مرکز کنترل بیماریها (CDC) تخمین زده­ است که 50 درصد از کل افراد از طریق مواد غذایی در معرض آلودگی به توکسوپلاسما قرار می­گیرند (Mead, et al., 1999). در اروپا نیز بیش از 63 درصد آلودگی‌های توکسوپلاسمایی انسان به مصرف محصولات گوشتی خام یا کم پخته مرتبط می­باشد (Cook et al., 2000). بنابراین، اگرچه نتایج ما تخمینی از درصد آلودگی شتران را فراهم نکرد اما از آن­جا که مصرف گوشت شتر و تماس افراد شاغل در کشتارگاه‌ها و مراکز تهیه و توزیع گوشت با خون حیوان ممکن است از منابع آلودگی برای انسان باشند (Hilali et al., 1995)، بنابراین علاوه بر رعایت نکات بهداشت شغلی، گوشت و دیگر بخش­های قابل مصرف دام باید به طور کامل قبل از مصرف پخته شود. 

مراجع

• توسلی، م.، طباطبایی، م.، جوادی، ش.، کاظم نیا، ع. و مردانی، ک. (1388). بررسی آلودگی به توکسوپلاسما گوندئی در حیوانات مختلف در شهرستان ارومیه به روش PCR و بررسی اختلاف ژنتیکی از طریق RFLP. نشریه دامپزشکی (پژوهش و سازندگی)، شماره 85، صفحات: 66-61.
  • Cook, A.J., Gilbert, R.E., Buffolano, W., Zufferey, J., Petersen, E., Jenum, P.A., et al. (2000). Sources of Toxoplasma infection in pregnant women: European multicentre case–control study. European Research Network on Congenital Toxoplasmosis, British Medical Journal, 321(7254): 142-147.
  • Fuentes, I., Rodriguez, M., Domingo, C.J., del Castillo, F., Juncosa, T., and Alvar, J. (1996). Urine sample used for congenital toxoplasmosis diagnosis by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 34(10): 2368-2371.
  • Ghorbani, M., Edrissian, G.H. and Assad, N. (1978). Serological survey of toxoplasmosis in northern part of Iran, using indirect fluorescent antibody technique. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 72(4): 369-371.
  • James, G.S., Sintchenko, V.G., Dickeson, D.J., and Gilbert, G.L. (1996). Comparison of cell culture, mouse inoculation, and PCR for detection of Toxoplasma gondii: effects of storage conditions on sensitivity. Journal of Clinical Microbiology, 34(6): 1572-1575.
  • Hagemoser, W.A., Dubey, J.P. and Thompson, J.R. (1990). Acute toxoplasmosis in a camel. Journal of the American Veterinary Medical Association, 196(2): 347.
  • Hamidinejat, H., Ghorbanpour, M., Rasooli, A., Nouri, M., Hekmatimoghaddam, S., Namavari, M., et al. (2013). Occurrence of Anti – Toxoplasma gondii and Neospora caninum antibodies in camels (Camelus dromedaries) in center of Iran. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 37(3): 277-281.
  • Hashemi-Fesharki, R. (1996). Seroprevalence of Toxoplasma gondii in cattle, sheep and goats in Iran. Veterinary Parasitology, 61(1-2): 1-3.
  • Hilali, M., Fatani, A. and Al-Atiya, S. (1995). Isolation of tissue cysts of Toxoplasma, Isospora, Hammondia and Sarcocystis from camel (Camelus dromedarius) meat in Saudi Arabia. Veterinary Parasitology, 58(4): 353-356.
  • Hilali, M., Romand, S., Thulliez, P., Kwok, O.C. and Dubey, J.P. (1998). Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii antibodies in sera from camels from Egypt. Veterinary Parasitology, 75(2-3): 269-271.
  • Homan, W.L., Vercammen, M., De Braekeleer, J. and Verschueren, H. (2000). Identification of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment in Toxoplasma gondii, and its use for diagnostic and quantitative PCR. International Journal for Parasitology, 30(1): 69-75.
  • Howe D.K. and Sibeley L.D. (1995). Toxoplasma gondii comprise three clonal lineages: correlation of parasite genotype with human disease. The Journal of Infectious Diseases, 172(6): 1561-1566.
  • Hussein, M.F., Bakkar, M.N., Basmaeil, S.M. and Gar el Nabi, A.R. (1988). Prevalence of toxoplasmosis in Saudi Arabian camels (Camelus dromedaries). Veterinary Parasitology, 28(1-2): 175-178.
  • Jones, C.D., Okhravi, N., Adamson, P., Tasker, S. and Lightman, S. (2000). Comparison of PCR detection methods for B1, P30, and 18S rDNA genes of T. gondii in aqueous humor.  Investigative Ophthalmology and Visual Science, 41(3): 634-644.
  • Mead, P.S., Slutsker, L., Dietz, V., McCaig, L.F., Bresee, J.S., Shapiro, C., et al. (1999). Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases, 5(5): 607-625.
  • Ministry of Agriculture of I.R. Iran, Office of statistics and information technology (2010). Accessed on 20 December 2013, http://www.maj.ir
  • Mostafavi, S.N., Ataei, B., Nokhodian, Z., Yaran, M. and Babak, A. (2011). Seroepidemiology of Toxoplasma gondii infection in Isfahan province, central Iran: A population based study. Journal of Research in Medical Sciences, 16(4): 496-501.
  • OIE Terrestrial Manual (2008). Toxoplasmosis. Chapter 2.9.10., pp. 1284-1293.
  • Sadrebazzaz, A., Haddadzadeh, H. and Shayan, P. (2006). Seroprevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in camels (Camelus dromedarius) in Mashhad, Iran. Parasitology Research, 98: 600-601.
  • Tavassoli, M., Ghorbanzadehghan, M. and Esmaeilnejad, B. (2013). Detection of Toxoplasma gondii in sheep and goats blood samples by PCR-RFLP in Urmia. Veterinary Research Forum, 4(1): 43-47.
  • Tenter A.M., Heckerotha A.R. and Weiss L.M. (2000). Toxoplasma gondii: from animals to humans. International Journal for Parasitology, 30(12-13): 1217-1258.
  • Zia-Ali, N., Fazaeli, A., Khoramizadeh, M., Ajzenberg, D., Dardé, M. and Keshavarz-Valian, H. (2007). Isolation and molecular characterization of Toxoplasma gondii strains from different hosts in Iran. Parasitology Research, 101(1): 111-115.