بررسی تاثیر مقادیر مختلف عصاره الکلی بره‌موم زنبور عسل در ترمیم زخم پوستی و پاسخ ایمنی و بقاء ماهی کپور معمولی (Cyprinus carpio)

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 4، دوره 7، 4 (28) زمستان، اسفند 1392، صفحه 300-312   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

نسرین چوبکار^{* 1}؛ عباسعلی ساری²؛ علیرضا بلندنظر³؛ هاشم حشمتی⁴؛ فروغ محمدی⁵؛ نسترن شهبازیان⁶؛ امیرمحمد امامی راد⁷؛ پیام یاری⁸

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه شیلات، کرمانشاه، ایران.

²دانشگاه بوعلی سینا، گروه پیراپزشکی، همدان، ایران.

³موسسه تحقیقات باریج اسانس، کاشان، ایران.

⁴دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گروه بهداشت، گرگان، ایران.

⁵دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه دامپزشکی، کرمانشاه، ایران.

⁶اداره دامپزشکی، بخش بهداشت آبزیان، کرمانشاه، ایران.

⁷دانشگاه پیام نور، گروه مهندسی شیمی، تهران، ایران.

⁸کارشناسی ارشد شیلات، اهواز، ایران.

چکیده

   آنتی‌بیوتیک‌ها جهت تقویت سیستم ایمنی و نیز ترمیم زخم‌ها در آبزیان کاربرد زیادی دارند، اما به­دلیل تاثیرات سوء و ایجاد باقی­مانده دارویی، محققین به­دنبال جایگزینی این مواد با مواد طبیعی می‌باشند. یکی از این ترکیبات که خواص درمانی زیادی دارد بره­موم زنبور عسل است. هدف از این مطالعه ارزیابی تاثیر غلظت­های مختلف بره­موم بر ترمیم زخم پوستی و  پاسخ سیستم ایمنی در ماهی کپور معمولی می‌باشد. عصاره بره­موم از شرکت باریج اسانس کاشان تهیه گردید و غلظت‌های صفر، 2، 5 و10 درصد آن به همراه مواد حامل (مواد افزوده به بره­موم به­منظور انحلال در آب) بر روند ترمیم زخم پوستی ماهی کپور معمولی و پاسخ ایمنی و نیز بقاء آنها مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعه در یک دوره 21 روزه و به روش حمام کوتاه مدت و یک بار در روز انجام شد. در مقایسه با تیمار کنترل، استفاده از بره موم زنبور عسل در غلظت 2 درصد تاثیر معنی‌داری در روند ترمیم زخم پوستی و نیز تحریک سیستم ایمنی در ماهی کپور پرورشی داشت (05/0p<). در استفاده از غلظت‌های بالاتر بره موم، ترمیم زخم مشاهده شد اما افزایش در تعداد سلول‌های خونی (گلبول قرمز، نوتروفیل و ائوزینوفیل) و افزایش تلفات ماهی را نیز به­همراه داشت. استفاده از بره­موم زنبور عسل به شکل افزودنی در آب در غلظت‌های پایین موثر بوده و سبب تحریک سیستم ایمنی می‌گردد.

کلیدواژه‌ها

بره موم؛ ماهی کپور معمولی؛ ترمیم زخم پوستی؛ سیستم ایمنی؛ بقاء

اصل مقاله

مقدمه

   زخم در اثر آفتاب سوختگی، صدمات مکانیکی و بیماری‌های مختلف پوستی (به­خصوص در بچه ماهیان) ایجاد می‌گردد و معمولاً توام با عفونت‌های ثانویه میکروبی می‌باشد. زخم­های پوستی علاوه بر تاثیر سوء در بازار‌پسندی ماهی، در موارد شدید سبب مرگ و میر در ماهیان نیز می‌گردد (Ferguson and Leigh, 1998).

   یکی از اهداف علم پزشکی، ترمیم زخم در مدت زمان کوتاه­تر و با عوارض جانبی کمتر است. کوتاه کردن زمان بهبود زخم به دلیل کاهش احتمال عفونت و یا عوارض زخم و کاهش هزینه‌ها از اهمیت به‌سزایی برخوردار می‌باشد (Sabistan, 1991).

   کاربرد گسترده ترکیبات طبیعی و گیاهی در درمان طیف زیادی از بیماری­های  انسان موجب شد تا امکان استفاده از این ترکیبات در درمان بیماری‌های سایر موجودات زنده مورد بررسی قرار گیرد. این ترکیبات ارزان و فاقد عوارض جانبی برای موجود زنده و انسان می‌باشند. لذا استفاده از آنها از نظر زیست محیطی نیز از اهمیت به­سزایی برخوردار است (کاظم پور و همکاران، 1384).

   استفاده از داروهای شیمیایی مانند آنتی­بیوتیک‌ها، همواره مشکلاتی را نظیر ظهور گونه‌های میکروبی مقاوم در برابر آنتی بیوتیک­ها، ایجاد باقی­مانده دارویی در محصولات و تاثیر سوء بر مصرف‌کنندگان در برداشته است.

