تعداد نشریات | 418 |
تعداد شمارهها | 9,983 |
تعداد مقالات | 83,453 |
تعداد مشاهده مقاله | 76,452,141 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 53,580,443 |
بررسی ژنتیکی مقاومت به آمانتادین در ویروس آنفلوانزای H9N2 پرندگان در ایران بین سال های 1377 تا 1388 | ||
آسیبشناسی درمانگاهی دامپزشکی | ||
مقاله 5، دوره 5، 4 (20) زمستان، اسفند 1390، صفحه 1387-1395 اصل مقاله (3.99 M) | ||
نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی | ||
چکیده | ||
در سال 1377 یک اپیدمی از آنفلوانزای پرندگان در ایران شیوع پیدا نمود که عامل بسیاری از تلفات در مرغداریهای ایران گشت. تحقیقات بهعمل آمده نشان داد که عامل پیدایش این همهگیری، ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 میباشد. به جهت درمان و پیشگیری عفونتهای ناشی از ویروسهای آنفلوانزای A در جهان، داروهای ضد آنفلوانزای آمانتادین و ریمانتادین (آدامانتانها) مورد استفاده قرار میگرفتند که با افزایش مقاومت ویروس آنفلوانزا در برابر این داروها در سالهای اخیر استفاده از آنها محدود گردیده است. در یک بررسی مقایسهای بین سالهای 1377 تا 1388 در ایران، به جهت ارزیابی مقاومت به آمانتادین در ویروسهای آنفلوانزای A پرندگان تحت تیپ H9N2 تحقیقات خود را بر ساختار ژنتیکی ویروس، جائیکه آمانتادین بیشترین اثر خودرا روی کانال پروتئینی M2برجای میگذارد، معطوف نمودیم. دو گروه ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 مشتمل بر پنج نمونه ویروس مورد بررسی، مربوط به دو دوره زمانی (1385-1377 و 1388-1386) در تخم مرغ جنیندار جداسازی شدند، سپس تحت آزمایشات واکنشهای زنجیرهای پلیمراز به روش نسـخه بـرداری معکوس (RT-PCR) و الکتروفورز بر روی ژل آگاروز قرارگرفته و جهت تعیین توالی فرستاده شدند. تحلیل توالی ژنی پروتئین ماتریکس M2 نشان میداد که در قسمتهای مجزا ازاین توالی، تعویض اسیدهای آمینه نسبت به توالی مورد توافق رخ داده است و کلیه جدایههای مقاوم، جهشهای نقطهای سرین به آسپارژین (S31N) را که در جایگاه 31 منجر به مقاومت به آمانتادین میشود، در برداشتند. در بررسی که جهت تعیین آگاهی از تاثیرپذیری ویروسهای آنفلوانزای پرندگان به آمانتادین صورت گرفت مقاومت به آمانتادین در ویروسهای آنفلوانزای پرندگان تحت تیپ H9N2 در ایران در سالهای 1386 تا 1388 گزارش شد. از این رو توصیه میگردد جهت درمان و پیشگیری عفونتهای ناشی از ویروسهای آنفلوانزای پرندگان تحت تیپ H9N2 در مزارع، مصرف خودسرانه آمانتادین صورت نپذیرد. همچنین به نظر میرسد آزمایشات عملی تأثیرپذیری دارو در شرایط درون تنی نیز، میتواند متضمن استعمال مؤثر آن دارو گردد. | ||
کلیدواژهها | ||
تحت تیپ H9N2؛ پروتئین ماتریکس M2؛ مقاومت به آمانتادین؛ ویروسهای آنفلوانزای پرندگان | ||
اصل مقاله | ||
مقدمه
