مقایسه اثر بیوایمپلنت استخوانی زنوژن و گرانول کلسیم فسفات در التیام نقیصه تجربی ایجاد شده در استخوان فمور خرگوش

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 8، دوره 6، 1 (21) بهار، خرداد 1391، صفحه 1483-1492   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

غفور موسوی^{* 1}؛ داریوش مهاجری²؛ فرهاد صادق پور گلزار³

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم درمانگاهی، تبریز، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، تبریز، ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، دانش آموخته دامپزشکی، تبریز، ایران

چکیده

بازسازی و ترمیم استخوان از دست رفته، خواه ناشی از علل فیزیولوژیک و خواه به سبب عوامل پاتولوژیک یکی از انگیزه­های جراحان از زمان­های دور بوده است. خاصیت القای استخوان سازی استخوان دکلسیفیه شده ناشی از فاکتورهای رشد موجود در آن است. هدفاز انجاماینمطالعهمقایسههیستوپاتولوژیاثرپیونداستخوانیدکلسیفیهخشک شدهزنوژن و گرانول کلسیم فسفات در التیام نقیصه ایجاد شده در استخوان فمور خرگوش می­باشد. این مطالعه تجربی آزمایشگاهی روی 15 سر خرگوش سفید نیوزلندی انجام شد. خرگوش­ها به صورت تصادفی به 3 گروه (تیمارها و شاهد) تقسیم شدند. پس از القای بیهوشی عمومی با استفاده از مته دندانپزشکی دو سوراخ به قطر 2 میلی­متر در عرض استخوان فمور تا رسیدن به کانال مدولاری ایجاد شد. در گروه شاهد محل نقیصه به صورت خالی رها شد و در گروه دوم استخوان دکلسیفیه شده قرار داده شد و در گروه سوم گرانول کلسیم فسفات در محل نقیصه قرار داده شد. 45 روز پس از جراحی، خرگوش­ها آسان­کشی شده و مقاطع هیستوپاتولوژیک از محل نقیصه ایجاد شده تهیه و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین انجام گردید و مورد ارزیابی هیستوپاتولوژی و هیستومورفومتری قرار گرفت. در گروه شاهد محل نقیصه توسط استخوان نابالغ به همراه فضاهایی از مغز استخوان پر شده بود و استخوان­سازی ضعیفی در محل نقیصه قابل مشاهده بود. در گروه­ آزمایش گرانول کلسیم فسفات، مقادیر فراوانی از ترابکول­های استخوانی جوان شکل گرفته بود که به صورت سازمان یافته به نظر می­رسید. نتایج ارزیابی هیستومورفومتری نشان داد که گرانول کلسیم فسفات دارای تاثیر معنی­داری در التیام استخوان نسبت به گروه استخوان دکلسیفیه و گروه شاهد می­باشد.

کلیدواژه‌ها

استخوان دکلسیفیه زنوژن؛ گرانول کلسیم فسفات؛ التیام استخوان؛ خرگوش؛ هیستوپاتولوژی

اصل مقاله

مقدمه

 

     با وجود پیشرفت­های فراوانی که امروزه در جراحی ارتوپدی ایجاد شده است ولی التیام استخوان کماکان یک مسئله چالش برانگیز می­باشد. روش­های درمانی که به طور رایج در شکستگی­ها مورد استفاده قرار می­گیرد، شامل تثبیت خارجی از طریق بی­حرکت نمودن استخوان شکسته و یا تثبیت داخلی استخوان شکسته می­باشد. با وجود این، روش­های مذکور در مواردی مانند عدم جوش خوردگی و جوش خوردگی تأخیری، شکستگی­های خرد شده، آماس­های مغز استخوان و تومورهای استخوانی همیشه موفق نبوده­اند (16). در التیام استخوان، سلول­های تولید کننده استخوان نیاز به یک ماده زمینه­ای استخوانی برای رشد، اضافه شدن و ملحق شدن به مواد معدنی و پروتئین­های استخوان دارند. در روند طبیعی التیام شکستگی استخوان، لخته­های خون و بافت پیوندی، فضای ایجاد شده توسط شکستگی را پر می­کند و همچنین ساختار و داربست مناسبی برای رشد استخوان فراهم می­کند (17). پیوند استخوان اسفنجی معمولا از بخش لگن بیمار برداشت شده و به محل مورد نظر منتقل می­شود، با این حال پیوند استخوان اسفنجی می­تواند دارای عوارضی مانند خونریزی، بی­حسی، آسیب به دستگاه ادراری، فتق، دردهای مزمن، عفونت­ها، شکستگی­های ناحیه­ای، عدم تعادل در ناحیه لگن و... ­باشد (5 و 12). به منظور رفع این محدودیت­ها امروزه از انواع گوناگون مواد جایگزین شونده گرافت­های استخوانی که به طور مصنوعی یا به صورت آلوژن تهیه می­گردند استفاده می­شود. این دسته از مواد یا از خاصیت القای استخوان­سازی (استئواینداکتیویتی) برخوردار بوده و یا به صورت انتقال­دهنده عوامل استخوان­ساز (استئوکانداکتیو) به عنوان حاملی جهت انتقال پروتئین­های هدایت­کننده استخوان عمل می‌کنند (16، 17 و 19). در سال‌های اخیر با پیشرفت استفاده از بیومتریال­ها به عنوان جایگزین­های استخوانی، ترکیبات کلسیم فسفات دور نمای خوبی را در روش­های جراحی پیشرفته تثبیت نموده­اند (6 و 21). شکل­های مختلفی از ترکیبات کلسیم فسفات قابل عرضه می‌باشند. مطالعه‌های مختلف نشان داده است که ترکیبات کلسیم فسفات دارای خاصیت زیست سازگاری با بدن بوده و به عنوان یک عامل استئوکانداکتیو بازسازی بافتی استخوان را تحریک می­کنند (1، 11 و 18). مطالعات حیوانی متعددی نشان دادند که دمینرالیزه کردن پیوند آلوژن استخوان کورتیکال، موجب اکسپوز شدن پروتئین‌های مرفوژنیک استخوانی (BMPs) و در نتیجه افزایش پتانسیل استئوژنیک آن می­شود زیرا BMPs توانایی القاء تمایز سلول­های میزبان به استئوبلاست را دارا می‌باشند (13). بررسی‌های انجام شده توسط Urist و همکارانش حکایت از پتانسیل استئوژنیک استخوان دکلسیفیه خشک شده آلوژن را دارد، که در نتیجه اکسپوز شدن پروتئین‌های مرفوژنیک استخوانی است که باعث القاء تمایز سلول­های میزبان به استئوبلاست می‌شوند (23). انجام این مطالعات نشان می­دهد که از استخوان دکلسیفیه شده می‌توان به عنوان یک ماده پیوندی استفاده کرد. هدف از انجام این مطالعه ارزیابی مقایسه­ای پیوند گرانول کلسیم فسفات و پیوند استخوان دکلسیفیه خشک شده که اخیراً داخل کشور تولید شده و در این مطالعه به صورت زنوژن مورد استفاده قرار گرفته است در التیام نقیصه ایجاد شده استخوان فمور در مدل حیوانی خرگوش می­باشد که به صورت ارزیابی هیستوپاتولوژی و هیستومورفومتری صورت گرفته است.

