ارزیابی پتانسیل پروبیوتیکی انتروکوکسی جداسازی شده از محصولات لبنی سنتی منطقه مغان و مشگین شهر

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 10، دوره 6، 1 (21) بهار، خرداد 1391، صفحه 1505-1513   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

بهبود جعفری^{* 1}؛ علیرضا منادی²؛ علی رضایی³؛ سیامک علیزاده⁴؛ چنگیز احمدی زاده¹؛ ابوالفضل برزگری⁵؛ مهرداد پاشازاده¹؛ حامد جعفرزاده⁶

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اهر، گروه میکروبیولوژی، اهر، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، گروه میکروبیولوژی، تبریز ،ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، گروه علوم بالینی، تبریز، ایران

⁴دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اهر، باشگاه پژوهشگران جوان، اهر، ایران

⁵دانشگاه علوم پزشکی تبریز، گروه بیوتکنولوژی، تبریز، ایران

⁶دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشکده دامپزشکی، تبریز، ایران

چکیده

انتروکوکسی نقش مهمی در صنعت لبنیات دارد. همچنین بعضی از انتروکوکسی­ها با منشاء لبنیات به عنوان پروبیوتیک گزارش شده­اند. هدف از این تحقیق، جداسازی و شناسایی انتروکوکسی­ها از محصولات لبنی سنتی مناطق مشکین شهر و مغان (اردبیل) و بررسی پتانسیل پروبیوتیکی آنها می­باشد. در حضور بافر فسفات سالین ( pH برابر 5/2) 26 ایزوله مقاوم به اسید و در حضور نمک­های صفراوی، 10 ایزوله مقاوم، 7 ایزوله با تحمل بالا، 6 ایزوله با تحمل ضعیف و 3 ایزوله حساس شناسایی شد. شناسایی بیوشیمیایی تعلق ایزوله­ها به گونه­های انتروکوکس آویوم (E .avium)، انتروکوکس فاسیوم (E. faecium)، انتروکوکس دورانس (E. durans) و انتروکوکس فکالیس ( E. faecalis) را نشان داد. همچنین فعالیت آنتاگونیستی بررسی شده با روش چاهک­گذاری نشان داد که ایزوله­ها دارای قدرت مهارکنندگی علیه اشریشیا کولی، یرسینیا انتروکولیتیکا و لیستریا اینوکوا هستند. بررسی حساسیت به
آنتی­بیوتیک­های مختلف نشان داد که تمامی سویه­ها به ونکومایسین و کلرامفنیکل حساس بودند. همچنین همه آنها به سولفامتوکسازول مقاوم بودند. نتایج بیان می­کند که محصولات لبنی سنتی منبع مهمی برای ارگانیسم­هایی با خاصیت پروبیوتیکی می­باشند.

کلیدواژه‌ها

پروبیوتیک؛ انتروکوکسی؛ محصولات لبنی

اصل مقاله

مقدمه

 