آنفلوانزا یکی از شایعتـرین و مهمترین عفـونتهای ویروسی میباشد. آنفـلوانزای A، باعث اپیـدمی و حتی پاندمیهای شدید بیماریهای حاد تنفسی کشنده میباشد که سالیانه باعث مرگ و میر و تلفات انسانی و حیوانی[1] میگردد (3 و 20). در آخرین پاندمی که بهواسطه ویروس آنفلوانزای خوکی H1N1 در دنیا بوقوع پیوست، به نقل از مرکز جهانی کنترل دارو و پیشگیری [2] از 61 میلیون بیمار در سال2010-2009 در جهان، 470/12 نفر جان باختند (6). ویروسهای آنفلوانزا جزء خانواده ارتومیکسو ویروسها[3] هستند که دارای 5 جنس به نامهای آنفلوانزای C ,B ,A ، توگوتویروس[4] و آیزاویروس[5] میباشند (13 و 20). ویریونهای آنفلوانزا ، چند شکلی بوده و بهصورت لولهای یا کروی دیده میشوند. پوشش خارجی[6] ایـن ویروس دارای دو گلیکوپروتئین سطحی، هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) بوده و درون آن، پروتئینهای ماتریکس(M1) و غشائی (M2) قراردارند. ژنوم ویروسهای آنفلوانزای Aو B از 8 قطعه متفاوت و مارپیچی نوکلئوکپسید تشکیل شده است که هرکدام از آنها، دارای RNA با سنس منفی، نوکلئوپروتئین و ترانس کریپتاز میباشند (3). پروتئین M2، یک پروتئین تترامری سراسری غشاء میباشد، که یک کانال یونی را در سمت پوششی ویروس آنفلوانزا ایجاد میکند. کانال، خود یک هوموتترامر متشکل از چهار واحد کاملاً همسان (M2) میباشد. زیر واحدهای مارپیچ بهوسیله دو باند دیسولفید بههم متصل شده و بهوسیله pH پائین ( pHاسیدی) فعال میگردند. مشخص شده است که پروتئین M2 یک کانال یونی تنظیم کننده اسیدیته است و نقش بزرگی در انتقال و جریان یافتن پروتن از اندوزوم اسیدی بدرون ویروس، جهت تفکیک پروتئین ماتریکس M1 از ریبونوکلئوپروتئین(RNP) دارا میباشد. به بیان دیگر پروسه پوشش برداری[7] را ایجاد نموده و انتشار را افزایش میدهد (16 و 18). پروتئین M2 از سه زیر واحد پروتئینی شامل: انتهای [8]N و در معرض با محیط خارج، ناحیه تراغشائی[9] که آبگریز داروهای پایۀ آدامانتان، آمانتادین و ریمانتادین، که هدفی برای کانال M2 میباشند، بهعنوان اولین انتخاب داروهای ضد ویروسی بر علیه شیوع جمعی ویروسهای آنفلوانزای A برای سالهای متمادی مورد استفاده قرار میگرفتند، اما اخیراً مقاومت به آدامانتانها گسترش یافته است (8، 10 و 18). آمانتادین همانندسازی ویروسهای آنفلوانزای A را بهوسیله ممانعت از پوشش برداری ویروس، در درون سلول مانع میشود. همانند ریمانتادین، یک مهارکننده کانال یونیM2 میباشد، که کانال یون تشکیل شده بهوسیله پروتئین ماتریکسM2 را سد میکند (11). جهشهای مشخصی که در مقاومت به آمانتادین در ژن M2 نقش دارند، جهشهایی را شامل میشوند که در جایگاههای اسید آمینه L26F، V27A، A30T، S31N، G34E وL38F ایجاد میگردند (1 و 18). اگر چه ویروسهای آنفلوانزای پرندگان، معمولاً انسان را آلوده نمیکند، موارد نادری از آلودگی انسان با ویروس آنفلوانزای پرندگان گزارش شده است. اغلب عفونتهای انسانی که با ویروس آنفلوانزای مرغی رخ داده است پس از تماس مستقیم با پرندگان آلوده صورت گرفته است. از نوامبر سال 2003 ، حدود 400 مورد عفونت انسانی با آنفلوانزای پرندگان توسط بیش از دوازده کشور در آسیا، آفریقا، اقیانوس آرام، اروپا و شرق نزدیک منتشر شده است. سازمان بهداشت جهانی[12]، اغلب موارد انسانی ابتلا به ویروس آنفلوانزای پرندگان را نتیجه تماس مستقیم با پرندگان بیمار یا مرده آلوده گزارش مینماید (4). مطالعات انجام شده نشان میدهند که برخی از داروهای ضدویروسی که برای ویروس آنفلوانزای انسانی تأیید شدهاند در درمان عفونت آنفلوانزای پرندگان در انسانها نیز کارآمدند. با این حال، ویروسهای آنفلوانزا میتوانند به این داروها مقاوم باشند، بنابراین این داروها ممکن است همیشه مؤثر واقع نشوند. مطالعات بیشتر برای نشان