بررسی چند شکلی ژنتیکی و فراوانی آللی جایگاه ژنی GHRH (Growth-hormone-releasing hormone) در گاوهای سرابی ایران

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 8، دوره 7، 2 (26) تابستان، شهریور 1392، صفحه 1898-1904   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

مهدی خسروی^* ؛ مهدی امین افشار؛ محمد چمنی

دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم وتحقیقات تهران، گروه علوم دامی، تهران، ایران.

چکیده

   انتخاب حیوان بر اساس نشانگرهای مولکولی یکی از جدیدترین روش­های اصلاحی است که می‌تواند باعث بهبود صحت پیش‌بینی و پاسخ به انتخاب شود. GHRH (Growth-hormone-releasing hormone) یکیازژن­هایبرگزیدهبرایاستراتژی‌هایانتخاببراساسمارکرمی‌باشد.براساسگزارشاتموجود، چندشکلی‌هایژن بهطورمعنی‌داریباصفاتاجزایشیروتولیدآنارتباطدارد. به منظور بررسی چندشکلی (پلی‌مورفیسم) مکان ژنی GHRH در نژاد سرابی، از 112 رأس گاو خونگیری انجام شد.DNA ژنومینمونه­هایخون استخراجگردیدوقطعه297جفتبازاز اینژنبااستفادهازواکنشزنجیره‌ایپلی‌مراز تکثیرشد.قطعهتکثیرشدهبه­وسیلهآنزیممحدودکننده HaeIIIموردبرشقرارگرفتورویژلآگارز2درصد الکتروفورزگردید.نتایجنشان داد که در این جایگاه دو آلل GHRH ^A و GHRH ^B وجود دارد کهفراوانیآنهادرکلجمعیتبه­ترتیب 19/0 و 81/0 محاسبهگردید.سهترکیبژنوتیپی GHRH ^A GHRH ^A، GHRH ^A GHRH ^B  و GHRH ^B GHRH ^B  شناساییشدندکهفراوانی‌هایژنوتیپیمحاسبه شدهآنهادرکلجمعیتبه­ترتیببرابر 0357/0، 3037/0 و 6607/0 بود.آزمون مربع کای تعادل هاردی- واینبرگ را در جمعیت نشان داد (05/0<p). نتایج تحقیق حاضر نشان می‌دهد که تنوع ژنتیکی در نژاد گاو سرابی می‌تواند به برنامه‌های انتخابی آینده مخصوصاً انتخاب به کمک نشانگرهای مولکولی (MAS) کمک نماید.