     مصرف محصولات غذایی تخمیری از سال 1970 به طور عمده­ای افزایش یافته است. این محصولات غذایی شامل ماست، پنیر، شیر بطری و همچنین محصولات غذایی تخمیری از قبیل کفیر، کومیس، توگا و غیره  می­باشند. تخمیر توسط لاکتیک اسید باکتری­ها، قادر به کاهش pH به کمتر از 4 در محصولات غذایی است. این باکتری­ها به دلیل تاثیر در طعم، بو و تعویق فساد ماده غذایی، به طور سنتی در تخمیر غذاها استفاده می­شود. اثر حفاظتی باکتری­های اسید لاکتیک طی فرایند تولید و نگهداری بعدی غذاهای تخمیری عمدتاً به خاطر شرایط اسیدی است که این باکتری­ها از طریق تبدیل کربوهیدرات­ها به اسیدهای آلی (اسید لاکتیک و اسید استیک) در طول رشدشان در مواد غذایی ایجاد می­کنند (2). باکتری­های پروبیوتیک به عنوان مکمل­های غذایی زنده میکروبی تعریف می­شوند که به طور مفید با اصلاح تعادل میکروبی روده، میزبان را تحت تاثیر قرار می­دهند (9). پروبیوتیک­ها به عنوان مکمل­های رژیمی به صورت قرص، کپسول، خمیر و تیمارهای منجمد خشک شده به بازار عرضه می­شوند. جنس­های عمده اسید لاکتیک باکتری­ها که به عنوان پروبیوتیک مطرح هستند عبارتند از لاکتوکوکوس، انتروکوکوس، لوکونوستوک، پدیوکوکوس، لاکتوباسیلوس و استرپتوکوکوس (1 و 11). اخیراً مطالعات بالینی اثرات مفید پروبیوتیک­ها را از قبیل تحریک سیستم ایمنی، خاصیت ضد سرطانی، اصلاح عدم تحمل لاکتوز، پیشگیری از اسهال را بر روی انسان و حیوان نشان داده است. هم­چنین باکتری­های پروبیوتیک، با تولید باکتریوسین و اسیدهای آلی، رشد پاتوژن­ها را مهار می­کنند. فاکتورهای
عمده­ای در خاصیت بازدارندگی لاکتیک اسید باکتری­ها نقش دارند. مهمترین این فاکتورها تولید اسید لاکتیک و اسیداستیک و به دنبال آن کاهش pH و همچنین تولید باکتریوسین­ها می­باشد. اسیدیته یا قلیائیت یک محیط تاثیر زیادی بر ثبات و فعالیت مولکول­های بزرگی نظیر آنزیم­ها دارد، از این رو جای تعجب نیست که رشد و متابولیسم میکروارگانیسم­ها به وسیله pH تحت تاثیر قرار گیرد (1 و 11).

یکی از منابع مهم برای جداسازی باکتری­های پروبیوتیک محصولات لبنی تخمیری سنتی است. محصولات لبنی سنتی استان اردبیل سال­هاست که در بین افراد بومی منطقه مصرف می­شود و تاکنون گزارشی از اثرات زیانبار این محصولات بر سلامتی افراد ارائه نشده است. یکی از مهمترین فلور میکروبی این محصولات انتروکوکسی هست. همچنین برخی از سویه­های انتروکوکسی جداسازی شده از محصولات لبنی به عنوان پروبیوتیک مطرح شده است از طرفی دیگر بعضی از سویه­های انتروکوکسی با بیماری­های انسانی مرتبط بوده و به عنوان پاتوژن مطرح هست. در این تحقیق به بررسی پتانسیل پروبیوتیکی و شناسایی ایزوله­های جداسازی شده از نمونه­های لبنی سنتی (ماست، پنیر و کشک)  تهیه شده به روش­های خانگی (محلی) پرداخته شده است. تحمل اسیدیته بالا و مقاومت به نمک­های صفراوی، از جمله خصوصیات اولیه و ضروری است که در این تحقیق برای غربالگری سویه­های با پتانسیل پروبیوتیکی در نظر گرفته شد. شناسائی سویه­های غربال شده، با استفاده از
تست­های بیوشیمیائی و مورفولوژیکی گرفت. در پایان فعالیت ضد میکروبی ایزوله­های متفاوت از نظر بیوشیمیایی، بر روی 3 باکتری پاتوژن اشریشیاکولی (PTCC 1399)­، یرسینیا انتروکولیتیکا (ATCC 1159) و لیستریا اینوکوا (DSMZ20649) و همچنین حساسیت ایزوله ها به
آنتی­بیوتیک­های مهم بالینی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

    1- جمع آوری نمونه: نمونه­های مختلف محصولات لبنی از نقاط مختلف شهرستانهای مشکین شهر و مغان جمع آوری و در فالکون­های استریل و درون بسته­های یخی به آزمایشگاه منتقل گردید و در یخچال نگه­داری شدند.

