ارزیابی رابطه برخی متابولیت‌ها و عناصر خونی با تشکیل فولیکول مقاوم تخمدان در گاوهای شیری هلشتاین

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 8، دوره 4، 4 (16) زمستان، اسفند 1389، صفحه 1019-1025   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

زهرا مراتی¹؛ غلامعلی مقدم²؛ سید عباس رأفت^{* 2}

¹دانش‌آموخته کارشناسی ارشد علوم دامی، گرایش فیزیولوژی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

²گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

چکیده

این مطالعه به منظور ارزیابی اثر برخی از متابولیت­ها و عناصر خونی بر تشکیلفولیکول­های مقاوم تخمدان انجام گرفت. برای انجام این تحقیق از 117 رأس گاو در دو گروه سالم و دارای فولیکول مقاوم،نمونه­های خون تهیه گردید. غلظت گلوکز، اوره، پروتئین تام، بتا هیدروکسی بوتیرات و فسفر سرم با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و غلظت هورمون استروژن سرم با استفاده از روش الایزا اندازه­گیری شد. همچنین اثر برخی عوامل مؤثر بر فولیکول مقاوم از جمله فصلگوساله­زایی، تعداد زایش و تولید شیر در 60-50 روز پس از زایش در گاوهای مورد مطالعه بررسی شد. وضعیت دام (وجود داشتن یا عدم وجود فولیکول مقاوم) بر میزان غلظت اوره سرم خون، پروتئین تام، بتا هیدروکسی بوتیرات، فسفر و استرادیول خون اثر معنی­داری (05/0p<) داشت. نتایج رابطه رگرسیون لجستیک نشان داد به­شرط ثابت بودن سایر عوامل در مدل، به­ازای افزایش یک واحد اوره، احتمال نسبی دام سالم به بیمار548/0 واحد افزایش و همچنین بازای یک واحد افزایش فسفر سرم خون احتمال نسبی دام سالم به بیمار 06/1 واحد کاهش می­یابد. بر اساس این مطالعهاز علل احتمالی ایجاد فولیکول مقاوم در گاوهای شیری کمبود یا افزایش برخی از متابولیت­ها و عناصر خونی مانند فسفر و اوره خون می­باشد.

کلیدواژه‌ها

الایزا؛ استرادیول؛ تخمدان؛ فولیکول مقاوم؛ گاو شیری

اصل مقاله

     در صنعت گاو شیری جهت تداوم تولید بهینه شیر در
نسل­های بعد ضروری است که تولیدمثل با بازدهی بالائی صورت گیرد. در این بین فولیکول­های تخمدان نقش زیادی در موفقیت تولیدمثلی ایفا می­کنند. رشد نکردن و عدم تخمک گذاری فولیکول­ها یکی از دلائل کاهش باروری و آبستنی
می­باشد که این حالت فیزیولوژیک رشد نکردن فولیکول­ها باعث ایجاد فولیکول­های مقاوم یا ایستا می­گردد. فولیکول­های ایستا فولیکول­هائی به اندازه 5/1 – 1 سانتی­متر هستند که در دو نوبت توشه رکتال به فاصله 14 روز بدون رشد و تخمک­ریزی در سطح تخمدان لمس می­شود. این فولیکول­ها ممکن است تا 60 روز پس از زایش در روی تخمدان گاوهای زایمان کرده مشاهده شوند و باروری را کاهش دهند. بهترین راهکار برای تغییر دینامیک فولیکول­ها، مدیریت تغذیه­ای دوره پس از زایش است که باید امتیاز وضعیت بدن[1] در زمان زایش کمی بالاتر از حد تعادل باشد و سپس کاهش طول مدت تعادل منفی انرژیNEB) [2] ) مدیریت شود. تحقیقات بسیاری نشان داده که بالانس انرژی جیره بر روی رشد فولیکول­ها بسیار مؤثرند به طوری که عدم تخمک گذاری پس از زایش ارتباط مستقیمی با میزان NEB دارد. علت مقاوم شدن فولیکول­ها در طی اوایل بعد از زایمان را به عوامل متعددی از جمله تعادل منفی انرژی، تعداد شکم زایش، میزان تولید شیر و فصل گوساله­زائی نسبت داده­اند (1 و 2).