کلیدواژه‌ها

گاو سرابی؛ GHRH؛ چند شکلی ژنتیکی

اصل مقاله

مقدمه

   گاوهای بومی به عنوان ذخایر ژنتیکی کشور محسوب می­شوند و شناسایی استعداد تولید آنها و تکثیرشان پس از اصلاح نژاد یک اصل مهم به شمار می­رود. با توجه به اینکه گاو و گاومیش نقش مهمی در اقتصاد کشاورزی و دامپروری بسیاری از کشورهای جهان به ویژه کشورهای آسیایی دارند، و با توجه به نیاز به افزایش تولید عمودی، لازم است که تحقیقات کاملی در این مورد  انجام شود (Asri, 2002). توده گاو سرابی به عنوان  یکی از ذخایر ژنتیکی مهم گاوهای بومی کشور به شمار می‌آید که حفاظت از آنها برای نسل‌های آینده نیز ضروری است زیرا در بسیاری موارد با گذشت ‏زمان و پیشرفت علم و آگاهی بیشتر نسبت به اهمیت اقتصادی صفات مختلف، نیازهای جدید مطرح می‌شود ‏که متخصصین اصلاح نژاد را بر آن می‌دارد تا از ژن‌های مربوط به حیوانات بومی که قبلاً اهمیت زیادی به آنها داده نمی­شد، ‏استفاده نمایند (Torbati, 2005). هیپوتالاموس نقش بسیار مهمی در ترشح هورمون‌ها بر عهده دارد هیپوتالاموس توسط ساقه­ای به غده هیپوفیز وصل می‌شود. در این ساقه یک سیستم ورید باب و همچنین آکسون‌های سلول‌های عصبی هیپوتالاموس وجود دارند که ارتباط این دو غده را برقرار می‌کنند. هورمون رشد (GH، سوماتوتروپین) توسط بخش پیشین غده هیپوفیز که یک غده درون‌ریز است، ترشح می‌شود و هیپوتالاموس توسط هورمون آزادکننده GHRH(Growth Hormone-releasing Hormone)و هورمون مهار کننده SRLF(سوماتوستاتین) ترشح هورمون رشد را از هیپوفیز قدامی کنترل می‌کند. هورمون محرک هورمون رشد GHRH (Somatoliberlin) یک هورمون آزادکننده پلی‌پپتیدی است که از غده هیپوتالاموس ترشح می‌شود و توسط سیستم ورید باب در ساقه هیپوفیز به غده هیپوفیز می‌رسد. کار هورمون GHRH آزاد کردن و تحریک ترشح هورمون رشد از غده هیپوفیز است. این هورمون بر قسمت قدامی هیپوفیز یعنی هیپوفیز پیشین اثر می‌گذارد و باعث ترشح هورمون رشد از این غده می‌شود (Frohman et al., 1992). هورمون GHRH با یک‌سری گیرنده­های ویژه که در هیپوفیز پیشین قرار گرفته است، باند شده و باعث ترشح هرمون رشد می‌گردد (Frohman et al., 1992).  هورمون سوماتولیبرلین یک پلی‌پپتید شامل 44 آمینو اسید می‌باشد. ژن GHRH گاوی بر روی کرومزوم 13 واقع شده است (Barendse et al., 1994) و شامل 5 اگزون است (Zhou et al., 2000). در سال 1995 برای اولین بار Moody و همکاران جایگاه ژنی GHRH را با استفاده از روش PCR-RFLP و آنزیم HaeIII مورد بررسی قرار دادند. در این تحقیق رابطه بین آلل‌های حاصل از این جایگاه با صفات تولید شیر در گاو‌های هلشتاین مورد بررسی قرار گرفت. نتایج شان داد که ژنوتیپ GHRH ^A GHRH ^A رابطه معنی­داری با افزایش تولید و درصد چربی شیر دارد (Moody et al., 1995). هدف از تحقیق حاضر، شناسایی چند شکل‌های موجود در ژن هورمون آزادکننده فاکتور رشد و برآورد میزان فراوانی فرم‌های آللی و ژنوتیپی مختلف آن برای این جایگاه در گاو های سرابی می‌باشد.     

 

مواد و روش­ها

    از تعداد 112رأس گاوهای سرابی موجود در مرکز پشتیبانی گاو سرابی خونگیری به­عمل آمد. برای جلوگیری از انعقاد خون به میزان 1/0 حجم نمونه‌ها، محلول EDTA (5/0 مولار با 8=pH) اضافه شد. استخراج DNA از 100 میکرولیتر خون با استفاده از روش گوانیدین سیلیکا ژل انجام شد. این روش استخراج مبتنی بر استفاده از ایزوتیوسیانات گوانیدین به عنوان یک عامل لیز کننده سلول­های خونی و جمع‌آوری DNA آزاد شده به کمک ذرات سیلیکا  می‌باشد (Boom et al., 1989). جهت تعیین چند شکلی از روش PCR-RFLP استفاده شد. قطعه 297 جفت بازی  جایگاه GHRH با استفاده از پرایمرهای اختصاصی زیر تکثیر گردید (Moody et al., 1995).