2- جداسازی و غربال اولیه باکتری­ها: برای تهیه سوسپانسیون باکتریایی، از متد Callichia  و همکارانش استفاده شد. از محیط کشت MRS مایع به  منظور غنی­سازی و افزایش جمعیت باکتریایی اولیه، در شرایط کم هوازی و دمای 37 درجه سانتی­گراد استفاده شد (8). به منظور جداسازی ایزوله­های مقاوم به اسید از محیط معدنی (PBS) Phosphate-Buffered Saline  با  pH برابر 3 استفاده شد. این محیط معدنی براساس روش Erkkila  و Petaja تهیه شد (8). باکتری­های زنده مانده (مقاوم به اسید) در شرایط اسیدی تا ده برابر رقیق شدند و به صورت سطحی در محیط کشت MRS آگار کشت داده شدند. پلیت­ها به مدت 48 تا72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد و شرایط کم هوازی گرمخانه­گذاری شدند. از
پلیت­های دارای کلونی­های قابل شمارش، کلونی­های با مورفولوژی متفاوت جداسازی و با استفاده از میکروسکوپ، رنگ­آمیزی گرم و واکنش کاتالاز آنها بررسی شد. ایزوله­های  باکتریایی میله­ای شکل، گرم مثبت، کاتالاز منفی و مقاوم به اسید جداسازی و در گلیسرول نگه­داری شدند. ضمناً باکتری­های حساس به اسید از بین رفتند و از آزمایشات بعدی حذف شدند.

3- تعیین درصد بقاء ایزوله­های جداسازی شده در شرایط اسیدی معادل با شرایط اسیدی معده

برای تعیین درصد بقاء ایزوله­ها،  CFU(Colony forming unit) برای هر ایزوله به صورت جداگانه تعیین گردید. برای تعیین CFU به ازای هر میلی­لیتر در زمان صفر (لحظه تلقیح) و در انتهای ساعت 3، از کشت­های باکتریایی اولیه و تلقیح شده در محیط PBS به صورت سریالی تا 10 برابر رقت­سازی و برای هر رقت 2 کشت به صورت سطحی انجام گردیده و به صورت کم­هوازی و در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 72-48 ساعت گرمخانه­گذاری شدند. پلیت­های حاوی کلنی­های قابل شمارش و به طور معمول پلیت­های دارای 20 الی 200 کلنی­، برای شمارش انتخاب شدند.

تعداد باکتری به­ازای هر میلی­لیتر:

 

C = تعداد کل کلنی­های شمارش شده روی همه پلیت­ها

V= حجم تلقیحی به کار برده شده برای همه پلیت­ها

N1 = تعداد پلیت­های شمارش شده از پائین­ترین رقت

N2 = تعداد پلیت­های شمارش شده از بالاترین رقت

D = پائین­ترین رقتی که شمارش کلنی انجام گرفته است.

بدین ترتیب CFU برای همه ایزوله­های باکتریایی در زمان صفر (لحظه تلقیح)،  انتقال به محیط معدنی PBS و در پایان انکوباسیون 3 ساعته تعیین، در محیطMRS آگار محاسبه و مقایسه گردید (3).

4- تعیین مقاومت به نمک­های صفراوی برای ایزوله­های مقاوم به اسید: اجرای این مرحله با روش Gilliland و همکارانش انجام شد. محیط کشت MRS مایع به عنوان کنترل و MRS مایع دارای 3/0 درصد بایل (Oxgall) به عنوان کشت مورد آزمایش (تیمار) استفاده شد. رشد هر نیم ساعت یک بار با اندازه­گیری جذب نوری در طول موج 600 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه­گیری و منحنی جذب براساس زمان انکوباسیون رسم شد و اختلاف رشدی بر حسب دقیقه بیان و به عنوان تاخیر در رشد در نتیجه اثر بازدارندگی بایل (نمک های صفراوی) در نظر گرفته شد (3).