مواد و روش­ها

    مطالعه حاضر به صورت تجربی آزمایشگاهی انجام گرفت. از 15 سر خرگوش نر سفید نیوزلندی 6 ماهه، با وزن 3ـ5/2 کیلوگرم استفاده شد. خرگوش­ها از مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی تبریز تهیه گردید و به صورت 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و درجه حرارت 2±23 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی هفتاد درصد نگهداری می­گردیدند. هر خرگوش طی دوره آزمایش، در یک قفس انفرادی تمیز با دسترسی آزاد به آب و خوراک مخصوص حیوانات آزمایشگاهی نگهداری شدند. پروتکل این مطالعه مطابق اصول اخلاقی مورد تائید کمیته‌های بین‌المللی حمایت از حقوق حیوانات آزمایشگاهی طراحی شده است. خرگوش­ها به صورت تصادفی به 3 گروه کنترل (گروه شاهد)، گروه دوم (گروه استخوان دکلسیفیه) و گروه سوم (گروه گرانول کلسیم فسفات)، با 5 سر خرگوش تقسیم شدند.

بیوایمپلنت استخوان دکلسیفیه خشک شده:

بیوایمپلنت مورد استفاده در این مطالعه ساخت داخل کشور و توسط شرکت همانندساز بافت تولید و با نام تجاری Ceno bone به بازار عرضه شده است. این محصول به صورت کاملاً استریل تهیه و در یک ویال استریل بسته­بندی شده و تا زمان تاریخ انقضای مندرج روی بسته در دمای معمولی محیط (15 تا 25 درجه سانتیگراد) قابل نگه­داری می­باشد.

گرانول کلسیم فسفات:

گرانول کلسیم فسفات مورد استفاده در این مطالعه ساخت شرکت Kasios TCH فرانسه می‌باشد و به صورت بیوفازیک تهیه و دارای پایه تری­کلسیم­فسفات و هیدروکسی آپاتیت می‌باشد. ترکیبات مورد استفاده در ساخت این محصول به صورت زیر می‌باشد:

75% hydroxylapatite ± 5% Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂
 25% tricalcium phosphate ± 5%Ca₃(PO₄)₂

 گرانول‌های مورد استفاده اندازه­ای به طول 2 الی 3 میلی­متر را دارا بوده و به صورت بلوک­های مربع تهیه ‌گردیده‌اند. این گرانول­ها دارای تخلخل 70% می‌‌باشند که اندازه هر یک از این تخلخل­ها 200 الی 500 میکرومتر می­باشد و مطابق بروشور کارخانه سازنده دارای مقاومت 1 الی 5 مگاپاسکال هستند.

روش جراحی:

به منظور ایجاد بیهوشی از کتامین (Ketamine 10%, Alfasan,Woerden-Holland) به میزان 35 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن و زایلازین (Xylazin 2%, Alfasan,Woerden-Holland) به مقدار 5 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت داخل وریدی از طریق ورید گوش استفاده شد. پس از ایجاد بیهوشی ناحیه ستیغ لگنی تا مفصل زانوی اندام حرکتی خلفی چپ به صورت معمول آماده جراحی گردید. برشی به طول 3 سانتی­متر روی پوست بخش جانبی اندام خلفی چپ در موازات استخوان فمور ایجاد گردید. فاسیا و بافت‌های همبندی زیرجلدی به صورت کُندکاری جدا و سپس عضلات ناحیه از محل اتصال آنها به همدیگر باز گردیدند و استخوان فمور در معرض دید قرار گرفت. با استفاده از مته دندانپزشکی و حداکثر سرعت چرخش 6000 دور در دقیقه، 2 سوراخ به قطر 3 میلی­متر در عرض استخوان فمور در قسمت دیافیز تا رسیدن به کانال مدولاری و با فاصله یک سانتی­متر از همدیگر ایجاد شد، موضع جراحی با نرمال سالین شستشو داده شد. پس از آن در گروه شاهد از هیچ ماده­ای برای پرکردن نقیصه ایجاد شده، استفاده نگردید. در گروه دوم، تعدادی از قطعات استخوان دکلسیفیه خشک شده از ویال خارج و در داخل یک ظرف استریل در سالین نرمال قرار داده شد، پس از گذشت چند دقیقه استخوان­های دکلسیفه نرم و حالت اسفنجی گرفته و سپس در محل نقیصه ایجاد شده، قرار داده شدند. در گروه سوم، گرانول کلسیم فسفات از ویال خارج و سپس در محل نقیصه ایجاد شده قرار داده شدند. سپس عضلات به صورت سرتاسری ساده با نخ بخیه قابل جذب سنتتیک پلی­گلی­کولات 0-4 ساخت کارخانه سوپا بخیه زده شد و پوست با نخ بخیه سیلک 3 صفر ساخت کارخانه سوپا به صورت سرتاسری ساده بخیه گردید و موضع عمل توسط بتادین ضدعفونی و از اسپری آنتی‌بیوتیک تتراسیکلین برای ضد­عفونی محل جراحی استفاده شد و موضع عمل پانسمان گردید. بعد از به هوش آمدن کامل، خرگوش­ها به قفس­های مخصوص خود انتقال داده شدند و در اختیارشان آب و غذا قرار گرفت. جهت جلوگیری از عفونت‌های احتمالی روزانه 60000 واحد پنی­سیلین G (شرکت داروسازی جابربن حیان) و 5 میلی­گرم جنتامایسین (شرکت داروسازی البرز دارو) به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت عضلانی به مدت 5 روز تزریق شد و 6 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن سلکوکسیب (سلکسیب، 100 میلی­گرم، شرکت کارخانجات داروپخش) به صورت خوراکی به مدت 5 روز خورانده شد.

ارزیابی هیستوپاتولوژی:

به منظور ارزیابی و مقایسه هیستوپاتولوژی ترمیم در محل نقیصه، در روز 46 بعد از جراحی، خرگوش­ها پس از ایجاد بیهوشی استنشاقی، با تزریق دز بالای تیوپنتال سدیم (20
میلی­گرم بر اساس کیلوگرم) به صورت داخل صفاقی آسان­کشی شدند. سپس برش در پوست ایجاد شده، فاسیا و عضلات از روی کالوس استخوانی کنار زده شد. استخوان فمور جدا و در محلول فرمالین بافر 10 درصد قرار داده شد، همچنین استخوان فمور سالم اندام حرکتی مقابل نیز جهت ارزیابی هیستومورفومتری به منظور تعیین مقادیر نرمال استخوان سالم هر مورد جدا گردید و در داخل محلول فرمالین بافر 10 درصد قرار داده شد. پس از پایدار شدن نمونه­ها، کلسیم زدایی از بافت استخوان توسط محلول اسیدنیتریک 10 درصد انجام گردید. از هر نمونه برش­های پی­درپی به ضخامت 5 میکرومتر از محل نقیصه استخوانی تهیه شد. مقاطع تهیه شده به روش هماتوکسیلین ـ ائوزین رنگ­آمیزی و با استفاده از میکروسکوپ نوری مدل نیکون (ECLIPSE E200, Japan) مورد مطالعه هیستوپاتولوژی قرار گرفتند.

ارزیابی هیستومورفومتری:

برای ارزیابی هیستومورفومتری توسط اندازه‌گیری خطی از طریق خطوط مشبک متقاطع و توسط یک عدسی چشمی مشبک، حاوی 100 خانه مربعی، با تعیین درصدی از نقیصه استخوانی که توسط 1) مغز استخوان، 2) استخوان نابالغ و 3) استخوان لاملار اشغال شده بود، صورت پذیرفت (3). اجزای بافتی مذکور با بزرگنمایی 40× و نشانگر ماوس، تعیین و مورد سنجش قرار گرفتند. مغز استخوان با سلول‌های چربی فراوان و بافت همبند با حضور تعداد فراوانی فیبروبلاست و رشته‌های کلاژن مشخص گردید. به منظور تعیین مقادیر نرمال استخوان لاملار، استخوان تیغه‌ای و مغز استخوان، قطعه استخوانی سالم اندام حرکتی مقابل نیز جدا و مورد ارزیابی هیستومورفومتری قرار گرفت. کلیه مراحل آزمایش (شامل تیمار، نمونه­برداری و پاتولوژی) به صورت دوسو کور انجام گردید.

ارزیابی آماری

با توجه به نتایج آزمون همگونی واریانس­ها و آزمون توزیع نرمال داد­ها (کولموگرواسمیرنوف) داده‌های به‌دست آمده کمّی، به صورت میانگین و انحراف استاندارد ارائه و اختلاف معنی‌دار بین گروه‌ها توسط آزمون آماری آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی (Tukey) و 05/0=α، در سطح معنی‌داری 05/0p< توسط بسته نرم‌افزاری SPSS ویرایش 18 برآورد گردید.