GHRHF – 5’-TTCCCAAGCCTCTCAGGTAA-3’

GHRHR – 5’-GCGTACCGTGGAATCCTAGT-3’

   برنامه  PCR شامل 35 سیکل تکثیر با دمای واسرشت شدن اولیه°^c94 (به­مدت 5 دقیقه)، دمای واسرشت ثانویه °^c94 (به­مدت 1 دقیقه) ، دمای اتصال °^c60  (به­مدت 50 ثانیه) ، دمای تکثیر °^c72 (به­مدت 50 ثانیه) و تکثیر نهایی  دمای^°c72  (به­مدت 5 دقیقه) است. محصولات PCR روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شده و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی گردید. فراوانی آلل­ها، هتروزیگوسیتی و تعداد آلل مؤثر با استفاده از نرم افزار PopGen32 محاسبه شد.

   هضم آنزیمی محصولات PCR با استفاده از آنزیم محدودالاثر HaeIII به مدت 3 ساعت در دمای37 درجه سلسیوس انجام گرفت. واکنش به حجم 20 میکرولیتر و واکنشگرها شامل5 میکرولیتر محصول PCR ، 2 میکرولیتر بافرX 10، 5 واحد آنزیم برشی و 12 میکرولیتر آب مقطر بودند. پس از هضم آنزیمی، محصولات هضم با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز 2 درصد و با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید مشاهده شدند.

 

یافته‌ها

   استخراج DNA با روش تیوسیانات گوانیدین سیلیکاژل مقادیر بالایی از DNA ژنومی (حدودng 70) را حاصل کرد که با اسپکتروفتومتر ارزیابی گردید. 

   نتیجه واکنش پلیمراز، تکثیر قطعه 297 جفت بازی از ژن GHRH را تأیید می کند (شکل 1). مقایسه باندهای موجود در نمونه‌های هضم شده با آنزیم HaeIIIبا نشانگر وزنی M50bp بر روی ژل آگارز در شکل 2 نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

           

 

 

 

 

 

شکل 1- محصولات  PCR ژن GHRH ( قطعه297 جفت‌بازی) روی ژل آگارز 5/1 % . نشانگر ملکولی مورد استفاده M100 می‌باشد.

 

 

   با بررسی قطعات حاصل از هضم سه ژنوتیپ GHRH ^A GHRH ^A،  GHRH ^A GHRH ^B و GHRH ^B GHRH ^B  شناسایی شد (شکل 2).

 

 

 

شکل2- الگوهای باندی حاصل از هضم آنزیمی بر روی ژل آگارز 2درصد

 

 

 

   در آلل GHRH ^A از قطعه تکثیر یافته، یک جایگاه و در آلل  GHRH ^B دو جایگاه برش برای آنزیم HaeIII وجود دارد. در نتیجه، هضم آنزیمی  آلل GHRH ^A  محصولات هضمی bp 55 و 242 را تولید می‌نماید و محصولات هضمی آللGHRH ^B  شامل باندهای bp 48، 55 و 195 است. در نتیجه ژنوتیپGHRH ^A GHRH ^A  دارای دو باند bp 55 و 242 ، ژنوتیپ GHRH ^B GHRH ^B  دارای سه باند bp 48، 55 و242 و ژنوتیپ GHRH ^A GHRH ^B دارای چهار باند bp 48، 55، 195 و242 می‌باشند. ژنوتیپ GHRH ^B GHRH ^B  بیشترین تعداد و فراوانی را در گله مورد  بررسی نشان داد.  فراوانی آللی برای آلل‌های GHRH ^A و GHRH ^B به ترتیب  19/0 و 82/0 بدست آمد. آزمون مربع کای، برقراری تعادل هاردی واینبرگ را در گله نشان داد (جدول 1).