5- شناسایی فنوتیپی ایزوله های دارای پتانسیل پروبیوتیکی: شناسایی ایزوله‌های جداسازی شده در سطح گونه براساس مشخصات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی توصیه شده توسط برگی، اسنس و همکاران در سال 1986 و وود و هولزاپفل و همکاران در سال 1995 انجام گردید (12). دمای رشد، تحمل به نمک و pH و الگوی تخمیر کربوهیدرات‌ها (شامل 17قند) در محیط کشت MRS مایع، براساس روش‌های توصیف شده به وسیله Harrigan و McCance درسال 1976 تعیین شد. رشد در دمای 15 و 45 درجه سانتی‌گراد برای ایزوله‌های کوکسی شکل به صورت مشاهده‌ای بعد از انکوباسیون به مدت 24 الی 48 ساعت ارزیابی شد. تحمل نمک (5/6 درصد حجمی- وزنی کلریدسدیم درمحیط کشت MRS مایع) با انکوباسیون در دمای ایزولاسیون (37 درجه سانتی‌گراد) به مدت 72 ساعت، برای همه ایزوله‌ها تعیین گردید. الگوی تخمیر کربوهیدرات­ها برای همه ایزوله‌ها در محیط کشت MRS مایع دارای معرف فنل قرمز (05/0 گرم بر لیتر) تعیین گردید (4).

6- ارزیابی فعالیت آنتاگونیستی ایزوله­ها: بررسی خصوصیات آنتاگونیستی سویه­های ایزوله شده در شرایط آزمایشگاهی  علیه سه باکتری پاتوژن اشریشیاکولی (PTCC 1399)، یرسینیا انتروکولیتیکا (ATCC 1159) و لیستریا اینوکوا (DSMZ20649) به عنوان اندیکاتور با روش چاهک­گذاری صورت گرفت. در ابتدا عصاره انتروکوسی­ها تهیه گردید و سپس pH مایع رویی باNaOH 4 مولار در حد 7 تنظیم گردید (6). باکتری­های پاتوژن به محیط کشت Soft BHIagar (%7/. آگار) تلقیح و سریعاً در پلیت­ها پخش شدند. سپس روی محیط چاهک­هایی به قطر 5 میلی­متر ایجاد گردید. داخل هر چاهک 100 میکرولیتر از عصاره لاکتوباسیل­های مورد بررسی ریخته شد و قطر هاله شفاف اطراف چاهک­ها براساس میلی­متر اندازه­گیری شد (6).

7- بررسی حساسیت به آنتی­بیوتیک­های مختلف

مقاومت سویه­ها به­وسیله روش انتشار دیسک به آنتی­بیوتیک­های مهم بالینی از قبیل: کلرامفنیکل، آمپی­سیلین، سپیروفلوکساسین، تری­متوپریم، تتراسایکلین، اریترومایسین و ونکومایسین بررسی شد. بر اساس اندازه هاله بازدارندگی باکتری­های مورد مطالعه به گروه­های مقاوم، متوسط و حساس طبقه­بندی شدند.

یافته­ها

    1- جداسازی ایزوله­های مقاوم به اسید: یکی از مهم­ترین مشخصه باکتری­های پروبیوتیکی تحمل اسیدیته معده و قابلیت عبور از معده می­باشد. غربالگری در محیط معدنی  PBSبا  pH برابر 3 به مدت 5/2 ساعت منجر به جداسازی 26 ایزوله کوکسی شکل مقاوم به اسید به عنوان باکتری­های اسید لاکتیکی از 5 نمونه لبنی پنیر، ماست و کشک گردید.

 

 

 

جدول 1- منشا و تعداد ایزوله­های کوکسی شکل جداسازی شده

تعداد ایزوله­های کوکسی شکل	نوع محصول لبنی
6 6 2 6 6	A (کشک مغان)  B(کشک مشکین) C (پنیرسنتی مشکین)  D (پنیر سنتی مغان) E (ماست مغان)

