ارزیابی اثر افزودن سطوح مختلف اسیدهای چرب 3n- به رقیق کننده بایوکسل بر قابلیت انجماد اسپرم بز

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 7، دوره 4، 4 (16) زمستان، اسفند 1389، صفحه 1013-1017   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

مهدی انصاری^* ؛ آرمین توحیدی؛ محمد مرادی شهر بابک

گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج، ایران

چکیده

هدف از این مطالعه، ارزیابی اثر افزودن سطوح مختلف اسیدهای چرب 3n- به رقیق کننده بایوکسل بر قابلیت انجماد اسپرم بز بود. 6 رأس بز بالغ مهابادی  برای جمع­آوری اسپرم انتخاب شده و اسپرم­گیری به­وسیله مهبل مصنوعی انجام گرفت. پس از ارزیابی شاخص­های کیفی، اسپرم­ها مخلوط و به 4 گروه مساوی تقسیم شد. گروه­های تیماری شامل سطوح 0، 1/0، 1 و 10 نانوگرم در میلی­لیتر اسید چرب بودند. فراسنجه­های تحرک و تحرک پیشرونده، زنده­مانی و درصد اسپرم­های ناهنجار ارزیابی شده و نرخ بازیافت اسپرم محاسبه شد. داده­ها به وسیله Proc GLM  نرم افزار SAS مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که میانگین درصد تحرک و نرخ بازیافت گروه ng/ml 10 به صورت معنی­داری بالاتر از گروه 0، 1/0 و 1 نانوگرم در میلی­لیتر بود. درصد تحرک پیشرونده در گروه­های 10 و 1/0 نانوگرم در میلی­لیتر به طور معنی­داری بالاتر از صفر و 1 نانوگرم در میلی­لیتر بود. درصد زنده­مانی در سطح 1 نانوگرم در میلی­لیتر به صورت معنی­داری پایین­تر از سطوح دیگر بود. درصد اسپرم­های ناهنجار بین سطوح مختلف اسید چرب تفاوت معنی­داری نداشت. نتایج نشان داد که افزودن سطح 10 نانوگرم در میلی­لیتر اسیدچرب قابلیت انجماد اسپرم بز را بهبود می­بخشد. 

کلیدواژه‌ها

اسیدهای چرب 3n-؛ قابلیت انجماد؛ منی؛ بایوکسل

اصل مقاله

    یکی از فناوری­های مهم جهت حفظ و نگه­داری ذخایر ژنتیکی، انجماد اسپرم است. اسپرم­های منجمد، جهت تلقیح مصنوعی باید از کیفیت لازم جهت تلقیح مصنوعی برخوردار باشند. بنابراین فرایند انجماد اسپرم فناوری دقیق و ماهرانه­ای است که طی چند دهه اخیر برای بهبود آن فعالیت­های عمده­ای صورت گرفته است، اما کماکان میزان بازیافت اسپرم پس از انجماد رضایت بخش نبوده و باید بهبود یابد. مهم­ترین مزیت فرایند انجماد، جلوگیری از کاهش توان زنده­مانی اسپرم­ها در طی یک دوره زمانی طولانی مدت می­باشد. اهمیت فرایند انجماد اسپرم به عنوان فرایندی که مانع از آسیب رساندن به سلول اسپرم و همچنین کاهش تنش­های ناشی از تغییرات سلولی می‏باشد، واضح است. اسپرم در منی رقیق نشده، برای زمان کوتاهی زنده می­ماند و سرد کردن آهسته منی تا دمای 5 درجه سانتی­گراد سبب مرگ بسیاری از اسپرم­ها می­شود. بنابراین، مایع رقیق کننده، افزون بر این که باید برای رقیق کردن مناسب باشد، لازم است که اسپرم­ها را در خلال سرد شدن حفظ کند و دوره زنده­مانی آن­ها را افزایش دهد.