   در حال‌ حاضر به­دلیل‌ جوان‌ بودن‌ صنعت ‌آبزی‌پروری‌ و کمبود نیروی‌ متخصص‌ در زمینه‌ بهداشت‌ و بیماری‌های‌ آبزیان،‌ اکثر موارد کاربرد داروها و مواد شیمیائی‌ خارج‌ از سیستم‌ صحیح ‌تشخیص‌ و تجویز رسمی‌ صورت‌گرفته‌ و بدون‌ درنظر­گرفتن‌ باقی­مانده‌های‌ داروئی‌ و اثرات‌ آلایندگی‌ آنها در طبیعت‌ و همچنین‌ عوارض‌ سوء این‌ مواد روی‌ انسان‌ (سرطان­ها، ناقص‌الخلقه‌زائی‌ و ...) و سایر اجزاء اکوسیستم‌ آب‌ و خاک،‌ مصرف‌ می‌شوند (علیشاهی و همکاران، 1390).

   ترکیبات طبیعی دارویی‌ با وجود تأثیر کند اثر بسیار پایدارتری‌ در مقایسه‌ با سایر داروها دارند. این‌ مواد به‌ علت‌ دارا بودن‌ مواد مؤثره‌ مختلف، می‌توانند در درمان‌ بسیاری‌ از بیماری­ها کاربرد داشته‌ باشند، بدون‌ آنکه‌ مجموعه‌ مواد مؤثره‌ آنها با هم‌ تداخل‌ اثر داشته‌ باشند. همچنین‌ این‌ مواد مؤثره‌ همواره‌ از یک‌ حالت تعادل‌ بیولوژیک‌ برخوردارند و لذا‌ در بدن ‌انباشته‌ نشده‌ و اثرات‌ جانبی‌ بر جای نمی‌گذارند (توکلی و همکاران، 1389و شوهانی و همکاران، 1388).

   یکی از این مواد طبیعی، بره­موم زنبورعسل (propolis) است. بره­موم ماده‌ای است با خواص دارویی که امروزه در برخی کشورها از محلول الکلی آن، جهت درمان انواع بیماری­های انسانی و دامی استفاده می‌شود (اشراقی و والافر، 1382). این ماده در کشور ما به صورت ناشناخته باقی مانده و فقط مقدار اندکی از آن به خارج از کشور صادر می‌شود. بره‌­موم در درمان بیماری­های مختلفی مانند آرتریت و دردهای عضلانی، مشکلات تنفسی، بیماری­های پوستی، سوختگی­ها، زخم­ها، تبخال، سندرم خستگی مزمن، سرفه و سرماخوردگی، مشکلات دندانی، بیماری­های گوش، آلرژی، مشکلات زنانه، اختلالات گوارشی و التهاب کولون به‌کار رفته و در حفظ سلامت بدن و سیستم‌ ایمنی کاربرد داشته است (بصیری، 1387و سیدی، 1388).

   همچنین بر اساس مطالعات صورت‌گرفته عصارة‌ اتانولی بره­موم دارای ویژگی‌های متعددی از جمله خواص ضد‌باکتریایی، ضدقارچی، ضدالتهابی، ضدویروسی، محرک سیستم ایمنی و نیز بی‌حس‌کنندگی می‌باشد (Paintz and Metzne, 1979، مهدیزاده و همکاران، 1383).

   در این تحقیق تاثیر غلظت‌های مختلف بره­موم (تهیه شده از شرکت دارویی باریج اسانس کاشان) صفر (شاهد)، 2، 5 و 10درصد و نیز مواد حامل، بر روند ترمیم زخم پوستی، پاسخ ایمنی و بقاء در بچه­ماهی کپور معمولی مورد بررسی قرار گرفت.

   کپور معمولی (Cyprinus carpio) به علت ویژگی‌های منحصر به فرد در بیشتر  کشورهای دنیا پرورش داده می‌شود و در ایران نیز یکی از گونه‌های با اهمیت و پرطرفدار ماهیان گرمابی به شمار می‌آید.

   هدف از این مطالعه بررسی تاثیر بره­موم بر روند بهبود زخم و پاسخ سیستم ایمنی (با توجه به تعداد گلبول­های‌سفید و قرمز و شمارش افتراقی آنها) در ماهی کپور معمولی می‌باشد.

 

مواد و روش­ها

تهیه اسانس بره موم زنبور عسل

   برای استفاده بهتر از خواص بره‌موم، به عصاره‌گیری آن نیاز است. محلول دارای 70 درصد الکل (اتانول)، فعال‌ترین محلول برای عصاره‌گیری بره‌موم است هرچند که عصاره‌گیری با پروپیلن‌گلیکول و آب نیز انجام می شود (بصیری، 1387؛ سیدی، 1388). ظرف پلاستیکی برای توزیع بره موم به­دلیل عدم‌واکنش انتخاب گردید. ترکیبات مواد حامل بره­موم از شرکت باریج اسانس کاشان مشتمل برPEG400 ، کرودرت، آب، پروپیلن گلوکز و اتانول می‌باشد.

طرح آزمایش

   روزانه 1 میلی‌لیتر از محلول‌های مختلف در غلظت‌های مورد بررسی صفر، 2، 5 و 10 درصد در 5 تیمار و 3 تکرار استفاده گردید. یک تیمار تحت عنوان مواد حامل (مواد افزوده به بره موم به‌منظور انحلال در آب) نیز در نظر گرفته شد.

آماده‌سازی تانک آزمایش

   ابتدا تانک‌هایی با ظرفیت 35 لیتر آب انتخاب و در آن از آب لوله‌کشی شهر که 48 ساعت پس از آبگیری به­منظور ته‌نشینی کلر صورت گرفته است استفاده گردید. از فیلتر اسفنجی (MA-F009) شرکت ماهیران مجهز به ورودی و خروجی هوا، لوله خروجی هوا و آب، مخزن پخش هوا و سرپوش کارتریج اسفنج و بخاری (MH-71R) شرکت ماهیران و پمپ فیلتر اسفنجیsmart pump-SB-1350  در هر آکواریوم استفاده گردید که از 48 ساعت پیش از انتقال ماهیان آماده سازی شدند.