2- بررسی مقاومت ایزوله ها به اسید: ایزوله­های جداسازی شده در مرحله غربال­سازی، به منظور تعیین درصد بقاء در محیط اسیدی به طور جداگانه در محیط معدنی PBS با pH برابر 5/2 به مدت 3 ساعت انکوبه گردیدند که درصد بقاء ایزوله­ها در نمودار شماره 1 آورده شده است. بر اساس درصد بقاء، ایزوله­ها به سه گروه تقسیم بندی شدند. 5 ایزوله کوکسی شکل با درصد بقاء بین 30 تا 50 درصد و 12 ایزوله در صد بقاء بین 50 تا 75 درصد و 9 ایزوله در صد بقاء بین 75 تا100درصد را نشان دادند. همچنین همه ایزوله‌ها  درصد بقاء بالای 30 درصد را نشان دادند. ایزوله‌های جداسازی شده از نمونه کشک مغان همگی درصد بقاء خوبی (بالای 50 درصد) را نشان دادند. ایزوله‌های جداسازی شده از پنیر سنتی مغان همگی درصد بقاء بسیار خوبی (بالای 75 درصد) را نشان دادند. در نمودار شماره 1 اختلاف درصد بقاء 26 ایزوله‌ جداسازی شده در محیط معدنیPBS  با pH برابر 5/2 به مدت 3 ساعت نشان داد شده است.

 

سویه­ها

 

 

 

 

نمودار 1 -  درصد بقاء ایزوله­ها در محیط اسیدی  PBSبا  pHبرابر 5/2

 

 3- تعیین تحمل به نمک­های صفراوی: ایزوله­هایی که درصد بقاء بهتری را در محیط اسیدی نشان دادند میزان تحمل­شان به نمک­های صفراوی بررسی شد. به غیر از ایزوله A6-E1-D6 که یک تاخیر رشد یک ساعته را نشان داد. بقیه ایزوله­ها همگی تاخیر رشد کمتر از یک ساعت را نشان دادند. نتایج بدست آمده بر اساس پیشنهاد ارائه شده توسط چاتئو و همکارانش در سال 1994، که چهار گروه متمایز را براساس تاخیر رشد ایجاد شده به وسیله نمک­های صفراوی تشخیص داده بودند، تحلیل شد. این چهار گروه عبارتند از: (جدول 2)

A:  شامل ایزوله­های مقاوم ()

B: شامل ایزوله­هایی با تحمل بالا ( )

:C شامل ایزوله­های با تحمل ضعیف ()

D: شامل ایزوله­های حساس ()

 

 

 

جدول 2- دسته‌بندی باکتری‌های ایزوله شده بر اساس مقاومت به نمک‌های صفراوی (Bile oxgall)

تأخیر رشد بر حسب دقیقه	1 d <15	2 40	3 60<d< 40	4 d <60
A5-B6-C5-D1-D2-D4-D5-E7-A1-B7	+
B1-B2-B4-B5-C6-D3-E3		+
A2-A3-A4-E2-E4-E6			+
A6-D6-E1				+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4- شناسایی فتوتیپی باکتری­های انتخاب شده: شناسایی مقدماتی ایزوله­ها در سطح گونه براساس الگوی تخمیر کربوهیدرات­ها و رشد در دماهای 15 و 45 درجه سانتی­گراد در محیط کشت MRS مایع، رشد در غلظت بالای نمک (5/6 درصد) و تولید گاز از تخمیر قند گلوکز تعیین شد. قندهای مورد استفاده در این تحقیق شامل: سوکروز، سوربیتول، لاکتوز، گالاکتوز، ترهالوز، فروکتوز، آرابینوز، رامنوز، سالیسین، گلوکز، اینوزیتول، مالتوز، مانوز، مانیتول، گزیلوز، رافینوز و سلوبیوز بودند. با تحلیل این نتایج، 26 ایزوله‌ انتروکوکسی در 4 گروه مختلف شامل ایزوله­های (A3, B1, B2, A4, A5, B5) در درون گونه انتروکوکوس فکالیس ( E. faecalis) ایزوله­های (A1, A2, B4) در گونه انتروکوکوس آویوم (E.avium) ایزوله­های (, C5, D1, D6, C6, D2, D4,D5, D7, E1, E2, E3,B7, E4, E6, E7) در گونه انتروکوکوس فاسیوم (E.faecium) ایزوله­های (A6, B6) در گونه انتروکوکوس دورانس (E. durans)  قرار گرفتند. بعد از شناسایی مقدماتی، نتایج با استفاده از نرم افزار آماری NTsyspc و روش Jacard تحلیل شد که در نمودار 2 آورده شده است.