در اغلب گونه­های پستانداران بخش اعظم اسیدهای چرب غشای اسپرم، اسیدهای چرب بلند زنجیر غیراشباع است که بیشتر شامل سری­های 3-n می­باشند. در بیشتر پستانداران از جمله نشخوارکنندگان اسید دوکوزاهگزاانوئیک (Docosahexaenic acid ،C22:6 n-3)، اسیدچرب غالب فسفولیپیدهای غشای اسپرم است، به طوری که بالغ بر 60 درصد از کل اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه را تشکیل می­دهد (5). به طور کلی در ترکیب اسیدهای چرب پرندگان اهلی، وجود مقدار زیادی اسیدهای چرب 6n- به اثبات رسیده است، در حالی که در پستانداران اهلی مقدار زیادی اسیدهای چرب غیر اشباع 3n- وجود دارد. شواهد نشان دهنده این مطلب است که کاهش در مقدار اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه (Polyunsaturated fatty acid) باعث کاهش در تعداد، تحرک و قابلیت انجماد اسپرم­ها در بسیاری از گونه­های اهلی پستانداران می­شود (8).

Connor و همکاران (1998)، با تجزیه اسید چرب قسمت سر و دم اسپرماتوزوئید نشان دادند که اسید دوکوزاهگزاانوئیک به ترتیب 1/1 و 6/19 درصد مجموع اسید­های چرب سر و دم اسپرماتوزوئید را تشکیل می­دهد (6). از آنجا که چربی­ها نقش مهمی در تمامیت، سیالیت، ثبات و نفوذپذیری غشا دارند، آنها این فرضیه را ارائه نمودند که ممکن است تراکم انتخابی اسید دوکوزاهگزاانوئیک با داشتن پیوندهای دوگانه بیشتر در دم اسپرم برای افزایش سیالیت غشاء، که لازمه خمش و انعطاف دم است، مورد نیاز باشد. این خمش و انعطاف برای تحرک اسپرم لازم است.

Perez-pe و همکاران (2001)، نشان دادند که مصرف اسید لینولئیک در جیره، مانع از پدیده شوک سرمایی و بهبود سیالیت غشاء می­شود و قابلیت زنده ماندن اسپرماتوزوئید را بالا می­برد (10). بهبود سیالیت غشاء به نوبه خود سبب پاسخ­دهی بهتر اسپرم به گنادوتروپین­ها می­شود. Amorim و همکاران (2008)، اثرات اضافه کردن کلسترول، ویتامین A، روغن کبد ماهی کاد و روغن بزرک را بر بقاء اسپرم گاو نر پس از انجماد مورد بررسی قرار دادند. افزودن کلسترول به نمونه­های اسپرم قبل از فرایند انجماد موجب افزایش زنده­مانی اسپرم پس از فرایند انجماد-ذوب شد (3). در مطالعه­ای که توسط Badr و همکاران (2004) انجام گرفت، اضافه کردن اسیدهای چرب غیراشباع و کلسترول به محیط رقیق کننده انجمادپذیری و قدرت باروری اسپرم قوچ در شرایط برون تنی را بهبود بخشید (4). بر خلاف آن، استفاده از زرده تخم­مرغ غنی از امگا-3 در رقیق­کننده اسپرم خوک نتوانست انجمادپذیری آن را بهبود بخشد (9). با توجه به در دسترس نبودن اطلاعات کافی در مورد بز، هدف از این مطالعه، بررسی اثر افزودن سطوح مختلف منبع اسیدهای چرب 3n- به رقیق­کننده تجاری بایوکسل بر قابلیت انجماد اسپرم بز مهابادی بود.