یافته­ها

    نتایج هیستوپاتولوژی:

ارزیابی نتایج هیستوپاتولوژی نقیصه ایجاد شده در قسمت میانی دیافیز استخوان فمور در گروه شاهد نشان­دهنده آن است که نقیصه توسط پل نازکی از استخوان مسدود شده است. استخوان متراکم اولیه که به تازگی تشکیل شده حفره مغز استخوان را مسدود نموده است. ارزیابی­های این گروه نشان می­دهد که استخوان نابالغ به همراه فضاهای وسیعی از مغز استخوان در بین آنها در محل نقیصه تشکیل شده است، بافت استخوان نابالغ تازه تشکیل شده توسط استئوبلاست­های فعال پوشانیده شده بود که حاکی از یک استخوان­سازی فعال می­باشد. این استئوبلاست­ها اولین استخوان لاملایی (تیغه استخوانی) را بر اسپیکول از قبل تشکیل شده (استخوان نابالغ) تشکیل می­دهند. در این موقع ترابکول حاوی مغزی از استخوان نابالغ بوده که توسط استخوان تیغه­ای احاطه شده است. عدم تولید کافی ماتریکس آلی استخوانی و کلسیفیکاسیون آن مانع از ایجاد تراکم در توده استخوانی تازه تشکیل و در نهایت تشکیل استخوان متراکم شده است (نگاره 1). نتایج به دست آمده از گروه پیوند استخوانی زنوگرافت در محل نقیصه استخوانی در قسمت میانی دیافیز فمور، لایه نسبتاً، ضخیمی از نسج گرانولاسیون نابالغ به همراه سلول­های التهابی اشغال شده است. حفره مرکزی استخوان نیز توسط نسج گرانولاسیون نابالغ پر شده است. الگوی استخوان­سازی در این گروه به این صورت است که استخوان تیغه­ای اولیه از کناره­های نقیصه شروع شده است به سمت مرکز توسط نسج گرانولاسیون ادامه یافته است. حضور استخوان دکلسیفیه شده زنوژن در محل نقیصه باعث فعال­تر شدن استئوکلاست­ها در محل نقیصه شده است و حضور فعال استئوکلاست­ها باعث بازجذب تیغه­های استخوانی تازه تشکیل نیز شده است و این امر مانع گسترش استخوان­های نوبنیاد گردیده است. نکته مهم در این گروه حضور فعال سلول­های التهابی در نسج گرانولاسیون می­باشد (نگاره­های 2 و 3). ارزیابی نتایج به­دست آمده از گروه گرانول کلسیم­فسفات نشان می­دهد که نقیصه ایجاد شده در قسمت میانی دیافیز استخوان فمور تقریبا توسط استخوان تازه تشکیل پر شده است. مشاهده مقدار زیادی استخوان تیغه­ای در منطقه ترمیم حاکی از یک روند بازسازی در آن می­باشد. مقدار استخوان نوبنیاد در این گروه نسبت به شاهد به طور قابل توجهی بیشتر می‌باشد. استخوان سازی فعال در این گروه به همراه کلسیفیکاسیون موجب تراکم در توده استخوانی تازه شده است. افزایش ریمودلینگ بافت استخوانی تازه تشکیل موجب تشکیل سیستم هاورس در این گروه شده است. همچنان فضاهای وسیع مغز استخوانی مابین بافت استخوانی مشاهده
می­شود. بررسی­های مقاطع نشان می­دهد که 45 روز پس از جراحی مقادیری از گرانول کلسیم فسفات همچنان دیده می­شود (نگاره 4).

 

نگاره 1- نمای ریزبینی از جایگاه ترمیم نقیصه تجربی ایجاد شده در قسمت میانی دیافیز استخوان فمور در یک خرگوش از گروه شاهد. در سمت راست تصویر، نوار باریکی از  استخوان متراکم اولیه تازه تشکیل، قسمت بیرونی نقیصه استخوانی را تا حدودی اشغال نموده و نقیصه و حفره مغز استخوان را مسدود نموده است. در سمت چپ تصویر اسپیکول‌های استخوان نابالغ تازه تشکیل با فضاهای خالی وسیع مابین آنها نقیصه را از یک سمت به مقدار قابل توجهی اشغال نموده است. عدم تولید کافی ماتریکس آلی استخوانی و کلسیفیکاسیون آن مانع از ایجاد تراکم در توده استخوانی تازه تشکیل و در نهایت تشکیل استخوان متراکم شده است (هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمایی 40×).

 

 

نگاره 2- نمای ریزبینی از جایگاه ترمیم نقیصه تجربی ایجاد شده در قسمت میانی دیافیز استخوان فمور در یک خرگوش از گروه پیوند استخوان دکلسیفیه زنوژن. قسمت بیرونی نقیصه توسط نسج گرانولاسیون نابالغ و مقداری از سلول­های التهابی پلی مورف نوکلوئر اشغال شده و قسمت عمقی نقیصه و قسمت اعظمی از حفره مرکزی استخوان فمور توسط نسج گرانولاسیون نسبتاً بالغ پر شده است. استخوان­سازی به صورت تشکیل استخوان تیغه‌ای اولیه از کناره­های نقیصه و لبه­های استخوان قدیمی در مجاور نسج گرانولاسیون رو به قسمت مرکزی حفره مرکزی استخوان فمور قابل مشاهده است. حضور استئوکلاست­های فراوان با جذب شدید تیغه­های استخوانی تازه تشکیل مانع از تشکیل و گسترش استخوان نوبنیاد در درون نسج گرانولاسیون گردیده است (هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمایی 40×).

 

 

 

 

 

نگاره 3- نمای ریزبینی با درشتنمایی بیشتر از جایگاه ترمیم نقیصه تجربی ایجاد شده در قسمت میانی دیافیز استخوان فمور در یک خرگوش از گروه پیوند استخوان دکلسیفیه زنوژن. سلول­های التهابی پلی­مورف نوکلوئر به مقدار فراوان در نسج گرانولاسیون قابل مشاهده بوده و بازجذب قطعه کوچکی از تیغه استخوانی تازه تشکیل توسط استئوکلاست‌های فعال مشاهده می­گردد (هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمایی  400×).