 

 

نمودار 2- دندوگرام مربوط به تحلیل آماری، (بااستفاده ازنرم افزارآماری NTsys pc و روش Jacard) نتایج حاصل از تست‌های بیوشیمیایی انجام شده برای 26 ایزوله‌ انتروکوکسی جداسازی شده در مطالعه               

 

 

5-  ارزیابی فعالیت آنتاگونیستی  انتروکوکسی­های ایزوله شده متفاوت از نظر بیوشیمیایی

ایزوله­های متفاوت از نظر بیوشیمیایی، برای بررسی فعالیت ضد میکروبی مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج مربوط به اثر بازدارندگی ایزوله­های مختلف انتروکوکسی با اندازه­گیری قطر هاله­های عدم رشد در جدول 3 آورده شده است. تقریباً همه ایزوله­ها در حالت طبیعی (مایع رویی خنثی نشده) یک اثر بازدارندگی روی همه پاتوژن­ها داشتند که احتمالاً این اثر مربوط به تولید اسید لاکتیک و یا به دلیل وجود پراکسید هیدروژن
می­باشد. ولی در حالتی که pH مایع رویی ایزوله­های متفاوت در حد خنثی تنظیم گردید این اثر بازدارندگی محدود شد. از بین ایزوله­ها، ایزوله A1 و ایزوله B6 که بر اساس تست­های بیوشیمیایی به عنوان انتروکوکوس آویوم و انتروکوکوس دورانس شناخته شده بودند، تقریباً هم در حالت خنثی شده و هم در حالت خنثی نشده اثر بازدارندگی یکسانی بر روی پاتوژن­های مختلف نشان دادند. بنابراین به نظر می­رسد که این اثر مربوط به تولید مواد ضد میکروبی در این باکتری­ها باشد.

جدول 3-  اندازه قطر هاله­های عدم رشد (برحسب میلی­متر) مربوط به فعالیت آنتاگونیستی برخی از ایزوله­ها

مایع رویی با pH خنثی شده (pH=6.5)
Listeria Innocua DSMZ 20649	Yersinia Entercolitica ATCC 1159	E.coli PTCC  1399	Listeria innocua DSMZ20649	Yersinia Entercoliticaa ATCC 1159	E.coli PTCC 1399
+	+	+	+	_	_	E. faecium (E6)
+	+	+	+	_	­+	E. avium (A1)
+	+	+	_	_	_	E. faecalis (A3)
+	+	+	_	+	+	E. durans (B6)
+	+	+	+	­_	_	E. faecium (E1)

 

 

6- بررسی حساسیت به آنتی بیوتیک­های مختلف

نتایج نشان دادند که تمامی سویه­ها به ونکومایسین و کلرامفنیکل حساس بودند. همچنین همه آنها به سولفامتوکسازول مقاوم بودند. 4 سویه (E1, E6, A2, A5) به تتراسایکلین حساس و یک سویه متعلق به انتروکوکسی فاشیوم (B7) و یک سویه متعلق به انتروکوکسی فکالیس (A5) به تتراسایکلین مقاوم بود. همچنین تمامی سویه­ها به آنتی بیوتیک­های اریترومایسین و آمپی­سیلین مقاومت (متوسط) نسبی نشان دادند.