   ماهیان مورد آزمایش از یک مزرعه ماهیان گرمابی در قصر شیرین در استان کرمانشاه خریداری شده و با استفاده از پمپ‌های هوادهی انتقال داده شد. مکان آزمایش، آزمایشگاه شیلات دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه (1392) در نظر گرفته شد. پس از هم‌دماسازی آب تانک‌ها با آب کیسه‌های حامل ماهی از کارگاه، انتقال ماهیان به این تانک‌ها صورت گرفت. 24 ساعت اولیه بدلیل استرس ناشی از جابجایی غذادهی صورت نگرفت. 

   48 ساعت پس از انتقال ماهی و رفع استرس، کار طرح شروع گردید. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 5 تیمار و 3 تکرار، هر تیمار شامل 25 قطعه ماهی کپور 8 ± 15 گرمی با غلظت‌های درمانی صفر، 2، 5 و10 درصد و مواد حامل (موادی که توسط شرکت باریج اسانس کاشان برای انحلال این ترکیب روغنی به آب اضافه گردیده است) به­صورت محلول انجام گردید. روزانه 2 بار غذادهی با غذای کنسانتره (لوفاک فرانسوی با ترکیب غذایی 41 درصد پروتئین، 5/6 درصد چربی، 5 درصد فیبر و 12 درصد رطوبت) در ماهیان انجام شد.

   اطلاعات آب مورد استفاده مشتمل بر درجه حرارت 26درجه سلسیوس، اکسیژن10ppm  ، pH 7 تا 5/7 بود. طول دوره 21 روز در نظر گرفته شد.

   تلفات و ویژگی‌های رفتاری و شکلی نیز در ماهیان در هر روز ثبت گردید.

ایجاد زخم در ماهیان و چگونگی انجام طرح

   ماهیان هر تانک با پودر گل میخک به میزان 3 گرم در 10 لیتر آب، بیهوش شدند.

   محل زخم در زیر باله پشتی ماهیان بر پهلوی بالایی (سمت چپ بدن) انتخاب گردید. طول زخم 1 ± 67/7 و عرض1± 4/3 میلی­متر مربع در نظر گرفته شد. از بلند کردن فلس و لایه زیرین آن توسط تیغ اسکالپل استریل استفاده شد و سپس با سرم فیزیولوژی سدیم کلراید 9/0 درصد استریل (شرکت ثامن ایران- مشهد) شستشو و به همان تانک انتقال داده شده تا به هوش بیایند. 24 ساعت پس از ایجاد زخم از حمام کوتاه مدت بره موم در غلظت­های صفر، 2، 5 و 10 درصد و نیز مواد حامل استفاده گردید و سپس با ساچوک در نظر گرفته شده برای هر تانک ماهی به تانک مربوطه انتقال داده شد. این کار روزانه در ساعت معینی در روز انجام گردید. در طول انجام طرح، سطح زخم (طول زخم × عرض زخم) در روزهای 0، 8، 13، 17 و 22 با کولیس دیجیتالی اندازه‌گیری شد و سپس جهت بررسی دقیق‌تر روند ترمیم نسبی زخم‌ها از آزمایشات هیستو‌پاتولوژیک و تهیه مقاطع بافتی از نمونه‌ها و آزمایش خون استفاده گردید.درصد ترمیم زخم نیز با استفاده از رابطه زیر محاسبه گردید:

 

 

درصد بهبودی زخم=	سطح زخم در روز اول- سطح زخم در روز مورد نظر	(توکلی و همکاران، 1389)
	100× سطح زخم در روز اول

 

 

خونگیری  

   جهت خونگیری هر ماهی به­صورت جداگانه ­گرفته شد. پس از بیهوش نمودن با استفاده از اسانس گل میخک بلافاصله بدن ماهی را خشک کرده و سپس با استفاده از یک سرنگ استریل اقدام به خونگیری از انتهای ورید ساقه دمی به میزان 5/0 میلی­لیتر (500 میکرولیتر) گردید. هپارین 5000 واحد در میلی­لیتر از شرکت داروسازی کاسپین به‌منظور جلوگیری از انعقاد خون استفاده گردید. خونگیری از ماهی در روزهای صفر، 10 و 20 انجام شد (لازم به ذکر است تیمارهای با تلفات زیاد از مطالعه خارج شدند).

   در هر مرحله از 4 ماهی در هر تانک در میکروتیوب هپارینه شده، نمونه خونی تهیه شد. نمونه موردنظر در کنار یخ خشک سریعاً به آزمایشگاه برای مطالعات خونی انتقال داده شد و در آنجا به روش رنگ‌آمیزی و لام نئوبار اقدام به شمارش آنها گردید.

بررسی بافتی 

   در روزهای صفر و10، سه نمونه از هر تیمار به صورت تصادفی انتخاب شد و نمونه بافتی به شکل مربع از تمام ضخامت محل ترمیم زخم به همراه پوست سالم اطراف زخم با استفاده از قیچی و اسکالپل گرفته شد (بنایی و همکاران، 1390) و به­منظور جلوگیری از اتولیز بافتی در فرمالین 10 درصد قرار گرفت.