دادن تأثیر این داروها مورد نیاز میباشد که در هنگام شناسایی عامل بیماری آنفلوآنزای پرندگان، جهت درمان ویروسها باید مورد تست حساسیت به داروهای ضد ویروس آنفلوانزا قرار گیرند (5). جلوگیری از مقاومت داروئی و همچنین ممانعت از تشکیل تیپهای جدید مقاوم به دارو در ویروسهای آنفلوانزای نوع A پرندگان در سطح مراکز بهداشتی درمانی و طبعاً گسترش و شیوع آن در جامعه از عواملی بود که ما را بر انجام این تحقیق معطوف نمود. از ضرورتهای خاص انجام این تحقیق، با مشخص شدن مقاومت یک ویروس آنفلوانزا به یک دارو، این است که بایستی از مصرف و استعمال آن خودداری گردد، بدین جهت که اکثر تحت تیپهای آنفلوانزا مشترک بین انسان و حیوان در سال 1377 در ایران آنفلوانزای پرندگان شیوع پیدا نمود که لطمات اقتصادی بالائی به صنعت مرغداری کشور وارد آورد، در جداسازیهای صورت گرفته، عامل موثر، زیر گونه با بیماریزائی اندک H9N2 شناخته شد. در طول دوره زمانی 1998-1994، زیر گونه H9N2 در دیگر نقاط جهان نیز بهطور قابل توجهی شیوع پیدا نمود (14، 15 و 17). در این بررسی سعی شد تا توالیهای اسید آمینه و نوکلئوتیدی پروتئین ماتریکس M2 از ویروسهای جدا شده در دو دوره زمانی (1385-1377و 1388-1386) پنج تحت تیپ H9N2 در ایران از نظر حساسیت و یا مقاومت به داروی ضد ویروس آمانتادین مورد بررسی قـرار گیرند.
مواد و روشها نمونههای ویروسی: 5 نمونه ویروس از بخش علوم درمانگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، با مشخصات آورده شده در (جدول 1) اخذ گردید. نمونهها مربوط به گلههای گوشتی مرغداریهای استان تهران و حومه بودند که در طی سالهای 1377 تا 1388 جداسازی گردیدند. جداسازی ویروس: دو گروه ویروس آنفلوانزای پرندگان با تحت تیپ H9N2 مشتمل بر پنج نمونه ویروس مورد بررسی، مربوط به دو دوره زمانی (1385-1377و 1388-1386) در تخم مرغ جنین دار جداسازی شدند. نمونههای دوره زمانی اول (1385-1377) که به صورت ذخیره[13] در بانک ویروس بخش علوم درمانگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران در 70- درجه سلسیوس نگهداری شده بودند، جهت تعیین تیتر ویروس مورد آزمایش هماگلوتیناسیون[14] قرارگرفتند. نمونههای دوره زمانی دوم (1388-1386) نیز که از بافت نای و ریه گلههای گوشتی مرغداریهای استان تهران و حومه تهیه و آماده سازی شده بودند، در کیسه آلانتوئیک تخم مرغ جنین دار 10 روزه تلقیح گردیدند. از تخم مرغهای تلقیح شده نیز، آزمایش HA و تعیین تیتر ویروس، صورت گرفته شد. سپس نمونههای با تیتر آنتی ژنی مناسب جهت انجام بررسیهای مولکولی بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. استخراج RT-PCR ,RNA : RNA ویروسهای جدا شده از مایع آلانتوئیک بهوسیله کیت High Pure Viral Nucleic Acid Kit ( Rocheآلمان) با (Cat. No. 11 858 874 001) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شدند و واکنش زنجیرهای پلیمراز به روش نسـخه بـرداری معکوس[15] از روی RNA ویروسی با استفاده از پرایمرهای طراحی شده توالی یابی و آنالیز دادهها (Sequencing): محـصول PCR نیـز پس از انجام آزمایش الکتروفورز بر روی ژل آگاروز 1%، بهوسیـله کیت Agarose Gel DNA Extraction Kit ( Rocheآلمان) با (Cat. No. 11 696 505 001) مطابق دستور العمل شرکت سازنده مورد پالایش قرارگرفت و