 در مورد اثر غلظت گلوکز بر روی وضعیت دام گزارش شده که در اوایل شیردهی نسبت ترکیبات لیپوژنیک به گلوکوژنیک بالا بوده و در نتیجه قابلیت دسترسی بیشتر این ترکیبات برای تولید شیر در حیوانی که دچار کمبود انرژی شده، افزایش غلظت بتاهیدروکسی بوتیرات و اوره سرم خون و کاهش غلظت سرمی گلوکز، انسولین و ضرباتLH-FSH  را باعث می­شود. در این حالت فراوانی نبض­هایLH  پائین آمده و در نتیجه فولیکول غالب استرادیول کمی تولید می­کند که باعث ایجاد فولیکول­های مقاوم خواهد شد (4 و 5).

در مطالعه­ای بر روی گاوهای شیری گزارش شده که در اوایل شیردهی به دلیل بالا بودن تولید شیر و پائین بودن میزان خوراک مصرفی حیوان، انرژی مصرفی تکاپوی نیاز تولید بالا را نمی­کند، لذا حیوان در این دوره با بالانس منفی انرژی مواجه است و راندمان استفاده از پروتئین جیره  کاهش یافته و اوره دفع می­شود. افزایش دفع اوره و بالانس منفی انرژی به طور مستقیم و غیر مستقیم با تأثیر بر روی رویدادهای تولید مثلی موجب غیرفعال شدن تخمدان­ها و کوچک شدن اندازه فولیکول­ها می­گردد. همچنین مقادیر مازاد بر نیاز RDP[3] وRUP[4]  جیره باعث کاهش باروری و افزایش غلظت ازت اوره­ای پلاسما در گاوهای شیری می­شود. گاوهای شیری که در بالانس منفی انرژی هستند نسبت به گاوهای غیر شیرده تحمل کمتری به افزایش غلظت اوره و آمونیاک داشته و اثرات منفی افزایش غلظت اوره و آمونیاک بر باروری این گاوها بیشتر دیده می­شود (1، 6، 7 و 8).

در منابع مختلف غلظت گلوکز را مهم­ترین و مؤثرترین فاکتور بر فراوانی نبض­های LH بیان کرده­اند ولی متابولیت­های خون نظیر فسفر، پروتئین خام، نیتروژن اوره­ای و همچنین امتیاز وضعیت بدنی نیز می­توانند از شاخص­های مهم بر اختلالات تخمدانی و عدم رشد فولیکول­ها بعد از زایمان گاو شیری باشند (1 و 10).

بسیاری از محققین در تحقیقات خود کاهش و یا افزایش پروتئین جیره را نیز علت عدم رشد فولیکول­ها می­دانستند ولی اکثر آنها بر این باورند که کمبود انرژی اثر بیشتری نسبت به کمبود پروتئین روی تولید مثل و باروری دارد (5، 9 و 10).

هدف از این تحقیق بررسی عوامل مؤثر بر ایجاد فولیکول مقاوم بعد از زایمان در گاوهای شیری و ارائه راهکارهای مفید جهت کاهش این عارضه و در نتیجه کاهش فاصله گوساله­زایی است.

مواد و روش­ها

محل انجام آزمایش

     این تحقیق در یکی از گله­های بزرگ گاو شیری در اطراف تبریز اجرا گردید. این گاوداری دارای 1500 رأس دام بوده که به طور متوسط روزانه 700 رأس گاو دوشیده می­شود و  میانگین شیر تولیدی روزانه 34 کیلوگرم می­باشد و در آن گاوها به صورت جیره کاملاً مخلوط با مقدار مشخص کنسانتره، سیلاژ ذرت و یونجه تغذیه می­شدند. کل حیوانات مورد بررسی 117 رأس بودند که در دو گروه شاهد یا سالم (78 رأس) و بیمار (39 رأس) قرار داشتند. بعد از تشخیص گاوهای درگیر با فولیکول مقاوم از طریق توشه رکتال در 60-50 روز پس از زایمان 5 میلی­لیتر نمونه خونی داخل وریدی از گاوها گرفته شده و سریعاً نمونه­ها همراه یخ به آزمایشگاه انتقال داده شدند و سرم آنها توسط سانتریفوژ 1500 دور در 15 دقیقه جدا شدند و تا زمان اندازه­گیری پارامترهای خونی در درجه حرارت 20- درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند. مشخصات گاوهای تحت مطالعه از جمله سن فیزیولوژیک (شکم زایش) و متوسط تولید شیر در 60-50 روز پس از زایش و فصل گوساله زایی ثبت شدند. گاوها از نظر تولید روزانه در 4 دسته کم تولید (کمتر از20 لیتر)، متوسط تولید (30-20 لیتر)، پر تولید (40-30 لیتر) و سوپر تولید (40 لیتر و بالاتر) و همچنین از نظر شکم زایش در 4 سطح قرار داشتند. پارامترهای خونی که در گاوهای سالم (با فولیکول گراف) و بیمار (با فولیکول مقاوم) اندازه­گیری شدند شامل گلوکز، بتاهیدروکسی بوتیرات، اوره سرم خون (BUN)، فسفر، پروتئین تام و هورمون استروژن بودند. پارامترهای خونی توسط کیت شرکت زیست شیمی و اسپکتروفتومتر ژنوس20 (Geneus20) و استروژن سرم خون به روش (ELISA) و با استفاده از کیت شماره (1561-EIA) شرکت DRG آلمان به­وسیله دستگاه الایزاریدر اورنس (Avernes3200) آمریکا اندازه­گیری شد. به منظور اندازه گیری میزان بتاهیدروکسی بوتیرات اسید (BHBA) سرم خون از روش اولتراویوله و دستگاه اسپکتروفتومتر و کیت شماره (RB-1007) شرکت راندوکس انگلستان استفاده شد.