بحث و نتیجه­گیری

   رفتارهای فیزیولوژیکی برای حفظ بقاء باکتری­های موجود در دستگاه گوارش، شامل مقاومت به شرایط اسیدی معده و
نمک­های صفراوی می­باشد. در مورد شرایط فیزیولوژیکی باکتری­های پروبیوتیک در حین عبور از شرایط اسیدی معده مثل فعالیت متابولیکی و تولید ATPدانسته­های کمی وجود دارد، اما چیزی که به وضوح ثابت شده، این است که مقاومت به شرایط اسیدی معده در بین سویه­های مختلف یک گونه متفاوت است (5). روش غربالگری استفاده شده در این تحقیق به ما اجازه داد که 26 سویه مقاوم به اسید به طور مستقیم از 5 نمونه محصول لبنی سنتی، بدون جداسازی مقدماتی و وقت­گیر همه باکتری­های  فلور پر جمعیت آنها، جداسازی کنیم. در این مطالعه برای جداسازی باکتری­های مقاوم به اسید، از محیط معدنی PBS با pH برابر با 3 به مدت 5/2 ساعت استفاده شد که بسیاری از باکتری­های حساس به اسید از بین رفتند. کانوی، گورپاچ و گولدین در سال 1987 و پارک و همکارانش در سال 2002 از محیط PBS با pH تغییر یافته برای این منظور استفاده کردند (7). در سال 1987 کانوی و همکارانش نشان دادند که بقاء لاکتوباسیلی در محیط PBS نسبت به محتوی معدی، به خاطر اثر حفاظتی ترکیبات موجود در محتوی معدی بر روی
سلول­های باکتریایی، اندکی پائین­تر است. در مطالعه­ای که پناچیا و همکارانش در سال 2004 بر روی لاکتوباسیل­های سوسیس انجام دادند، سویه­هایی که بالاتر از 80 درصد بقاء را در PBS با pH برابر 5/2 به مدت 3 ساعت نشان داد، برای مطالعات بیشتر و بررسی خصوصیات پروبیوتیکی انتخاب کرد (8). با در نظر گرفتن همه موارد گفته شده، باید اشاره کرد که از بین سویه­های انتخاب شده در این تحقیق، 22 سویه درصد بقاء بالاتر از 50 درصد را نشان دادند و انتخاب این سویه­ها برای مطالعات بیشتر با مطالعات قبلی مطابقت داشت.

کیسه صفرا یک نقش اساسی در مکانیسم دفاعی اختصاصی و غیر اختصاصی روده بازی می­کند و بزرگی اثر بازدارندگی آن به وسیله غلظت نمک­های صفراوی تعیین می­شود (10). باور بر این است که در دستگاه گوارشی انسان میانگین غلظت نمک­های صفراوی 3/0 درصد وزنی/ حجمی است و برای غربال سویه­های مقاوم به صفرا، بحرانی و کافی تلقی می­شود (10). این غلظت در این مطالعه برای ارزیابی قابلیت رشد 26 سویه انتخاب شده در حضور نمک­های صفراوی انتخاب گردید.  به غیر از ایزوله A6-E1-D6 که تاخیر رشدی یک ساعته داشت، بقیه سویه ها با سطوح مختلفی از مقاومت قادر به رشد در محیط کشت دارای 3/0 درصد نمک­های صفراوی بودند. در مطالعه­ای که در سال 1994 توسط چاتئو، دسچامس، و هادج ساسسی انجام شد، تاثیر نمک­های صفراوی بر روی رشد 38 سویه لاکتیک اسید باکتری استفاده شده به عنوان پروبیوتیک مورد آزمایش قرار گرفت. نیمی از سویه­های مورد آزمایش به آرامی تحت تاثیر نمک­های صفراوی 3/0 درصد قرار گرفتند و تاخیر  رشد زیر یک ساعت را تا رسیدن به یک جذب نوری 3/0 در طول موج 600 نانومتر در محیط کشت MRS مایع در مقایسه با کشت کنترل بدون نمک های صفراوی به نمایش گذاشتند (3). شناسایی ایزوله­های مذکور براساس روش فنوتیپی انجام گردید و در بعضی موارد الگوی بیوشیمیایی و فیزیولوژی مبهمی برای بعضی ایزوله ها حاصل شد که نیاز به شناسایی مولکولی را نشان می­دهد. همه ایزوله­ها از 5 نوع محصول لبنی متفاوت شامل پنیرسنتی، ماست و کشک شهرستان های مشگین شهر و مغان (اردبیل) جداسازی گردید. علی­رغم وجود
نمونه­های لبنی متفاوت، در برخی موارد همگی ایزوله­ها الگوی بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی یکسانی را نشان دادند. بیشترین فعالیت بازدارندگی زمانی مشاهده شد که pH مایع­های روئی طبیعی بودند، اما در بعضی موارد مایع­های روئی با pH خنثی فعالیت بازدارندگی بیشتری نشان دادند. لیستریا اینوکوا
حساس­ترین باکتری مورد آزمایش بود. نتایج نشان داد که علاوه بر اسیدهای آلی مواد ضد میکروبی دیگری بر علیه باکتری­های شناساگر مورد آزمایش در این مطالعه وجود دارند. همچنین، از آنجائی که سویه­های یک گونه طیف بازدارندگی متفاوتی نشان دادند، طیف ضد میکروبی وابسته به سویه بود. میزان مقاومت به اسید و صفرا، همچنین خاصیت ضد میکروبی و حساسیت به آنتی­بیوتیک­های مختلف در بین  ایزوله­های جداسازی شده در این  تحقیق از تفاوت و تنوع بالایی برخوردار بود.