 

 

نگاره 4- نمای ریزبینی از جایگاه ترمیم نقیصه تجربی ایجاد شده در قسمت میانی دیافیز استخوان فمور در یک خرگوش از گروه پیوند گرانول کلسیم­فسفات. نقیصه استخوانی تقریباَ به‌ میزان قابل توجهی توسط استخوان تازه تشکیل پر شده است و مقدار استخوان نوبنیاد نسبت به شاهد بیشتر می‌باشد. استخوان تازه تشکیل به دلیل تشکیل فعال استیئوئید و کلسیفیکاسیون آن بسیار اسیدوفیلیک می­باشد. عدم پیوستگی و وجود شکاف بین سطوح مشترک استخوان تازه تشکیل و استخوان قدیمی برقرار می‌باشد. به هر حال، افزایش قابل توجهی در ریمودلینگ  بافت استخوانی تازه تشکیل و توسعه سیستم‌های هاورسی در این نمونه مشخص می‌باشد. فضاهای وسیع مغز استخوانی در برخی مناطق بافت استخوانی تازه تشکیل همچنان مشاهده می‌گردد. در حفره مرکزی استخوان فمور، توده­های سیمان استخوان بجا مانده که توسط بافت همبند پوشیده شده است، قابل مشاهده می‌باشد (هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگنمایی 40×).

نتایج هیستومورفومتری

بررسی هیستومورفومتری انجام شده نشان­دهنده آن است که استخوان لاملار شکل گرفته در گروه­های آزمایش دوم و سوم به­طور معنی­داری بیشتر از گروه شاهد می­باشد (000/0=p) و در مقایسه با مقادیر استخوان سالم به­طور معنی­داری کمتر می­باشد (000/0=p). بیشترین مقدار استخوان لاملار شکل­گرفته در بین گروه­های مورد مطالعه، در گروه آزمایش سوم یا گروه گرانول کلسیم فسفات می­باشد. مقدار استخوان نابالغ و مغز استخوان در گروه شاهد به­طور معنی­داری بیشتر از دو گروه­ دیگر می­باشد (000/0=p). در مقایسه دو به دو مابین گروه­های مورد مطالعه از لحاظ میزان تشکیل استخوان لاملار تفاوت معنی­داری بین گروه استخوان دکلسیفیه و گروه شاهد وجود دارد همچنین مابین گروه گرانول کلسیم فسفات و گروه شاهد نیز تفاوت معنی­دار می­باشد (000/0=p) و در مقایسه دو به دوی مابین دو گروه آزمایش، تفاوت معنی­داری بین گروه گرانول کلسیم فسفات و استخوان دکلسیفیه از لحاظ میزان تشکیل استخوان لاملار مشاهده می­شود (000/0=p). نتایج ارزیابی هیستومورفومتری ترمیم و مقایسه آن مابین گروه­های مورد آزمایش، در جدول 1 ارائه گردیده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1- مقایسه میانگین و انحراف استاندارد اجزای بافت استخوان جایگاه ترمیم بین گروه­های مورد مطالعه

	استخوان سالم	گروه اول (شاهد)	گروه دوم	گروه سوم
استخوان لاملار	a63/1±14/95	b21/2±13/17	c35/1±31/44	d43/2±63/57
استخوان نابالغ	a29/1±28/3	b21/1±23/41	c23/1±21/33	d34/1±24/28
مغز استخوان	a53/0±58/1	b53/2±64/41	c14/1±48/22	d24/1±13/14

a b c d: حروف غیر مشابه نشان­دهنده معنی­دار بودن اختلاف در هر ردیف می­باشد. مقادیر استخوان لاملار شکل گرفته در گروه­های آزمایش دوم و سوم بیشتر از گروه شاهد (000/0=p). تفاوت معنی­داری بین دو گروه پیوند استخوان دکلسیفیه زنوژن و گرانول کلسیم فسفات از لحاظ میزان تشکیل استخوان لاملار مشاهده می­شود (000/0=p).

 