   همچنین به منظور مطالعات بافت شناسی، با استفاده از دستگاه میکروتوم از نمونه ها مقاطع بافتی به قطر 6 میکرومتر تهیه گردید و رنگ آمیزی نمونه ها با استفاده از هماتوکسیلین – ائوزین انجام گرفت.

 

بررسی میزان بقا در تیمارهای مختلف

 

درصد بقا (SP)=	تعداد ماهیان موجود × 100
	تعداد ماهیان اولیه

 

روش آماری

به منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم افزار آماری Spss17 استفاده شد. ابتدا از تجزیه واریانس یک­طرفه (ANOVA) جهت مقایسه میانگین‌ها استفاده شد و در مواردی که بین میانگین ها اختلاف معنی داری وجود داشت از آزمون Tukey جهت جدا کردن آنها استفاده گردید. نتایج در سطح اطمینان  95 درصد (05/0p<) از لحاظ آماری متفاوت قلمداد گردید.

 

یافته‌ها

مطالعه سطح زخم  

   سطح زخم در روزهای مورد نظر با کولیس دیجیتالی ثبت گردید (جدول1).

 

جدول 1- متوسط سطح زخم بر حسب سانتی‌متر مربع  در تیمارهای مورد نظر بره­موم در روزهای مختلف نمونه­برداری

روز22	روز17	روز13	روز8	روز0
a06/0	a10/0	a13/0	a21/0	26/0	شاهد
*	a10/0	a13/0	a21/0	26/0	حامل
b01/0	b04/0	b09/0	b15/0	26/0	2 درصد
*	*	c06/0	c11/0	26/0	5 درصد
*	*	c05/0	d08/0	26/0	10 درصد

                     حروف مختلف در هر ستون، معنی­دار بودن اختلاف را از نظر آماری نشان می­دهد (05/0p<).

                     * به دلیل تلفات زیاد، از مطالعه حذف شدند.

 

  

 

لازم به ذکر است در تیمار 10 درصد بره­موم به میزان زیاد و به نسبت کمتر در تیمار 5 درصد پس از حمام دادن در برخی نمونه‌ها خونریزی پوستی و در تیمار 10 درصد، حرکات شدید به دور خود مشاهده گردید که در برخی روزها تلفات هم مشاهده شد.

مقایسه میانگین سطح زخم در روز 8

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که در روز 8 میانگین سطح زخم در پنج گروه شاهد، حامل، 2، 5 و 10 درصد از نظر آماری اختلاف معنی‌داری دارد (05/0p<).

   همچنین در آزمون تعقیبی Tukey نشان داده شد که میانگین سطح زخم فقط در گروه شاهد با گروه حامل اختلاف معنی‌داری ندارد (05/0<p).

مقایسه میانگین سطح زخم در روز 13

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که در روز 13 میانگین سطح زخم در 5 گروه شاهد، حامل، 2، 5 و 10درصد از نظر آماری اختلاف معنی‌داری دارد (05/0p<).

   همچنین در آزمون Tukey نشان داده شد که میانگین سطح زخم نیز فقط در گروه شاهد با گروه حامل اختلاف معنی‌داری ندارد (05/0<p).

مقایسه میانگین سطح زخم در روز 17

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که در روز 17 میانگین سطح زخم در 3 گروه شاهد، حامل و 2 درصد از نظر آماری اختلاف معنی‌داری دارد (05/0p<).

همچنین در آزمون Tukey نشان داده شد که میانگین سطح زخم در گروه شاهد با گروه حامل اختلاف معنی‌داری ندارد (05/0<p).

مقایسه میانگین سطح زخم  بین دو گروه شاهد و 2 درصد در روز 22

   آزمون T مستقل نشان داد که در دو گروه شاهد و 2 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‌داری وجود دارد (05/0p<). نتایج مربوط به مطالعه خونی (جداول 2 تا 4).

 

 

جدول 2- شمارش تفریقی گلبول‌های خونی در ماهی کپور معمولی در روز 10 در غلظت‌های مختلف بره­موم

گلبول سفید (103 ×)	گلبول قرمز (106 ×)	بازوفیل	ائوزوفیل	مونوسیت	لمفوسیت	هتروفیل	فاکتور    خونی تیمار
a8/0+23/24	a0.23+35/3	a0+1	a15/1+3	a5/1+ 75/4	62a/2+75/70	a81/0±21	شاهد
a28/0+9/21	b0.07+25/4	a0+1	a0+2	a7/0+5/3	a12/2+5/73	a41/1±20	حامل
a19/3+53/25	a0.27+57/3	a0+1	b57/0+5/1	a5/0+25/4	c65/4+5/73	c30/3±25/20	2
a82/2+60/27	b0.21+35/4	a0+1	b0+1	a0+4	c7/0+5/75	c7/0±5/19	5
a41/1+2/28	b0.07+65/4	a0+2	c0+4	a7/0+5/4	b0+60	b7/0±5/29	10

 

جدول3 -شمارش افتراقی گلبول‌های خونی در ماهی کپور معمولی در روز 1 در تیمار شاهد (با ایجاد زخم) و مخزن (بدون زخم)

گلبول سفید (103 ×)	گلبول قرمز (106 ×)	بازوفیل	ائوزوفیل	مونوسیت	لمفوسیت	هتروفیل	فاکتور خونی
							تیمار
05/2+13/23	08/0+21/3	0+1	75/0+25/2	5/0+25/3	95/0+75/70	2/1+75/22	شاهد
65/5+7/26	07/0+95/2	0+1	0+1	70/7+5/1	7/0+5/68	7/0+5/28	مخزن