مواد و روش­ها

   آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی در 5 تکرار انجام گرفت. جمع­آوری منی پس از عادت دادن بزها، به وسیله مهبل مصنوعی صورت گرفت. بلافاصله پس از جمع­آوری منی نمونه­ها در داخل بن ماری با دمای 32 درجه سانتی­گراد قرار گرفته و به آزمایشگاه منتقل شدند. در آزمایشگاه پس از ارزیابی اولیه و داشتن استانداردهای مناسب انجماد (تحرک بالاتر از 70%)، نمونه­های منی با هم مخلوط شده و به 4 گروه مساوی تقسیم شدند. از بایوکسل (Bioxcell^®, Aigle, IMV,  France) به عنوان رقیق کننده پایه استفاده گردید. گروه­های تیماری شامل سطوح 0، 1/0 ، 1 و 10 نانوگرم در هر میلی­لیتر اسیدچرب3n- (Viva PharmaceuticalInc, Canada) بود. منی رقیق­شده به مدت 3 ساعت تا دمای 5-4 درجه سانتی­گراد سرد شد. نمونه­ها در داخل پایت­ها (5/0 میلی­لیتری و 10⁶× 100 اسپرم در هر پایت) ریخته شده و در رک قرار داده شد. با استفاده از جعبه پلی استیرن رک­های محتوی نمونه، در معرض بخار نیتروژن مایع در ارتفاع 4 سانتی­متری بالای نیتروژن مایع به مدت 8 دقیقه قرار گرفته و سپس در نیتروژن مایع غوطه ورشدند (11).

اندازه­گیری فراسنجه­های منی

الف) تحرک اسپرم

نمونه­ای از منی تازه در سرم فیزیولوژیک (نمک طعام 9/0 درصد) به نسبت 1 به 100 رقیق شد. لام و لامل از قبل روی صفحه گرم در دمای 37 درجه سانتی­گراد گرم شده و 20 میکرولیتر از نمونه رقیق شده منی روی لام تمیزی قرار داده شد. جهت تعیین تحرک اسپرم در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100 مورد بررسی قرار می­گرفت. حداقل 10 میدان میکروسکوپی برای تخمین صحیحی از درصد تحرک، مورد مشاهده و بررسی قرار گرفت. تخمین درصد سلول­های متحرک، بر اساس تجربه از روی میدان­های مشاهده شده صورت می­گیرد. این کار در دمای 37 درجه و همچنین پس از ذوب تکرار شد.

ب) حرکت پیشرونده اسپرم

جهت تعیین درصد اسپرم­های با تحرک پیشرونده در نمونه منی تازه و نمونه ذوب شده از روش چشمی و با استفاده از میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 200 استفاده گردید. حداقل 10 میدان میکروسکوپی برای تخمین صحیحی از درصد تحرک پیشرونده اسپرم، مورد مشاهده و بررسی قرار گرفت.

ج) اسپرم­های ناهنجار

قطره کوچکی از محلول 9/2 درصد سیترات سدیم روی یک لام گرم قرار داده شد. یک پایت خالی به سطح نمونه منی نزدیک شد تا مقداری اسپرم به آن بچسبد و سپس انتهای این پایت به درون محلول سیترات سدیم روی لام فرو برده شد تا اسپرم و سیترات سدیم به خوبی مخلوط شوند. به کمک یک لام دیگر، مخلوط اسپرم و سیترات سدیم به صورت یک لایه بسیار نازک روی لام اول پخش شد. پس از آن لام­ها از یکدیگر جدا شده و لام اول روی صفحه گرم قرار داده و خشک شد. با شمارش 100 اسپرم در هر لام و به کمک میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 400، درصد اسپرم­های ناهنجار تعیین شد. حداقل 10 میدان میکروسکوپی برای تخمین صحیحی از درصد
اسپرم­های ناهنجار، مورد مشاهده و بررسی قرار گرفت.