بحث و نتیجه­گیری

    نتایج هیستوپاتولوژی به­دست آمده در این مطالعه نشان
می­دهد در گروه شاهد که نقیصه استخوانی به صورت حفره‌ای خالی بود به دلیل عدم حضور ماده‌ای که حالت تحریک کننده‌ رشد یا هدایت استخوانی را داشته باشد تبدیل بافت همبندی به استخوان و شکل‌گیری التیام از وسعت و شدت بالایی برخوردار نبود. با توجه به این الگوی التیامی در گروه شاهد بدین ترتیب است که مقدار زیادی لخته‌های فیبرینی و گلبول­های قرمز ناحیه نقیصه را پر می‌کنند و بدنبال آن عروق کناری و بافت فیبروزه به داخل آنها نفوذ می‌کند. تشکیل استخوان جدید همراه با تشکیل عروق جدید از اطراف شروع و با پیشرفت به سمت مرکز آن را پر می‌کنند. در پایان دوره مطالعه، گروه شاهد دارای مقدار زیادی بافت همبند در ناحیه نقیصه بود، در حالی­که مقدار بافت فیبروزه در گروه­های مورد آزمایش به مقدار کمتری بود و به جای مقادیر زیادی بافت مزانشیم تمایز نیافته جوش­خوردگی استخوان وجود داشت، و مقادیر مختلفی از استخوان دیده می‌شد که ناحیه نقیصه را پر کرده بود. با توجه به تحریک­آمیز بودن مواد بکار رفته در بافت استخوانی و تسریع واکنش بافتی چنانچه از نتایج هیستوپاتولوژی بر می­آید در گروه­ گرانول کلسیم فسفات، تیغه‌های استخوانی سازمان یافته و منظم­تر نسبت به گروه شاهد تشکیل شده بودند و در مقایسه با گروه شاهد نقیصه ایجاد شده با سلول‌های استخوانی جدید پر شده و این امر مانع از تشکیل بافت فیبروز در محل نقیصه گردیده بود. ارزیابی نتایج هیستومورفومتری نشان می‌دهد که قسمت اعظم نقیصه در گروه شاهد توسط استخوان نابالغ و بافت همبند پر شده است و استخوان نابالغ و بافت همبند بیشتر از گروه­های مورد آزمایش و استخوان سالم می­باشد و مقدار استخوان لاملار تشکیل شده در گروه شاهد نسبت به گروه گرانول کلسیم فسفات بسیار کم
می­باشد، این در حالی است که در گروه گرانول کلسیم فسفات، استخوان لاملار بیشتر از گروه استخوان دکلسیفیه می­باشد ولی از مقدار طبیعی آن در استخوان سالم کمتر می­باشد که نشان­دهنده یک استخوان­سازی فعال نسبت به گروه شاهد و گروه استخوان دکلسیفیه شده می­باشد. در ارزیابی هیستوپاتولوژی گروه گرانول کلسیم فسفات به جای مقادیر زیاد بافت مزانشیم تمایز نیافته، جوش‌خوردگی استخوان وجود داشت و مقادیر مختلفی از استخوان دیده می‌شود که ناحیه نقیصه را پر کرده و جایگزین پیوند استخوان شده بود. به­طوری­که اسپیکول‌های استخوانی نسبتاً نابالغ در حال تبدیل به استخوان منظم و لاملار گرانول کلسیم فسفات را احاطه کرده بود. اسپیکول‌های استخوانی از نوع استخوان نابالغ به مقدار زیاد و مقادیر کمتری از ترابکول‌های استخوانی نسبتاً بالغ و منظم و در حال تبدیل شدن به استخوان از نوع لاملار ناحیه نقیصه را پر کرده و جایگزین پیوند استخوان شده بود. به نظر می­رسد در گروه گرانول کلسیم فسفات بستری برای سلول‌های استئوژنیک ایجاد می­شود که این سلول‌ها به راحتی بتوانند در امتداد آن رشد نموده و به مرور به­طور مناسب کناره‌های نقیصه استخوانی را به همدیگر پیوند دهند. ارزیابی نتایج هیستوپاتولوژی و هیستومورفومتری به­دست آمده در این تحقیق نشان­دهندة آن است که گرانول کلسیم فسفات، باعث افزایش القای استخوانی و تسریع روند استخوان‌سازی در مقایسه با گروه­های شاهد و استخوان دکلسیفیه می‌شود.