 

جدول4- شمارش افتراقی گلبول‌های خونی در ماهی کپور معمولی در روز 20 در غلظت‌های مختلف بره­موم (تیمارهای با تلفات پایین مورد بررسی قرار گرفته است)

گلبول سفید (103 ×)	گلبول قرمز (106 ×)	بازوفیل	ائوزوفیل	مونوسیت	لمفوسیت	هتروفیل	فاکتور خونی
							تیمار
8/1+67/26	2/0+05/4	5/0+25/1	5/0+75/2	29/1+5/3	1/3+5/69	21/2+25/23	2درصد

  حروف مختلف در هر ستون، معنی‌دار بودن اختلاف را از نظر آماری نشان می‌دهد (05/0p<).

مقایسه تعداد گلبول‌های قرمز خون در روز 10 (جدول2)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد گلبول‌های قرمز خون در 5 گروه شاهد، حامل، 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<).

آزمون تعقیبی Tukey نشان داد که میانگین تعداد گلبول‌های قرمز خون در گروه شاهد و گروه حامل تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<) و فقط گروه شاهد و گروه 2 درصد تفاوت معنی‌داری ندارد (05/0<p).

مقایسه تعداد سلول‌های هتروفیل در روز 10 (جدول2)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد سلول‌های هتروفیل در5 گروه شاهد، حامل، 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<).

   آزمون تعقیبی Tukey نشان داد که در میانگین تعداد سلول‌های هتروفیل در گروه شاهد و حامل با گروه 10 درصد تفاوت معنی داری وجود دارد (05/0p<). همچنین در گروه 5 درصد با 10 درصد تفاوت معنی‌داری وجود دارد (05/0p<).

مقایسه تعداد لمفوسیت‌ها در روز 10 (جدول2)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد لمفوسیت‌ها در 5 گروه شاهد، حامل، 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<).

   آزمون تعقیبی Tukey نشان داد که میانگین تعداد لمفوسیت‌ها در گروه شاهد و 10 درصد و نیز گروه حامل و 10 درصد تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<). همچنین در گروه 2 درصد با گروه 10 درصد و نیز در گروه 5 درصد و گروه 10 درصد تفاوت آماری معنی‌داری وجود دارد (05/0p<).

مقایسه تعداد سلول‌های مونوسیت در روز 10 (جدول2)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد مونوسیت‌ها در 5 گروه شاهد، حامل، 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‌داری ندارد (05/0<p).

مقایسه تعداد سلول‌های ائوزینوفیل در روز 10 (جدول2)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد ائوزینوفیل‌ها در 5 گروه شاهد، حامل، 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<).

   آزمون تعقیبی Tukey نشان داد که میانگین تعداد ائوزینوفیل‌هادر گروه 2 درصد و 10 درصدو نیز در گروه 5 درصد و 10 درصد تفاوت معنی‌داری دارد (05/0p<).

مقایسه تعداد گلبول‌های سفید خون در روز 10 (جدول2)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد گلبول‌های سفید در 5 گروه شاهد، حامل، 2 ، 5 و 10 درصد از نظر آماری تفاوت معنی‎داری ندارد (05/0<p).

مقایسه میانگین تعداد تلفات (جدول 5)

   آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه نشان داد که میانگین تعداد تلفات در 5 گروه شاهد، حامل، 2، 5 و 10 درصد از نظر آماری اختلاف معنی‌داری دارد (05/0p<).

   آزمون تعقیبی Tukey نشان داد که میانگین تعداد تلفات در گروه شاهد و حامل با گروه 10 درصد اختلاف معنی‌داری دارد (05/0p<).

 

 

 

 

جدول 5- تلفات ماهیان در روزهای مختلف نمونه‌برداری در تیمارهای مختلف (درصد)

روز	تیمار	شاهد	حامل	2	5	10
1		6/98	100	100	100	6/94
2		96	100	100	100	3/85
3		96	6/98	6/98	6/98	3/77
4		96	6/94	6/98	6/98	2/73
5		94/6	92	6/98	96	68
6		92	92	3/73	3/89	6/66
7		92	3/89	3/97	3/81	6/62
8		92	88	96	3/77	48
9		6/90	6/86	96	6/70	44
10		3/89	6/74	6/94	3/65	28
11		88	6/74	6/94	3/61	24
12		88	64	3/93	56	6/10
13		84	3/61	92	52
14		84	6/58	92	52
15		84	6/58	84	48
16		84	56	3/77	3/45
17		84		68	3/41
18		6/82		6/62
19		6/82		6/54
20		6/82		6/46

 

درصد بهبودی زخم

   درصد ترمیم زخم نیز با استفاده از رابطه موجود در روش کار محاسبه گردیده و نتایج در نمودار1 ارائه گردیده است. در روزهای پایانی فقط در گروه شاهد و 2درصد میزان بقا محاسبه گردید و بقیه تیمارها بدلیل تلفات زیاد حذف شدند.