نمونهها جهت تعیین توالی ژن به روش خوانش توالی دو طرفه (Comfort Read Sequencing) بـهMWG آلمان ارسال گردید. نتایج توالیها با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیک MEGA4 و CLC Sequence Viewer 6 مورد ارزیابی قرار گرفتند. توالیهای بهدست آمده در بانک ژن (GeneBank) توسط برنامه BankIt ثبت گردیدند و شماره دستـرسی بـه آنها اختـصاص یافت که در (جدول2) آمده است. یافتهها محصول PCR قطعات مورد نظر پس از رانش بر روی ژل آگاروز 1%، مورد بررسی اولیه قرا گرفتند. طول قطعات pb 1027 بودند. بر روی ژل پنج نمونه ویروسی کار شده با خط کش ژنی Lader 1000pb Fermentse نشان داده شده است (نگاره 1). در این فرایند باند غیر اختصاصی دیده نشد که گویای بهینه نمودن مناسب واکنش زنجیرهای پلی مراز میباشد. بررسی پروتئین ماتریکس M2: همانطور که در (نگاره 2) و مقایسه کروماتوگرام جدایهها در (نگاره 3) نشان داده شده است، از نظر تبدیل نوکلئوتیدی مشخص میشود که یک جهش بحث و نتیجهگیری Yavarian و همکاران در دو بررسی (2010-2009) در ایران مقاومت به آمانتادین و ریمانتادین در سویه H3N2 در دو دوره 2007-2005 و 2008-2005 مورد بررسی قرار دادند. از 14 نمونه مورد بررسی، 10 نمونه از نوع جهش نقطهای در موقعیت 31 با تعویض اسید آمینه سرین به آسپارژین بود. در بررسی دوم نیز یاوریان و همکاران با جمعآوری نمونههائی از نقاط مختلف ایران مقاومت به آمانتادین از نوع تعویض اسیدآمینه S31N را اذعان نمودند (21 و 22).Bai و همکاران (2009) در تایلند مقاومت به آمانتادین را بین سالهای 2006 تا 2008 مورد بررسی قراردادند. از 66 نمونه مورد بررسی، 44 نمونه مربوط به تحت تیپ H1N1 و 22 نمونه مربوط به H3N2، از بانکوک و 11 استان دیگر بود که از این میان 22% ویروسها در سال 2006 مقاومت به آمانتادین را با تعویض S31N نشان میدادند (2). در همان سال Huang و همکاران (2009) نیز از 17 جدایه H9N2 مورد بررسی، بین سالهای 2008-1998 در شمال چین با جداسازی مولکولی صورت گرفته، مقاومت به آمانتادین با تعویض S31N را گزارش نمودند (12). یک سال بعد Suzuki و همکاران (2010) در ژاپن با بررسی دو سویه H1N1 و H3N2 در سال 2008-2007 دریافتند که 62% از تحت تیپ H1N1 و 100% موارد تحت تیپ H3N2 با مدل S31N به آمانتادین مقاومت نشان میدهند (19). تاکنون 670 توالی بر اساس پروتئین ماتریکسM2 از تحت تیپ H9N2 در دنیا تا سال 1389 در بانک ژن ثبت گردیده است. از 670 جدایه ثبت شده در بانک جهانی، تنها 73 جدایه (%84/10)، مقاوم به آمانتادین میباشند که از این میان 5 جدایه (%6/84) از کل جدایههای مقاوم از نوع جهش با تعویض اسید آمینه A30T بوده و 22 مورد (%30/13) از تعویض نوع V27A و 46 جدایه (%63/10) از نوع جهش با تعویض اسید آمینه S31N که بیشترین آمار را نشان میدهد بودند. با بررسی نتایج بهدست آمده از ماحصل تحقیقات منتشر شده از ایران و سایر نقاط جهان و بررسی درصد جهشهای جدایههای مقاوم به آمانتادین بهدست آمده از بانک ژن، میتوان اینگونه نتیجهگیری نمود که تعویض اسید آمینه سرین به آسپارژین در موقعیت 31 بیشترین و اصلی ترین عامل ایجاد کننده مقاومت به آمانتادین در ویروسهای آنفلوانزای A در تحت تیپ H9N2 و سایر تحت تیپها باشد. لذا با بررسیهای انجام شده در این مطالعه، به نظر میرسد که ویروسهای