د) تعیین درصد اسپرم زنده و مرده

جهت اندازه­گیری درصد اسپرم زنده و مرده در نمونه منی تازه و نمونه ذوب شده از رنگ ائوزین- نیگروزین تجاری برای رنگ­آمیزی اسپرم­ها استفاده شد. قطره کوچکی از رنگ روی یک لام گرم قرار داده شد. یک پایت خالی به سطح نمونه منی نزدیک شد تا مقداری اسپرم به آن بچسبد و سپس انتهای این پایت به درون رنگ روی لام فرو برده شد تا اسپرم و رنگ به خوبی مخلوط شوند. به کمک یک لام دیگر گستره بسیار نازکی از نمونه منی تهیه شده و لام به سرعت خشک گردید تا
اسپرم­های زنده در اثر رنگ از بین نرفته و رنگ­آمیزی نشوند. برای خشک شدن سریع، لام روی صفحه گرم با دمای 60 درجه سانتی­گراد گذاشته می­شود. درصد اسپرم­های زنده و مرده در حداقل 10 میدان از لام و با شمردن حداقل 333  اسپرم تعیین شد. اسپرم­هایی که سر آن­ها اندکی رنگ گرفته بود نیز جزء اسپرم­های مرده در نظر گرفته شدند.

ه) تعیین میزان بازیافت  اسپرم پس از انجماد:

برای تعیین درصد بازیافت اسپرم پس از انجماد از فرمول زیر استفاده شد (7):

 

 

 

 

 

یافته­ها، بحث و نتیجه‌گیری

    بین سطوح مختلف اسیدهای چرب امگا-3، در میانگین درصد اسپرم‏های جنبا، درصد اسپرم‏های با تحرک پیشرونده، درصد اسپرم‏های مرده و زنده پس از انجماد، گروه دریافت کننده 10 نانوگرم در میلی­لیتر در مقایسه با سایر گروها به طور معنی­داری  بیشتر بود. احتمالاً اضافه کردن اسیدهای چرب 3n- به رقیق کننده اسپرم و افزایش محتوای اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه ((PUFA و اسید دوکوزاهگزاانوئیک DHA)) غشا اسپرم، باعث افزایش قابلیت انعطاف و سیالیت غشا شده و در نتیجه اثر نامطلوب انجماد بر زنده­مانی و ظاهر ناهنجار را کاهش می­دهد. برای توجیه افزایش تحرک و کاهش زنده­مانی اسپرم در اثر استفاده از اسیدهای چرب 3n- می­توان اظهار داشت که با افزایش اسیدهای چرب غیر اشباع در غشای پلاسمایی پوشش دهنده سر و دم اسپرم و بهبود سیالیت و قابلیت فشردگی غشا، بالابردن توانایی سازگاری غشای پلاسمایی با حرکات فلاژلوم اسپرم، اثرگذاری در تأمین انرژی و برخی مواد و مشتقاتی که در تسهیل و افزایش تحرک اسپرم دخالت دارند، اعمال می­گردد. اثرات مثبت اسیدهای چرب 3n- بر خصوصیات اسپرم، می­تواند به علت افزایش دادن سیالیت و قابلیت فشردگی به غشای اسپرم و افزایش انعطاف پذیری دم آن باشد این انعطاف پذیری باعث افزایش قدرت تحمل انجماد و ممانعت از پاره شدن و مرگ سلولی در اثر تشکیل کریستال­های یخ در طی انجماد می­شود. این آزمایش نشان داد که بین سطوح مختلف اسیدهای چرب امگا-3 از لحاظ توانائی حفظ کیفیت اسپرم در طی مراحل انجماد اختلاف وجود دارد. نصیری و همکاران (1387) نشان دادند که استفاده از منبع اسیدهای چرب امگا-3 در محیط
نگه­دارنده، ویژگی­های برون­تنی منی را پس از انجماد-ذوب بهبود می­بخشد (2). از طرفی تغذیه منبع اسیدهای چرب 3 n- نیز کیفیت منی و انجمادپذیری آن را در گاو بهبود داده است (1). در مجموع چنین استنباط می­شود که اسیدهای چرب 3 n- در حفاظت از اسپرم در طی مراحل انجماد-ذوب مؤثر بوده و مصرف آن چه به صورت برون تنی یا درون تنی، قابلیت انجماد اسپرم را در گونه­های نشخوارکنندگان از جمله بز بهبود خواهد داد.