 

 

 

 

نمودار1- مقایسه درصد بهبودی زخم در تیمارهای مختلف بره­موم در ماهیان کپور در روزهای مختلف نمونه‌برداری

 

 

نتایج مطالعات بافتی

   در استفاده از غلظت‌های 2، 5 و10 درصد از بره موم روند التیام شکل گرفته که به ترتیب در غلظت 2 درصد بره موم، التیام خفیف‌تر و در غلظت 5 درصد، از التیام متوسط و در 10درصد از التیام بهتری برخوردار بوده و لایه‌های عضلانی زیرین در حال نوزایش می‌باشند.

در تیمار شاهد: روند التیام آغاز و بافت همبند در محل تشکیل شد. نکروز در عضلات و افزایش رگ­های خونی در محل مشاهده گردید.

در تیمار حامل: اپیدرم جدید شکل گرفته ولی از ضخامت کافی برخوردار نبوده و تعداد سلول‌های جامی شکل بافت پوششی پوست نیز اندک بود.

بحث و نتیجه‌گیری

   نتایج مشاهدات بافتی و خونی نشان داد که در مقایسه با تیمار کنترل، استفاده از بره­موم زنبور عسل در غلظت 2 درصد تاثیر معنی‌داری در روند ترمیم زخم پوستی و نیز تحریک سیستم ایمنی در ماهی کپور پرورشی دارد.

   تغییرات خصوصیات خون ماهیان در پاسخ به شرایط زیست محیطی، پاسخی است بر استرس‌های محیطی و می‌تواند به­عنوان یک شاخص مهم زیستی مد نظر قرار گیرد. اجزاء سلول­های خون شامل گلبول‌های قرمز (اریتروسیت‌ها) و گلبول‌های سفید (لوکوسیت‌ها) می‌باشد.

   دامنه طبیعی گلبول قرمز در این نوع ماهی 5/2 تا 5/3 میلیون و در مورد گلبول سفید 20 تا 32 هزار است که این دو پارامتر در ماهی مورد آزمایش در روز 1 عادی بوده اما در روز 10 نمونه‌برداری در تیمار 2، 5 و10 درصد تعداد گلبول‌های قرمز به­ویژه در تیمار 5 و10 درصد بیشتر از حد مجاز اما در گلبول سفید در حد مجاز مشاهده گردید. در روز20 مطالعه فقط تیمار 2 درصد از نظر تعداد گلبول‌ها در حد قابل قبولی بودند بطوری‌که تعداد گلبول‌های سفید در حد طبیعی اما تعداد گلبول‌های قرمز اندکی افزایش یافت.

   افزایش دما در ماهیان کپور سرگنده، کپور نقره‌ای، ماهی حوض و کپور معمولی موجب افزایش گلبول‌های قرمز می‌شوند. قندخون ماهی کپور معمولی با تغییرات اکسیژن و استرس، حرارت و همچنین افزایش شوری آب ارتباط معنی‌داری دارد (رحیمی بشر و همکاران، 1386). در این تحقیق نیز استفاده از بره­موم در غلظت‌های 10 و بمیزان کمتر 5 درصد سبب فعالیت شدیدتر ماهیان و احتمالاً افزایش دما در بدن آنها ‌گردید که افزایش در تعداد گلبول قرمز و کمی خونریزی پوستی هم مشاهده شد.

   تعداد لوکوسیت‌ها بعنوان شاخص سلامت در ماهی محسوب می­شود. بره­موم سبب افزایش نوتروفیل در ماهی قزل­آلای رنگین­کمان گردیده و نیز عصاره خارمریم در کپور معمولیبه­صورتخوراکی سبب افزایش تعداد گلبول سفید می‌گردد (علیشاهی و همکاران، 1390)اما در این تحقیقدر دامنه طبیعی گلبول سفید تاثیر معنی‌داریمشاهده نگردید.

   در ماهی سفید افزایش دما و کاهش اکسیژن سبب افزایش گلبول قرمز می‌گردد و استرس ناشی از تاثیر شوینده در ماهی حوض سبب افزایش گلبول قرمز می‌شود (شاهسونی و همکاران، 1382).

   در مطالعه بیرقدار (1387) تأثیر سطوح مختلف عصاره الکلی بره­موم در سطوح صفر (شاهد)، 5/0، 5/1، 5/4 و 9 گرم عصاره بره­موم بر پارامترهای رشد و ترکیب شیمیایی لاشه (رطوبت، پروتئین و چربی)، شاخص‌های سلامت (فاکتورهای خونی هموگلوبین و هماتوکریت) و پارامترهای بیوشیمیایی سرم و نیز سیستم ایمنی ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان، مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که استفاده از عصاره الکلی بره­موم در جیره بر عملکرد رشد و سلامت ماهیان مورد آزمایش تأثیر نداشت، اما استفاده از این ماده با تغییر نوتروفیل سبب تحریک سیستم ایمنی گردید (بیرقدار کشکولی، 1387). در تحقیق حاضر نیز تعداد نوتروفیل در تیمار 10 درصد به­طور معنی‌داری افزایش یافته است.

   میانگین سطح زخم، ابتدا در تیمار 10 درصد و سپس در تیمارهای 2 و 5 درصد بهتر بود اما در طول دوره علی­رغم بهبود زخم در تیمار 5 و 10 درصد در مقایسه با تیمار 2 درصد در بررسی کلیه پارامترهای مورد مطالعه، بهترین تیمار، غلظت2 درصد بره­موم بود.

   در تیمار 2 و 5 درصد تعداد لمفوسیت اختلاف معنی‌داری نداشت اما تعداد لمفوسیت‌ها در تیمار 10 درصد کاهش یافت. تعداد لمفوسیت در ارتباط با پاسخ‌های ایمنی میزبان می‌باشد.