آنفلوانزای A تحت تیپ H9N2 در سال 1386 و 1388 از نظر ژنتیکی در مقایسه با ویروس فوق با همان تحت تیپ در سالهای1377، 1378 و 1385 با تعویض زیـر واحد آمینواسیدی در موقعیت S31N در ژنـوم پروتئین ماتریکس M2، مقاومت به آمـانتـادین را عـرضه مینمایـند. بر اساس برنامه CLUSTAL W کل جدایههای ثبت شده از ایران، بر اساس شاخص توالی اسید آمینه پروتئین ماتریکس M2 مورد بررسی میزان شباهت و تفاوت قرار گرفتند: در بین جدایههای مورد بررسی در این مطالعه با جدایههای ایران، بیشترین شباهت بین جدایههای AS123 و AS130 (100 درصد) وجود داشت. همچنین کمترین تفاوت نیز بین جدایه AS120 با جدایه AS133 (94 درصد) وجود داشت. با توجه به نتایج بهدست آمده میتوان بیان نمود که ویروسهای ایران از سال 1386 به بعد دچار تغییراتی گشتهاند که باید بهدنبال علت این تغییرات بود، که نیازمند بررسیهای بیوانفورماتیکی بیشتر میباشد. در این بررسی سعی شد تا توالیهای ژن M2 از ویروسهای جدا شده در دو دوره زمانی (1385-1377و 1388-1386) در ایران مورد ارزیابی قـرار گیرند. در یک بررسی مقایسهای، پنج تحت تیپ H9N2 در ایـران مورد ارزیابی واقـع شدند و اطلاعات آنها در GeneBank ثبت گردیدند. آمینو اسیـدها در پروتئین ماتریکس M2 در نـاحیه تراغشائی، در جدایههای سالهای 1377، 1378 و 1385 تعویض را نشان نمیدادند. در حـالیکه، در درگیری صورت گرفته در سالهای 1386 و 1388 تعـویض تک آمینو اسید اتفاق افتاده بود. با مقایسۀ آمینو اسیـدها در جـایگاه 31 مشاهده گردید که، اسید آمینه سرین (S) که در تـوالی مورد توافق در اپیدمیهای پیشین قرار داشت، در
جدول 1- ویروسهای آنفلوانزای تحت تیپ H9N2 جداشده از جوجههای گوشتی استان تهران در طی سالهای 1377 تا 1388.
جدول2- شماره دسترسی ویروسهای تحت تیپ H9N2 جداسازی شده در این مطالعه پس از ثبت در بانک ژن (NCBI)
نگاره 1- محصول PCR پنج جدایه ویروسی تحت تیپ H9N2 جداشده از جوجههای گوشتی استان تهران در طی سالهای 1377 تا 1388. (طول قطعه bp 1027) ردیف 1:جدایه AS130، ردیف 2:جدایه AS120، ردیف 3:جدایه AS123، ردیف 4:جدایه AS133، ردیف 5:جدایه AS110، ردیف 6: خط کش ژنی (Lader 1000pb Fermentse ).
نگاره 2- تغییر در توالی پروتئین ماتریکس M2 جدایههای آنفلوانزای تحت تیپ H9N2 جداسازی شده از جوجههای گوشتی استان تهران درطی سالهای 1377، 1378، 1385، 1386 و 1388 با استفاده از نرم افزار CLC Sequence Viewer 6. A: تغییر در توالی اسید آمینه پروتئین ماتریکس M2، B: تغییر توالی نوکلئوتیدی در پروتئین ماتریکس M2
نگاره 3- کروماتوگرام جدایههای آنفلوانزای A تحت تیپ H9N2 جداسازی شده در این مطالعه از نظر تغییر نوکلئوتیدی در توالی پروتئین ماتریکس M2
[1] - Enzootic [2] -Centers for Disease Control and Prevention (CDC) [3] - Orthomyxoviridae [4] - Togoto virus [5] - Isavirus [6] - Envelope [7] - Uncoating [9] - TransMembrane )TM) [11] -(Nuclear Magnetic Resonance (NMR [12]-World Health Organization (WHO) [13] - Stock [14] -Haemagglutination Assay (HA) [15] - Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) | ||
مراجع | ||
| ||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 5,475 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 574 |