 

ژنوتیپ	تعداد	فراوانی ژنوتیپی %	فراوانی آللی		آزمون مربع کای (χ2)
			GHRH A	GHRH B
GHRH A GHRH A	4	57/3	19/0	81/0	ns007/0
GHRH A GHRH B	34	36/30
GHRH B GHRH B	74	07/66

جدول1- فراوانی ژنوتیپی و آللی ژن GHRH و آزمون­های مربع کای

 

 

 

 

 

 

 

ns                    : χ² غیر معنی‌دار (05/0<p)

 

بحث و نتیجه‌گیری

   در سال 2006 مطالعه‌ای روی 881 رأس گاو سیاه و سفید لهستان انجام گرفت، که فراوانی‌های ژنوتیپی محاسبه شده برای سه ترکیب ژنوتیپی GHRH ^A GHRH ^A،  GHRH ^A GHRH ^B و GHRH ^B GHRH ^B  در کل جمعیت به­ترتیب برابر با 0545/0، 313/0 و 632/0 بود. در این پژوهش محققان ارتباط معنی‌داری بین پلی‌مرفیسم جایگاه ژنی GHRH و تولید شیر پیدا نکردند (Dybus et al., 2006). در مطالعه دیگری که در سال 2003 روی 130 راس گاو لیموزین صورت گرفت فراوانی ژنوتیپی برای ژنوتیپ‌های GHRH ^A GHRH ^A،  GHRH ^A GHRH ^B وGHRH ^B GHRH ^B  به ترتیب 0154/0، 1692/0 و 8154/0 بود (Dybus et al., 2003). 

   آزمون مربع کای، برقراری تعادل هاردی واینبرگ را در گله نشان داد که گویای این مطلب است که هیچگونه انتخابی در جمعیت در جهت افزایش یا کاهش ژنوتیپ‌های ژن GHRH صورت نگرفته است (جدول 1).

    میزان تغییرات ژنتیکی در داخل یک جمعیت با اندازه‌گیری هتروزیگوسیتی و تعداد آلل مؤثر مکان ژنی مورد مطالعه تعیین می‌شود. در تحقیق حاضر  هتروزیگوسیتی مشاهده شده، 303/0 و هتروزیگوسیتی مورد انتظار 306/0 بود که این مقادیر بسیار نزدیک به هم است و نشان‌دهنده بالا بودن تنوع ژنتیکی این مکان ژنی در نژاد سرابی است. این ممکن است نشان‌دهنده آن باشد که جمعیت مورد مطالعه در یک ساختار با جفت‌گیری تقریباً تصادفی حفظ شده و هیچ برنامه انتخابی سازمان‌یافته‌ای در این جمعیت صورت نگرفته است (جدول 2). در مطالعه‌ای که روی گاو سیاه و سفید لهستان صورت گرفت، مقدار هتروزیگوسیتی بالایی گزارش شد که مشابه تحقیق حاضر بود (Dybus et al., 2006) ولی در مطالعه روی نژاد هلشتاین مقدار هتروزیگوسیتی پایین‌تری گزارش شده است که نشان دهنده تنوع ژنتیکی پایین در جمعبت گاوهای هلشتاین مورد بررسی می‌باشد (Kmiec et al., 2007). تعداد آلل مؤثر، تعداد آلل‌هایی است که هتروزیگوسیتی یکسان ایجاد می‌نماید. این پارامتر در جدول 3 آورده شده است. تعداد آلل مؤثر برای ژن GHRH در این گله گاو سرابی مقدار 43/1 به­دست آمد.

 

 

جدول2- هتروزیگوسیتی مشاهده شده و هتروزیگوسیتی مورد انتظار جایگاه ژنی GHRH

جایگاه ژنی	هتروزیگوسیتی موردانتظار	هتروزیگوسیتی مشاهده شده
GHRH	306/0	303/0

 

جدول 3- اندازة مؤثر آللی برای جایگاه ژنی GHRH

جایگاه ژنی	اندازه مؤثر آللی	تعداد نمونه
GHRH	43/1	112

 