   ائوزینوفیل در تیمار 10 درصد بیشتر از بقیه تیمارها افزایش یافت که می‌تواند واکنش به این ترکیب را نشان دهد زیرا، ائوزینوفیل در آلرژی‌ها و مشکلات پوستی و حتی استرس‌ها افزایش دارد (Sforcin, 2007).

   تلفات در مجموع در تیمار 10 درصد بیشتر بود که تا روز 12 فقط 6/10 درصد زنده ماندند و در تیمار 5 درصد تا روز 17، 3/41 درصد، در تیمار 2 درصد تا روز20، 6/46 درصد، در تیمار حامل تا روز 16، 56 درصد و در تیمار شاهد تا روز آخر دوره 6/82 درصد باقی­مانده بود (روزهای متفاوتی که ذکر گردید به­دلیل تلفات زیاد آخر دوره در تیمار مورد بررسی در نظر گرفته شده است).

   فیتوبیوتیک‌ها تیمار جدیدی از تولیدات طبیعی با تاثیرات مفید روی حیوانات و کیفیت تولیدات آنها هستند. در مرغ تخم­گذار تغذیه شده با اسانس پونه کوهی و بره­موم تفاوت معنی‌داری در طعم و بوی این تخم­مرغ‌ها با تیمار شاهد که معمولی و بدون افزودنی تغذیه شده بودند، ایجاد شد. همچنین کاهش بار باکتریایی کلی­فرم نیز ایجاد گردید و تغذیه با بره­موم سبب وزن سنگین­تر تخم­مرغ‌ها و با اسانس سبب کاهش وزن زرده گردید (Arpasova et al., 2013). بره‌موم در درازمدت در صورت همراه شدن با ترکیبات غذایی می‌تواند بر وزن ماهیان هم بررسی گردد (خالقی‌میران و همکاران، 1389).

   استفاده از بره­موم در جیره غذایی ماهی قزل­آلای رنگین‌کمان سبب کاهش در مرگ‌ومیر تخم ماهی، رشد عضلانی سریع در مقایسه با تیمار شاهد و در مجموع به­عنوان عاملی در بهبود پرورش ماهی است (Velotto etal., 2010).

   بره­موم حاوی فلاونوئید و ترکیبات فنولی است. فلاونوئیدها بعنوان آنتی اکسیدان در کاهش استرس ناشی از بیماری‌ها و سموم مطرح هستند (Kakoolaki et al., 2013). تاثیر عصاره اتانولی بره­موم روی موش صحرایی سبب بهبود زخم معده و کاهش pH معده گردید. فلاونوئید و ترکیبات فنولی موجود در آن سبب خاصیت ضد التهابی بوده و در مجموع بره­موم به­عنوان افزایش­دهنده فاکتورهای محافظتی و آنتی‌اکسیدانی عمل می‌کند (Pillai et al., 2010) و سبب تحریک سیستم ایمنی و اثرات ضد سرطانی در موش می‌گردد. همچنین، سیستم­های آنزیمی و متابولیسم سلولی تشکیل کلاژن را تحریک کرده و سبب بهبود زخم سوختگی می­گردد این تاثیرات به­دلیل وجود آرژینین در بره­موم است (Ghisalberti, 1979).

   مطالعات اندکی در مورد ترمیم زخم‌های ماهی با مواد طبیعی انجام شده است. مثلا عصاره گیاه اکالیپتوس در کپور علف­خوار سبب تسریع بهبود زخم پوستی و کاهش بار باکتریایی و تحریک سیستم ایمنی گردید (غفوری روزبهانی و همکاران، 1392).

   استفاده از سیر در ترمیم زخم ماهی کپور سبب گردید زخم‌ها پس از 3 هفته بهبود یابند در صورتی که در تیمار شاهد پس از 4 هفته بهبودی حاصل نشده بود (کاظم‌پور و همکاران، 1384). در تحقیق حاضر نیز تسریع در بهبود زخم‌های پوستی در ماهی کپور مشاهده گردید.

   از مجموع نتایج چنین برمی‌آید که استفاده از 2 درصد بره­موم بهترین نتایج را از نظر بهبود زخم و  فاکتورهای خونی و بقاء به­دنبال دارد و به‌نظر می‌رسد استفاده از بره­موم را بایستی در غلظت‌های کمی بالاتر از 2 درصد به‌طور دیگری و یا با ترکیبات غذایی همراه کرد تا خونریزی، تلفات و ... از بین برود که همگی می‌تواند زمینه‌ای برای مطالعات آینده باشد.

   فعالیت ضدباکتریایی بره­موم بر اساس روش استخراج، حلال‌ها، منطقه جغرافیایی و فصل متفاوت است. روش‌های مختلف حل کردن بره­موم در فعالیت آن تاثیر می‌گذارد (Sforcin, 2007). لذا، می‌توان تحقیقات روی موجودات را با انواع مختلف آن بررسی نمود.