در سال 2003 بررسی مقایسه‌ای انجام شده سولفات کلسیم حاوی استخوان دکلسیفیه شده با پیوند استخوان اسفنجی اتوژن صورت گرفت. در این مطالعه ضریب کشسانی و نیروی فشاری استخوان جدید در یک مدل کانین در سگ مورد بررسی قرار گرفت، نتایج این مطالعه نشان دهنده تاثیر مثبت استخوان دکلسیفیه شده در التیام استخوان می باشد (22). در سال 2004 نیز مطالعه‌ای در انیستیتوی تکنولوژی دانشگاه جورجیا انجام گرفت، در این مطالعه از اسیدهیالورونیک به عنوان ماده حامل جهت استخوان دکلسیفیه شده استفاده شد. منطق استفاده از این ماده حامل، حضور این ماده در ماتریکس خارج سلولی بود که ممکن است بر خاصیت استئواینداکتیوی استخوان دکلسیفیه حداقل اثر را داشته باشد. نتایج گزارش شده این بود که اگر اسیدهیالورنیک در دوز مناسب ترکیب شود، روی اثر استئواینداکتیوی استخوان دکلسیفیه حداقل اثر را خواهد داشت (20). در سال 1994، Becker و همکارانش به بررسی اثرات استئواینداکتیو استخوان دکلسیفیه پرداختند، از چهار بانک مختلف نسجی ماده پیوندی تهیه شد و در عضله خوکچه‌های هندی قرار گرفت، ماتریکس استخوان کورتیکال انسانی به عنوان کنترل منفی و پروتئین مرفوژنیک استخوانی به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. در نواحی که از استخوان دکلسیفیه استفاده شده بود، میانگین حضور استخوان غیر زنده 4/78 درصد تا 5/92 درصد بود. در گروه کنترل منفی تشکیل استخوان مشاهده نشد و در گروه مثبت 96 درصد استخوان جدید مشاهده شد. گزارش شده است ترکیبات کلسیم فسفات پس از کاشته شدن دچار تغییرات شیمیایی شده و چرخه تقسیم سلولی و نهایتاً تفکیک و تمایز و تکثیر سلول‌های استخوانی، بیان ژن‌ها، استئوژنز و سنتز فاکتورهای رشد را تقویت خواهند کرد (2). در حضور ذرات گرانول کلسیم فسفات، استئوژنز افزایش یافته و پاسخ ترمیمی استخوان القاء خواهد شد. به نظر می‌رسد گرانول کلسیم فسفات علاوه بر خاصیت هدایت رشد استخوان، دارای خاصیت القای استخوانی نیز هست، کلسیم فسفات، استخوان‌سازی را از طریق تحریک استئوبلاست‌ها و کمک به تفکیک و تمایز این سلول‌ها تحریک می‌نماید، به عبارت دیگر کلسیم فسفات ضمن تشکیل داربستی برای رشد استخوان، سبب تحریک پروژنیتورهای استئوژنیک، رشد، تقسیم و تفکیک و تمایز و در نتیجه تحریک فعالیت استخوان‌سازی خواهد شد (17). در مطالعه­ای که توسط Ignjatovic و همکاران در سال 2007 با پوشش کلسیم­فسفات دوفازی با استفاده از بیومواد Poly-D-, L- Lactide-co-Glycolide به عنوان جایگزین استخوان انجام شده است، نشان داده شده که کلسیم­فسفات و هیدروکسی آپاتیت نقش مهمی را در تجمع فیبروبلاست­ها و چسبندگی آنها به سطح این مواد داشته است که زمینه را در محل نقیصه استخوانی جهت بازسازی بافت استخوانی فراهم کرده است (9). در مطالعه­ای که توسط Daculsi و همکاران در سال 2006 انجام شده است از سرامیک کلسیم فسفات دوفازی به همراه پیوند زنوگرافت استخوان گاو در التیام استخوان موش صحرایی استفاده شده و نشان داده شده است که به دلیل افزایش تحریک موضعی و تجمع بیش از اندازه کلسیم در محل شکل­گیری استخوان جدید به دلیل وجود هیدروکسی­آپاتیت از کیفیت بهتری برخوردار بوده است (4). همچنین در مطالعه­ دیگری که توسط Motomiya و همکاران در سال 2007 روی مهره­های کمر 36 سر خرگوش انجام شده است، از هیدروکسی­آپاتیت با تخلخل 15، 50 و 85 درصد به همراه استخوان اتوژن استفاده شده، نشان داده شده است که میزان استخوان­سازی در گروه هیدروکسی­آپاتیت با تخلخل 85 درصد به طور معنی­داری بیشتر از دو گروه دیگر بوده است (15). در مطالعه بالینی که توسط Weissman و همکاران در سال 1996 انجام شده است از سیمان هیدروکسی­آپاتیت به منظور اصلاح نقیصه استخوانی در ناحیه فک 24 فرد بالغ استفاده شده است و در رادیوگراف­های تهیه شده نشان داده شده که سیمان هیدروکسی­آپاتیت به خوبی باعث تحریک استخوان سازی در ناحیه صورت گردیده است (24). همچنین در مطالعه رادیولوژی که توسط Menon و Varma  در سال 2005 انجام شده از گرانول­های متخلخل هیدروکسی­آپاتیت در شکستگی استخوان تیبیای 28 انسان استفاده شده است و در طی یک سال رادیوگراف­های متوالی از محل شکستگی تهیه شده و نتیجه­گیری شده است که گرانول متخلخل هیدروکسی‌آپاتیت یک بیومواد با کاربری آسان بوده که می­تواند باعث تحریک استخوان­سازی در محل شکستگی گردد (14). در مطالعه­ای که توسط Komaki و همکاران در سال 2006 انجام شده و به ارزیابی ترکیب بتا تری­کلسیم ­فسفات و فاکتور رشد فیبروبلاستی2 (Fibroblast growth factor-2) پرداخته است، نشان داده شده که سیمان بتا ­تری­کلسیم ­فسفات باعث افزایش استخوان‌سازی در نقیصه ایجاد شده در استخوان تیبیای خرگوش در طی 3 ماه شده است و با افزودن فاکتور رشد فیبروبلاستی2 در همین مدت باعث افزایش القای استخوانی و استخوان­سازی در گروه مورد مطالعه گردیده است (10). با توجه به تحریک آمیز بودن تری­کلسیم­فسفات در بافت استخوانی و تسریع واکنش بافتی، به نظر می‌رسد چنانچه ماده‌ای که خصوصیات القای استخوانی را نیز افزایش دهد به تری­کلسیم فسفات افزوده شود، می‌تواند به راحتی در نقایص استخوانی استفاده شود. Turner TM و همکاران در سال 2003 گزارش دادند که با استفاده از نوعی داربست به نام ProOsteon 200R که متخلخل می­باشد میزان رشد استخوان جدید به داخل این ماده کلسیم متخلخل به­طور چشمگیری بیشتر از واکنش موضعی سیمان به تنهایی بوده است و در عرض 8-6 هفته بخش اعظمی از سیمان به­دلیل نفوذ بافت میزبان جذب شده است (22). Hu و همکارانش با کشت ماتریکس ژلاتینی انسانی (hBMG) به صورت آلوگرافت در عضله چهار سر رانی موش، بعد از 4-3 هفته استخوان­سازی جدید و مغز استخوان را گزارش کرد (8). کشت استخوان در بافت عضلانی حیوان آزمایشگاهی رت (7) و حتی موش دیابتی نیز با وجود برهم خوردن متابولیسم مواد معدنی کاملاً مشهود بود (25).

مطالعه نتایج این تحقیق نشان می‌دهد که گرانول کلسیم فسفات با قدرت هدایت استخوانی و القای استخوانی می­تواند باعث افزایش روند التیام استخوان شود و استخوان دکلسیفیه شده نیز می­تواند باعث تحریک استخوانی شود ولی در مقایسه با گروه گرانول کلسیم فسفات از قدرت کمتری برخوردار است و به­دلیل پیوند زنوژن بودن آن به نظر می­رسد باعث تحریک واکنش­های التهابی نیز شده است.