تجزیه و تحلیل داده­ها

 برای تجزیه و تحلیل داده­ها از آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی استفاده شد. اثرات عوامل محیطی شامل وضعیت دام، فصل گوساله­زایی، سن فیزیولوژیک و میزان تولید شیر (در 60-50 روز پس از زایش) بر روی متابولیت­های خونی (گلوکز، فسفر، پروتئین، اوره، بتا هیدروکسی بوتیرات)، هورمون استروژن و تأثیر آنها بر ایجاد فولیکول مقاوم بررسی گردید. میانگین تولید شیر روزانه در چهار گروه کد­بندی شدند و ارقام کمتر از 32، 32 تا 40، 40 تا 45 و بیشتر از 45 لیتر
به­ترتیب کدهای 1 تا 4 گرفتند. در مدل اولیه کلیه عوامل اصلی و متقابل در نظر گرفته شد و سپس با توجه به غیرمعنی­دار بودن اثرات متقابل، این اثرات به­استثنای اثر متقابل فصل و تولید شیر حذف شدند. بر اساس مدل آماری نهایی زیر و با توجه به نامتعادل بودن داده­ها تجزیه و تحلیل با کمک رویه GLM نرم افزار SAS انجام گرفت.

Y_ijklm=µ + C_i + S_j + P_k + M_l + (S×M)_jl + e_ijklm

که در آن:

Y_ijklm= هر مشاهده

µ= میانگین کل

C_i= اثر وضعیت دام (i=1, 2)

S_j= اثر فصل زایش (j= 1, 2)

 = P_kاثرشکم زایش (k=1, 2, 3, 4)

M_l= اثر میزان تولید شیر در 60- 50 روز پس از زایش (l=1, 2, 3, 4)

  (S×M)_jl= اثر متقابل فصل زایش و میزان تولید شیر

e_ijklm= اشتباه یا اثرات باقیمانده

تجزیه عوامل مؤثر بر روی وضعیت دام

    وضعیت دام (سالم یا بیمار) صفتی باینری[5] (دو حالتی) است که برای تجزیه وتحلیل آن از رگرسیون لجستیک استفاده شد (3). رگرسیون لجستیک رابطه بین یک متغیر وابسته رسته­ای و تعدادی از متغیرهای مستقل را توصیف می­نماید. یک متغیر رسته­ای می­تواند به شکل بینری، رتبه­ای یا اسمی باشد که هر کدام از آنان نیاز به روش­های مختلفی جهت مدل­سازی دارند. گاهی در مسائل رگرسیون متغیر وابسته دو حالت دارد، یعنی می­تواند فقط دو مقدار را بپذیرد. در رگرسیون لجستیک از آنجایی­که متغیر وابسته فقط دو حالت دارد، برآورد یک واحد تغییر آن مثل حالت رگرسیون خطی مفهوم چندانی نخواهد داشت. بنابراین رگرسیون لجستیک به­منظور مدل سازی مقدار متغیر وابسته، از احتمالات نسبی[6] استفاده می­کند. در نتیجه رابطه هر کدام از متغیر های مستقل با متغیر وابسته (لگاریتم احتمال نسبی) با شیب­هایی (Slope) مشخص می­شود. در پژوهش حاضر پیدا کردن رابطه بین وضعیت دام و پارامترهای خونی اندازه­گیری شده مورد نظر بود. با استفاده از رویه Logistic نرم افزار SAS ابتدا کلیه عوامل مؤثر بر وضعیت دام در مدل لجستیک اعمال شدند، سپس با انتخاب به روش گام به گام (Stepwise) کلیه عوامل غیر معنی­دار حذف شدند. وضعیت دام متغیر وابسته و متابولیت­های اندازه گیری شده در خون، شکم زایش، تولید شیر و فصل به­عنوان متغیرهای مستقل در مدل وارد شدند.