   نتایج این مطالعه نشان داد که چندشکلی ژنتیکی در جایگاه ژنی GHRH برای نژاد سرابی وجود دارد. بر اساس گزارشات موجود، چندشکلی‌های ژن به طور معنی­داری با صفات اجزای شیر و تولید آن ارتباط دارد. از وجود این چند‌شکلی‌ها، جهت بررسی ارتباط بین چند‌شکلی ژنتیکی با صفات تولیدی از قبیل ترکیب و تولید شیر به عنوان مارکر ژنتیکی می‌توان استفاده نمود. Moody و همکاران رابطه بین آلل‌های حاصل از این جایگاه با صفات تولید شیر در گاو‌های هلشتاین را مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که ژنوتیپ GHRH ^A GHRH ^A رابطه معنی­داری با افزایش تولید و درصد چربی شیر دارد (Moody et al., 1995). نتایج حاصل از تحقیقی که توسط Kmiec و همکاران، روی 719 راس گاو نژاد هلشتاین صورت گرفت، نشان داد که ژنوتیپ GHRH ^A GHRH ^A با افزایش تولید شیر ارتباط معنی­داری دارد (Kmiec et al., 2007). همانطور که ملاحضه می‌شود، در بسیار از تحقیقات این ناحیه به­عنوان مارکر انتخابی جهت افزایش تولید و ترکیب شیر شناسایی شده است.  بنابراین می­توان از این مارکر در برنامه‌های اصلاح نژادی در جهت کیفیت بهتر و دقت بیشتر در انتخاب استفاده نمود.  نتایج تحقیق حاضر نشان می‌دهد که تنوع ژنتیکی در این نژاد می‌تواند به برنامه‌های انتخابی آینده مخصوصاً انتخاب به کمک نشانگر MAS (Marker Assisted Selection)  یاری نماید.

مراجع

• عصری، م. (1380). همایش گاو و گاومیش؛ نقطه تلاقی علم و تجربه. مجله دامداران ایران، دوره 27،  شماره 3، صفحه 71-65.
• تربتی، ف. (1383). بررسی پلی‌مورفیسم و فراوانی آللی اگزون 2 در جایگاه ژنی BoLA-DRB3 در گاوهای نجدی و سرابی، پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشکده کشاورزی. دانشگاه فردوسی.

 

• Asri, M. (2002). Conference of cattle and buffaloes: Intersection of science and experience. Journal of Iranian farmers, 27(3): 65-71 [In Farsi].
• Barendse, W., Armitage, S.M. and Kossarek, L.M (1994). A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genetics, 6: 227-235.
• Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheim-Van Dillen, P.M.E. and Van Der Noordaa, J. (1989). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology, 28(3): 495-503.
• Dybus, A. and Grzesiak, W. (2006). GHRH/HaeIII gene polymorphism and its associations with milk production traits in Polish Black-and-White cattle Arch. Tierz, Dummerstorf, 49(5): 434-438.
• Dybus. A., Kmiec, M., Sobek, Z. and Pietrzyk, W. (2003). Associations between polymorphisms of growth hormone releasing hormone (GHRH) and pituitary transcription factor 1 (PIT1) genes and production traits of Limousine cattle. Arch. Tierz, Dummerstorf, 46(6): 527-534.
• Frohman, L.A., Bowns, T.R. and Chomeszynski, P. (1992). Regulation of growth hormone secretion. Front. Neuroendocrinology, 13: 344 - 405.
• Kmiec, M., Luczak, I.K., Kulig, H. and Terman, A. (2007). Associations between GHTH/HaeIII restriction polymorphism and milk production traits in a herd of dairy cattle. Journal of Animal and Veterinary Advances, 6(11): 1298-1303.
• Moody, D.E., Pomp, D. and Barendse, W. (1995). Restriction fragment length polymorphism in amplification products of the bovine growth hormone-releasing hormone gene. Journal of Animal Science, 73: 37-89.
• Torbati, F. (2005). Study of polymorphism of Bovine Lymphocyte Antigen DRB3.2 Alleles in Najdi and Sarabi Cows. M.Sc. thesis. College of Agriculture, Ferdowsi University, Mashhad-Iran [In Farsi].
• Zhou, P., Kazmer, G.W. and Yang, X. (2000). Bos taurus growth hormone releasing hormone gene, complete cds. GenBank, AF 24: 28-55.