 

جدول 1- میانگین درصد فراسنجه­های کیفی اسپرم در سطوح مختلف اسید چرب پس از انجماد

 

نرخ بازیافت (74/1SEM=)	ناهنجاری (18/0SEM=)	زنده مانی (29/0SEM=)	تحرک پیش رونده (68/0SEM=)	تحرک منی (79/0SEM=)	فراسنجه کیفی منی تیمار
a 5/35	62/4	a 02/62	a 44/39	a 61/48	10 (ng/ml)
bc 56/26	64/4	b 01/60	b 94/36	b 27/45	1 (ng/ml)
b 63/29	16/5	a 57/61	ab 77/37	b 11/46	1/0 (ng/ml)
c 44/23	85/4	a 45/61	b 83/35	b 88/43	0(ng/ml)

 

         abc: در هر ستون، میانگین­هایی که حروف مشترک ندارند، اختلاف معنی­دار (05/0p<) دارند.

مراجع

1. خوشوقت، ع. 1387. اثر تغذیه منبع اسیدهای چرب 3-n بر خصوصیات کمی و کیفی و ترکیب اسیدهای چرب اسپرم و میل جنسی در گاو هلشتاین. پایان نامه کارشناسی ارشد فیزیولوژی دام. گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران.
2. نصیری، ا. ح. 1387. اثر افزودن منبع اسیدهای چرب 3 n- و ویتامین E به رقیق کننده بر قابلیت انجماد اسپرم گاو هلشتاین. پایان نامه کارشناسی ارشد فیزیولوژی دام. گروه علوم دامی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران.
3. Amorim, E.A.M, Graham, J., Spizziri, B., Meyers, M., Amorim, L.S. and Torres, C.A.A. 2008. The effect of Adding Cholestrol, Vitamin A, Cod liver or Flax Oil Loaded Cyclodextrin on Bull Sperm Cryosurvival. 16th Congress on Animal Reproduction, Hungary, p: 29.
4. Badr, M.R., Abdel-Malak, M.G. and Shaker, M. H. 2004. Influence of some fatty acids and cholesterol addition to semen extender on freezability and in vitro fertilizing potential of ram spermatozoa. Assiut Vet. Med. J. 50: 304-318.
5. Castellini, S., Lattaioli, P., DalBosco, A., Minelli, A. and Mugnai. C. 2002. Oxidative status and semen characteristics of rabbit buck as affected by dietary vitamin E, C and n-3 fatty acid. Reprod. Nutr. Develop. 43: 91–103.
6. Connor, W.E., Lin, D.S., Wolf, D.P. and Alexander, M. 1998. Uneven distribution of desmosterol and docosahexaenoic acid in the heads and tails of monkey sperm. Journal of Lipid Research, 39: 1404-141.
7. Hafez, B. and Hafez, E.S.E. 2000. Reproduction of farm animals. P123-158, seventh edition. Lippincott Williams and Wilkins, Phyladelphia.
8. Kelso, K.A., Cerolini, S., Noble, R.C., Sparks, N.H.C. and Speake. B.K. 1996. Lipid and antioxidant changes in semen of broiler fowl from 25 to 60 weeks of age. Reprod. Fert. 106: 201-206.
9. Maldjian A., Pizzi, F., Gliozzi, T., Cerolini, S., Penny, P. and Noble, R. (2005): Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen. Theriogenology, 63: 411-421.
10. Perez-Pe, R., Cebrian-Perez, J.A. and Muino-Blanco, T. 2001. Semen plasma proteins prevent cold shock membrane damage to ram spermatozoa. Theriogenology, 56: 425-434.
11. Purdy P.H. 2006. A review on goat sperm cryopreservation. Small Ruminant Res. 63: 215–225.