یافته­ها، بحث و نتیجه­گیری

اثر وضعیت دام بر متابولیت­های اندازه­گیری شده

    بر اساس جدول شماره 1 وضعیت دام (وجود داشتن یا عدم وجود فولیکول مقاوم) بر میزان غلظت اوره سرم خون، پروتئین تام، بتا هیدروکسی بوتیرات، فسفر و استرادیول خون اثر
معنی­داری (05/0p<) داشت که معنی­دار بودن اثر وضعیت دام بر میزان اوره سرم خون با نتایج Butler در سال 1998(1) همخوانی داشت و معنی­دار شدن اثر وضعیت دام بر غلظت فسفر خون با نتایج Leroy و همکاران در سال 2004 (7) مغایر بود. همچنین معنی­دار شدن اثر وضعیت دام بر میزان غلظت پروتئین تام سرم خون با نتایج برخی محققین (11) موافقت داشت. طبق جدول شماره 3 مشاهده می­شود گاوهای سالم دارای ازت اوره­ای کمتری نسبت به گاوهای بیمار هستند. اوره یک منبع محلول برای تولید آمونیاک است که در تغذیه نشخوارکنندگان استفاده می­شود ولی در صورت تغذیه گاوها با غذاهای حاوی پروتئین بالا و یا پائین بودن کربوهیدرات جیره، ممکن است مقدار اوره خون گاو افزایش یابد که این افزایش علاوه بر ایجاد استرس در دام سبب کاهش باروری می­شود. پائین بودن میزان گلوکز در گاوهای دارای فولیکول مقاوم (جدول 3) بیشتر به دلیل تعادل منفی انرژی بالا در این گاوها در هفته­های اول بعد از زایمان و نیز کاهش مصرف خوراک است که منجر به غیر فعال شدن تخمدان­ها می­شود. کمبود انرژی همچنین با کاهش تولید استرادیول توسط فولیکول غالب باعث کاهش فرکانس ترشح LH و کاهش قطر فولیکول غالب و ایجاد فولیکول مقاوم می­شود (11 و 13).

 

 

 

 

 

جدول 1- جدول تجزیه واریانس عوامل مؤثر برغلظت برخی متابولیت­های خون

	گلوکز	فسفر	اوره	پروتئین	بتاهیدروکسی	استروژن
فصل زایش	*	ns	ns	**	ns	**
وضعیت دام	ns	*	*	**	**	**
میزان تولید شیر	ns	ns	ns	ns	ns	ns
شکم زایش	ns	ns	ns	ns	ns	ns

** و* معنی­داری به ترتیب در سطح احتمال یک و پنج درصد خطا، ns:غیر معنی­دار

 

 

 

 

جدول 2- اثر فصل زایش بر میانگین حداقل مربعات غلظت متابولیت­های خون

فصل زایش	گلوکز	ازت اوره ای	استرادیول
گرم	86/50	36/22	99/16
سرد	*35/59	*83/16	*79/73

علامت * در هر ستون بیانگر وجود اختلاف در سطح احتمال 5 درصد خطا است.

 

جدول 3- اثر بود و نبود فولیکول مقاوم بر غلظت متابولیت­های خون

فولیکول	گلوکز mg/dl	فسفر mg/dl	پروتئین gr/dl	اوره mg/dl	بتاهیدروکسی Mmol/lit	استرادیول pg/ml
سالم	5/57	59/6	8/8	97/15	25/7	97/18
بیمار	*24/53	*23/5	*73/7	*23/23	*94/4	*8/71

            علامت * در هر ستون بیانگر وجود اختلاف حداقل در سطح احتمال 5 درصد خطا است.