مراجع

1. Apelt, D., Theiss, F., El-Warrak, A.O., Zlinszky, K., Bettschart-Wolfisberger, R. Bohner, M., Matter, S., Auer, J.A. and Von Rechenberg, B., (2004): In vivo behavior of three different injectable hydraulic calcium phosphate cements. Biomaterials, 25(7–8): 1439–1451.
2. Becker, W., Becker, B.E. and Caffesse, R., (1994) : A comparison of demineralized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone formation in human extraction sockets. J. Periodontol., 65(12): 1128-1133.
3. Carmagnola, D., Berglundh, T. and Lindhe, J., (2002): The effect of a fibrinزglue on the integration of Bio-Oss with bone tissue. A experimental study in labrador dogs. J. Clin. Periodontol, 29(5): 377-383.
4. Daculsi, G., Corre, P. and Malard, O., (2006): Performance for bone ingrowth of Biphasic calcium phosphate ceramic versus Bovine bone substitute. Key Engineering Materials, 309-311(Part 1-2): 1379-1382.
5. Ebraheim, NA. and  Elgafy, H., (2001): Bone-graft harvesting from iliac and fibular donor sites: techniques and complications. Journal of Am Acad Orthop Surg, 9: 210-218.
6. Ginebra, M.P., Boltong, M.G., Fernández, E., Planell, J.A. and Driessens, F.C.M., (1995): Effect of various additives and of the temperature on some properties of an apatitic calcium phosphate cement. J. Mater. Sci., Mater. Med, 6: 612–616.
7. Horisaka, Y., (1994): Histological changes of implanted collagen material during bone induction. J. Bio. Mat. Res., 28: 97-103.       
8. Hu, X., (1993): Experimental and clinical investigation of human insoluble bone matrix gelatin. Clin Orthop, 293: 360-365.
9. Ignjatovic, N., Nikov, P. and Ajdukovic, Z., (2007):  Biphasic calcium phosphate coated with poly-D,L-lactide-co-glycolide biomaterial as a bone substitute. Journal of the European Ceramic Society, 27: 1589-1594.
10. Komaki, H., Tanaka, T. and Chazono, M., (2006): Repair of segmental bone defects in rabbit tibiae using a complex of β-tricalcium phosphate, type I collagen, and fibroblast growth factor-2. Biomaterials, 27: 5118-5126.
11. Larsson, S. and Bauer, T.W., (2002): Use of injectable calcium phosphate cement for fracture fixation: a review. Clin. Orthop. Relat. Res, 395: 23–32.
12. Lekovic, V., Camargo, PM., Weinlaender, M., Vasilic, N. and Kenney, EB., (2002): Comparision of platelet-rich plasma, bovine porous bone mineral, and guided tissue regeneration versus platelet-rich plasma and bovine porous bone mineral in the treatment of intrabony defects: A re-eentry study. J Periodontol, 73(2): 198-205.
13. Mellonig, J.T., Masters, L.B., Brunsvold, M.A. and Nummikoski, P.V., (1996): A clinical evaluation of demineralized freeze-dried bone allograft in combination with tetracycline in the treatment of periodontal osseous defects. J. Periodontol, 67(8): 770-781.
14. Menon, K.V. and Varma, H.K., (2005): Radiological outcome of tibial plateau fractures treated with percutaneously introduced synthetic porous Hydroxyapatite granules. European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology, 15: 205-213.
15. Motomiya, M., Ito, M. and Takahata, M., (2007): Effect of Hydroxyapatite porous characteristics on healing outcomes in rabbit posterolateral spinal fusion model. European Spine Journal, 16: 2215–2224.
16. Mousavi,Gh. and Rezaie, A. (2011): Biomechanical Effects of Calcium Phosphate Bone Cement and Bone Matrix Gelatin Mixture on Healing of Bone Defect in Rabbits. World Applied Sciences Journal, 13(9): 2042-2046.
17. Mousavi, Gh., Sharifi, D., Mohajeri, D., Rezaie, A., Mortazavi, P., Soroori, S. and Hesaraki, S. (2010): Effect of Calcium Phosphate Bone Cement and Type I Collagen Mixture on Healing of Segmental Bone Defect in Rabbit Radius. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 4(10): 5144-5153.
18. Ooms, E.M., Wolke, J.G.C., van de Heuvel, M.T., Jeschke, B. and Jansen, J.A., (2003): Histological evaluation of the bone response to calcium phosphate cement implanted in cortical bone. Biomaterials, 24(6): 989–1000.
19. Schmitz, JP. and Hollinger, JO., (2001): The biology of platelet-rich plasma. J Oral Maxillofac Surg, 59(9): 1119-1121.
20. Schwartz, Z., Goldstein, M., Raviv, E., Hirsch, A., Ranly, D.M. and Boyan, B.D., (2006): Clinical evaluation of demineralized bone allograft in a hyaluronic acid carrier for sinus lift augmentation in humans: a computed tomography and histomorphometric study. Clin. Oral Impl. Res, 10.1111/j.1600-0501.2006.01303.x.
21. Tofighi, A., Mounic, S., Chakravarthy, P., Rey, C. and Lee, D., (2000): Setting reactions involved in injectable cements based on amorphous calcium phosphate. Key Eng. Mater, 192–195: 769–772.
22. Turner, T.M., Urban, R.M., Gitelis, S., Haggard, W.O. and Richelsoph, K., (2003): Resorption evalution of a large bolus of calcium sulfate in a canine medullary defect. Orthopedics, 26: 577-579.
23. Urist, M.R., Nilsson, O.S., Hudak, R. and Rasmusse, W., (1985): Immunologic evidence of bone morphogenic proteine in the milieu intereur. Ann. Biol. Clin., 43: 755-766.
24. Weissman, J.L., Snyderman, C.H. and Hirsch, B.E., (1996): Hydroxyapatite cement to repair skull base defects: radiologic appearance. American Journal of Neuroradiology, 17: 1569-1574.
25. Yamashita, K., (1993): Ultrastructure of calcified muscle fibers at the implantation site of dematerialized bone matrix gelatin. Int. J Exp. Path., 74(6): 547-552.