مراجع

• اشراقی، س. و والافر، ش. (1382). اثر ضدباکتریایی بره‌موم بر گونه‌های بیماری نوکاردیا. مجله دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، سال 11، شماره 2، صفحات: 48-42.
• بنایی، م.، میرواقفی، الف.، مجازی امیری، ب.، رفیعی، غ. و نعمت‌دوست، ب. (1390). بررسی خون‌شناسی و آسیب‌شناسی بافتی در مسمومیت تجربی با دیازینون در ماهی کپور معمولی. نشریه شیلات مجله منابع طبیعی ایران، دوره 64، شماره 1، صفحات: 13-1.
• بصیری، م. ر. (1387). فرآوری محصولات زنبورعسل. انتشارات آموزس عالی علمی کاربردی جهاد دانشگاهی.
• بیرقدارکشکولی، الف. (1387). تأثیر عصاره موم بر عملکرد جیره، بازماندگی و برخی فاکتورهای خونی بچه ماهیان انگشت قد  قزل آلای رنگین کمان، پایان نامه کارشناسی ارشد دانشگاه صنعتی اصفهان.
• توکلی، م.، عرب، ف.، محمودی، م.، جعفری، ه.، توکلیان، و. و کمالی، م. (1389). اثر عصاره هیدر الکلی درمنه کوهی بر روند بهبود زخم‌پوستی موش‌صحرایی. مجله دانشگاه علوم پزشکی مازندران، دوره 20، شماره 77، صفحات: 24-17.
• خالقی میران، م.، کریمی، م.، بسامی، م. و رجبی، ج. (1389). تأثیر فیتوبیوتیک جمع‌آوری شده توسط زنبور عسل بر سیستم ایمنی جوجه‌های گوشتی، اولین همایش ملی فن آوری‌های نوین در کشاورزی و منابع طبیعی.
• رحیمی بشر، م.، تهرانی فرد، الف.، قاسمی نژاد، الف.، علیپور، و. و فلاح، م. (1386). تعیین برخی از فاکتورهای خونی ماهی سفید دریای خزر در مراحل مختلف رشد گنادی. مجله علوم زیستی واحد لاهیجان - سال اول، پیش شماره 3، زمستان 1، صفحات: 56-45.
• سیدی، م. (1388). بره‌موم داروی طبیعی از کندوی زنبور عسل. نشر نصوح.
• شاهسونی، د.، مهری، م. و نصری، ن. (1382). بررسی تاثیر ماده شوینده آنیونی شامپو بر پارامترهای خونی ماهی حوض. مجله پژوهش و سازندگی، شماره 61، صفحات: 103-99.
• شوهانی، ب.، همتی، الف. و طاهری مقدم، م. (1388). بررسی اثر التیام بخشی عصاره هیدر الکلی گیاه تشنه‌داری (Scrophularia striata)بر روی زخم باز پوستی خرگوش. دانشگاه علوم پزشکی ایلام، دوره 17، شماره 4، صفحات: 16-9.
• علیشاهی، م.، سلطانی، م.، مصباح، م. و اسماعیلی، الف. (1390). تاثیر تجویز خوراکی عصاره خار مریم بر پاسخ ایمنی ماهی کپور معمولی. مجله تحقیقات دامپزشکی، دوره 66، شماره 3، صفحات: 263-255.
• غفوری روزبهانی،ه .، زمینی، ع.،  وهابزاده ح. و فرخ روز ، م. (1392). بررسی اثرات ضد باکتریایی اسانس گیاه اکالیپتوس در بهبود زخم‌های ماهی و کاهش بار باکتریایی پوست بچه ماهیان کپور علفخوار. همایش گیاهان دارویی، تهران، ایران.
• کاظم‌پور، ی.، رضایی، م. و کیوانی، ی. (1384). تاثیر عصاره سیر گل خطمی و بابونه در ترمیم زخم‌های سطحی ماهی کپور معمولی. مجله پژوهش و سازندگی، شماره 66، صفحات: 97 -93.
• مهدیزاده، م.، پوررضا، ج.، جوکار، الف. و طهماسبی، غ. (1383). اثر استفاده از بره موم در جیره بر روی عملکرد و سیستم ایمنی مرغان تخمگذار تجارتی. مجله پژوهش و سازندگی، دوره 17، شماره 3، صفحات: 73-67.

 

• · Arpasova , H., Kacaniova, M., Hascik, P., Cubon, J. and Fikselova, M. ( 2013). The influence of oregano Essential oil and bee products on qualitative parameters and microbiological indicators of table eggs content. Journal of Microbiology and Biotechnology, 1:1107-1127.
• · Ferguson, M.W. and Leigh, I.M. (1998). Wound healing textbook of dermatology. 6th ed. London: Blackwell Science, 1: 337-343.
• · Ghisalberty, E. L. (1979). Propolis: A review. Bee World 60, pp: 59-84.
• · Kakoolaki1, Sh., Cakir, O., Ciftci, O. and Ozdemir, I. (2013). Role of propolis on oxidative stress in fish brain. Basic and Clinical Neuro Science, 4(2): 45-50.
• · Paintz, M. and Metzner, J. (1979). Local anesthetic effect of propolis and some of its constituent's. Pharmazie, 34(12): 839-841.
• · Pillai1, M. (2010). Antiulcerogenic and ulcer healing effects of Indian propolis in experimental rat ulcer models. Journal of Api Product and Api Medical Science, 2(1): 21-28.
• · Sabistan,W. (1991).Textbook of surgery. 14th ed. New York: WB Saunders Company, pp. 171-173.
• · Sforcin, J.M. (2007). Propolis and the immune system. Journal Ethnopharmacol, 113(1): 1-14.
• · Velotto, S., Vitale, C., Varricchio, E. and Crasto, A. (2010). Effect of Propolis on the fish muscular development and histomorphometrical characteristics. Veterinary Journal. BRNO, pp: 543-554.