 

 

اثر فصل زایش برمتابولیت­های اندازه­گیری شده

     فصل زایش بر میزان گلوکز خون، اوره سرم خون و استرادیول اثر معنی­داری داشت (جدول 1) و میزان گلوکز در گاوهائی که در فصل گرم گوساله­زائی داشتند کمتر از گاوهائی بود که در فصل سرد گوساله­زائی داشتند که این امر احتمالاً به دلیل افزایش استرس گرمائی و در نتیجه کاهش مصرف خوراک و اثر آن روی دینامیک تخمدانی می­باشد. البته استرس گرمائی بیشتر با تأثیر بر سیستم آندوکرینی بدن دام باعث وقوع فرایندهای گلوکونئوژنز و گلیکوژنولیز شده و دام گلوکز بیشتری را برای مقابله با این استرس­ها مصرف می­کند و در نتیجه این فرایند باعث کمبود انرژی در بدن دام می­شود که مشابه نتایج (9 و 12) بود. کمبود انرژی در بدن دام باعث کاهش بازدهی مصرف پروتئین و افزایش ازت اوره­ای سرم خون می­گردد (جدول 2) که با نتایج Lopez و همکاران در سال 2007 (9) همخوانی داشت. در فصل گرما افزایش کورتیزول در اثر استرس گرمائی از ترشح GnRH ممانعت می­کند و به دنبال آن ترشح LH و استروژن کاهش می­یابد. در گاوهای شیری بین ماده خشک مصرفی، میزان تولید شیر و بالانس منفی انرژی با استرس گرمائی رابطه متقابلی وجود دارد که در نتیجه آنها ترشح LH و قطر فولیکول­های غالب در دوره پس از زایش کاهش می­یابد که کاهش ماده خشک مصرفی در زمان استرس گرمائی باعث بالانس منفی انرژی، و کاهش میزان انرژی در بدن باعث می­شود که لایه­های گرانولوزای فولیکول­ها توانائی تولید استرادیول به میزان کافی را نداشته باشند (11 و 12).

نتایج رگرسیون لجستیک برای عوامل مؤثر بر فولیکول مقاوم جدول شماره 4 نتایج رگرسیون لجستیک را نشان می­دهد که اثرات میزان غلظت اوره سرم خون و فسفر روی وضعیت دام (بیمار یا سالم) معنی­دار و سایر اثرات معنی­دار نبودند که از مدل اولیه حذف شدند. بر این اساس مدل لجستیک به صورت زیر اجرا گردید:

Log [p/ (1-p)] = -3.92+ 0.55*U – 1.06* Ph

که در آن، p= احتمال وضعیت دام (1= بیمار، صفر= سالم)، U= اوره و Ph= فسفر می­باشد. این رابطه نشان می­دهد با فرض ثابت بودن سایر متغیرها در مدل، اگر اوره 1 واحد زیاد شود آنگاه احتمال تبدیل شدن وضعیت یک حیوان از سالم به بیمار 548/0 واحد افزایش می­یابد. همچنین اگر فسفر 1 واحد افزایش یابد احتمال تبدیل شدن وضعیت یک حیوان از سالم به بیمار 06/1 واحد کاهش می­یابد به­شرطی که سایر عوامل در مدل ثابت باشند. فسفر به خاطر نقشی که در بسیاری از واکنش­های بدن خصوصاً متابولیسم انرژی دارد به عنوان
مهم­ترین عنصر خونی مؤثر بر باروری و عملکرد تولید مثلی دام است و با افزایش یک واحد BUN گاوها بیشتر مستعد ابتلا به سندرم فولیکول مقاوم می­گردند. در دام­های دارای فولیکول مقاوم میزان اوره بالاتر از دام­های سالم است (جدول 3) و از طرف دیگر با افزایش یک واحد BUN نسبت دام سالم به بیمار کاهش می­یابد (جدول 4) یعنی دام­ها بیشتر مستعد ابتلا به سندرم فولیکول مقاوم می­شوند. یک رابطه دو طرفه یا مکمل بین میزان غلظت اوره سرم خون و ایجاد فولیکول مقاوم وجود دارد که یکی می­تواند دیگری را توجیه کند که هر دو این رابطه­ها را می­توان به بالانس منفی انرژی در دام­های دارای فولیکول مقاوم نسبت داد. کمبود انرژی در این دام­ها باعث کاهش راندمان استفاده از پروتئین جیره و افزایش دفع اوره می­گردد. با افزایش یک واحد از اوره سرم خون مخصوصاً در اوائل زایمان میزان غلظت گلوکز خون شدیداً کاهش خواهد یافت که کمبود انرژی باعث کاهش ترشح فراوانی نبض LH و کاهش تولید استرادیول و متعاقب آن کاهش قطر فولیکول غالب و ایجاد فولیکول ایستا می­گردد. هرچند اثر میزان استرادیول خون در سطح احتمال 05/0
معنی­دار نشده است ولی سطح احتمال معنی داری 09/0 نشان می­دهد که استرادیول نیز دارای اثر بر روی ایجاد فولیکول مقاوم می­باشد و پیشنهاد می­شود برای مطالعات آتی با تعداد
نمونه­های بیشتری مورد بررسی قرار گیرد.