بر اساس یافته­های این بررسی نتیجه‌گیری می‌شود که محصولات لبنی مختلف مناطق مذکور، منابع با ارزشی جهت جداسازی باکتری­های پروبیوتیک هستند. ایزوله‌های جداسازی شده از نمونه‌ی پنیر سنتی و کشک مقاومت بهتری نسبت به شرایط اسیدی و نمک صفراوی نشان دادند و اثر آنتاگونیستی خیلی خوبی بر روی باکتری­های پاتوژن تست شده داشتند که احتمالاًً مربوط به تولید باکتریوسین می­باشد ولی بررسی‌های بیشتر در این زمینه مورد نیاز است. روش استفاده شده در این تحقیق، به منظور جداسازی باکتری­های مقاوم به اسید (استفاده از محیط معدنی PBS با  pH برابر 3) با توجه به بار میکروبی بالا در محصولات لبنی سنتی، می‌تواند روش مناسبی برای جداسازی و شناسایی باکتری­های با پتانسیل پروبیوتیکی باشد و نیاز برای جداسازی مقدماتی و زمان بر جمعیت باکتریایی اولیه را برطرف می‌سازد.

 

مراجع

1. مرتضوی، س.ع. و صادقی ماهونک، ع.ر.1382. میکروبیولوژی غذایی. (ترجمه)، تالیف: ادمز،ام.ار. انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد، صفحات: 326-325.
2. Acharya, M.R.and Shah, R.K.  2002. Selection of human isolates of Bifidobacteria for their use as probiotics, Jour. App  Biochern. Biotechnol. 102-103:81-98.
3. Chateau, N., Deschamps, A. M.andHadjSassi, A.1994.Heterogeneityof bile salts resistance in the Lactobacillus isolates of aprobiotic consortium, Jour. Letters in Applied Microbiology. 18: 42–44.
4. Harrigan, W.F.andMcCance M.E.1966.Laboratory Methods in Microbiology, (Fourth Edition), Pub.Academic Press. New York.
5. Ipak, G., Vijay, K.andJuneja, M. A.2006.Probiotics in Food Safety and Human Health, Jour. CRC Press, Taylor & Francis Group.
6. Lalitha, M.K.2007.Manual on Antimicrobial Susceptibility Testing,Pub.Retrived January 3.
7. Park, Y.S., Lee, J.Y., Kim, Y.S.and Shin, D.H. 2002. Isolation andcharacterization of lactic acid bacteria from feces of newborn baby and from dongchimi, Jour.Agricultural andFood Chemistry. 50: 2531–2536.
8. Pennacchia, C., Ercoloni,D., Blaiotta, G., Pepe, O., Mauriello,G,.and Villani F.2004.Selection of Lactobacillus strains fromfermented sausages for their potential use as probiotics. MeatScience, Barking. 67:309-317.
9. Salminen, S.1996.Uniqueness of probiotic strains, Jour. IDF Nutr News Lett. 5: 16–8.
10. Sperti, G. S.1971.Probiotics, Pub. West Point, CT: Avi Co. 69: 105-107.
11. Tamime, A.Y. 2002, Fermentedmilks:a historical food with modern applications-areview, Jour. European Clinical Nutrition, 56(Supplement 4), S2-S15.
12. Wood, B. J. B.andHolzapfel, W. H.1995. The genera of lactic acid bacteria, 1st ed. Blackie Academic and Professional, Jour. Glasgow, United Kingdom.