 

جدول 4-  نتایج رگرسیون لجستیک برای عوامل مؤثر بر فولیکول مقاوم

منابع تغییرات	DF	Chi-square	P value
فسفر	1	22/4	03/0
اوره	1	99/7	004/0
استرادیول	1	56/8	09/0

 

با توجه به این تحقیق استنباط می­شود که یکی از علت­های عدم رشد فولیکول در گاوهای شیری کمبود برخی از عناصر و متابولیت­های خونی است. کمبود مواد مغذی در گاو شیری مهم تلقی شده و باید با مدیریت صحیح از پیشرفت و عوارض آن جلوگیری گردد. همچنین با کنترل جیره در زمان خشکی و زایمان می­توان در طی اوائل شیردهی فعالیت تخمدان­ها و بالطبع رشد فولیکول­های نارس و در نتیجه راندمان تولید مثلی را افزایش داد.

 

---

[1] Body condition score

[2] Negative energy balance

[3] Rumen degradable protein

[4] Rumen undegradable protein

[5] Binary

[6] Odds 

مراجع

1. Butler, W.R. 1998. Review: Effect of protein nutrition on ovarian and uterine physiology in dairy cattle. J. Dairy Sci. 81(9): 2533-2539.
2. Butler, W.R. 2000. Nutrition interaction with reproductive performance in dairy cattle. Anim. Rep. Sci. 60-61: 449-457.
3. Dickman, P.W. 2003. Logistic in SAS Version 8.0. [Department of medical Epidemiology and Biostatics] [Karolinska Instituent]; Available at:http://www.pauldickman.com/teaching/sas/sas-logistic-seminar 8. pdf.
4. Doepel, L., Lapierre, H. and Kennelly, J.J. 2002. Peripartum performance and metabolism of dairy cows in response to prepartum energy and protein intake. J. Dairy Sci. 85(9): 2315-2334.
5. Garcia-Bojalil, C.M., Staples, C.R., Thatcher, W.W. and Drost, M. 1994. Protein intake and development of ovarian follicles and embryos of super ovulated non lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 77(9): 2537-2548.
6. Jorritsma, R., Wensing, T., Kruip, T.A.M., Vos, P.L.A.M. and Noordhuizen, J.P.T.M. 2003. Metabolic change in early lactation and impaired reproductive performance in dairy cows. Vet. Res. 34: 11-26.
7. Leroy, J.L.M., Vanholder, T., Delanghe, J.R., Opsomer, G., Vansoon, A., Bols, P.E.J., Dewulf, J. and Dekurif, A. 2004. Metabolic changes in follicular fluid of the dominant follicle in high yielding dairy cows early postpartum. Theriogenology. 62(6): 1131-1143.
8. Lopez-Gatius, F., Santolavia, P., Yaniz, J., Rutlant, J. and Lopez-Bejar, M. 2001. Persistent ovarian follicles in dairy cows: a therapeutic approach. Theriogenology. 56(4): 649-659.
9. Lopes, A.S., Butler, S.T., Gilbert, R.O. and Butler, W.R. 2007. Relationship of pre-ovulatory follicle size, estradiol concentrations and season to pregnancy outcome in dairy cows. Anim. Rep. Sci. 99(1):34-43.
10. Lucy, M.C. 2001. Reproductive loss in high-producing dairy cattle: Where will it end? J. Dairy Sci. 84(6): 1277-1293.
11. Rensis, F. and Scaramuzzi, R.J. 2003. Heat stress and seasonal effect on reproduction in dairy cow – a review. Theriogenology. 60(6): 1139-1151.
12. Savio, J.D., Boland, M.P., Hynes, N. and Roche, J.F. 1990. Resumption of follicular cows in the early post-partum period of dairy cows. J. Reprod. Fertil. 88(2): 569-579.
13. Shrestha, H.K., Nakao, T., Suzuki, T., Akita, M. and Hiqaki, T. 2005. Relationships between body condition score, body weight, and some nutritional parameters in plasma and resumption of ovarian cyclicity postpartum during pre- service period in high-producing dairy cows in a subtropical region in Japan. Theriogenology. 64(4): 855-866.