جستجوی آنتی‌بادی ضد هرپس ویروس تیپ 1 گاوی در شیر گاوان منطقه ارومیه و ماکو به روش الایزا

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 7، دوره 4، 3 (15) پاییز، آذر 1389، صفحه 915-921   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

احمد قره خانی^{* 1}؛ احمد مرشدی²

¹عضو هیات علمی گروه دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ماکو، ماکو، ایران

²گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

چکیده

برای تعیین میزان آلودگی به هرپس ویروس تیپ 1 گاوی (BHV-1) در گاوهای شیری منطقه ارومیه و ماکو و مقایسه نتایج به­دست آمده، یک مطالعه مقطعی انجام شد. انتخاب نمونه­ها به طور تصادفی و در سه گروه سنی (3 تا 4 سال، 5 تا 6سال و 7 سال به بالا) صورت گرفت. در هر شهرستان 22 گله انتخاب و از هر گله، 10 رأس گاو جدا و از هر رأس، یک نمونه شیر اخذ گردید. نمونه­ها با استفاده از آزمون الایزای غیر مستقیم برای جستجوی پادتن­های ضد هرپس ویروس 1 گاوی مورد آزمایش قرار گرفتند. با تعیین OD نمونه­ها و درصد الایزا مثبت و الایزا منفی، نتایج به­دست آمده مقایسه گردید. جهت تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار SPSS ویرایش 16، آزمون­های من ویتنی، مربع کای، کروسکال والیس و نرم افزارS-Plus 2000 ، جهت پی بردن به تفاوت بین میانگین میزان آلودگی در دو منطقه و تفاوت مجموع میانگین میزان آلودگی در بین گروه­های سنی با سطح اطمینان 95 درصد استفاده گردید. نتایج نشان داد میزان آلودگی در منطقه ماکو 08/34 درصد و در منطقه ارومیه 04/13 در صد بوده که حاکی از بالا بودن میزان آلودگی در منطقه ماکو است به طوری که تفاوت آماری معنی­داری را بین میزان آلودگی در این دو منطقه شاهد هستیم (005/0p =). به علاوه، در بررسی مجموع میانگین میزان آلودگی در بین گروه­های سنی در دو منطقه، نسبت موارد آلوده در گروه سنی اول (32 درصد) به­طور معنی­داری از دو گروه سنی دیگر (14 درصد) و (6 درصد) بیشتر برآورد گردید (05/0>p).

کلیدواژه‌ها

هرپس ویروس 1؛ گاو؛ شیر؛ الایزا؛ ارومیه؛ ماکو

اصل مقاله

مقدمه

 

     هرپس ویروس 1 گاوی عامل رینوتراکئیت عفونی گاوان (IBR) است که موجب بیماری در قسمت فوقانی دستگاه تنفس یعنی بینی، حنجره و نای می­شود (11). آلودگی به این ویروس می­تواند سبب تورم عفونی مهبل و فرج، سقط جنین، ناباروری، گاهی آنسفالیت و عوارض گوارشی در گوساله­ها شود، التهاب پستان و زخم مابین انگشتان از عوارض دیگر بیماری است. همچنین عده زیادی از گاوان بالغ بدون بروز نشانه­های بالینی حامل ویروس بوده و می­توانند سبب انتشار عفونت شوند (5، 13 و 15). یک خصوصیت قابل توجه ویروس توانایی آن در مخفی شدن به دنبال عفونت اولیه با سویه تخفیف حدت یافته می­باشد. ویروس مادام العمر مخفی باقی مانده و سپس عود می­نماید. فعالیت مجدد ویروس و انتشار آن در اثر عواملی مانند تزریق مقدار زیاد کورتیکواستروئیدها، استرس، تغییر رژیم غذایی یا آب و هوا، سایر بیماری­های عفونی، تراکم زیاد گله، کوچ دائم دام­ها و ایمنی ناهمگن صورت می­گیرد (13). این بیماری تا 10 درصد تلفات دارد ولی خسارات اقتصادی مهمی نظیر کاهش تولید شیر، کم شدن گوشت  و سقط جنین را سبب می­شود (8 و 10). در حال حاضر یکی از راه­های تشخیص آلودگی به این ویروس، جستجوی پادتن ضد آن با استفاده از آزمون الایزا در شیر است که می­تواند جایگزین روش سرولوژی شود (14، 15 و 17). هدف مطالعه حاضر، بررسی میزان آلودگی به هرپس ویروس 1 گاوی (BHV-1) با استفاده از آزمون الایزا در نمونه شیر انفرادی اخذ شده از گاوهای منطقه ارومیه و ماکو و مقایسه نتایج به­دست آمده است.

مواد و روش‌­­ها

     جامعه آماری در این مطالعه شامل گاوهای شیرده منطقه ماکو (شامل شهرستان­های ماکو، پلدشت و شوط) و منطقه ارومیه (شهرستان ارومیه و اطراف آن) بودند. طبق برآورد­های انجام شده، حجم نمونه مورد استفاده در این تحقیق شامل 440 رأس گاو بود که 220 رأس آن، از گاوهای گاوداری­های منطقه ماکو و به روش دو مرحله­ای خوشه­بندی و سپس تصادفی ساده  و 220 رأس دیگر، از گاوهای گاوداری­های منطقه ارومیه با همین روش اخذ شدند. دام­های مورد مطالعه با توجه به اطلاعاتی که در پرسشنامه درج شده بود، در سه گروه سنی 3 تا 4 سال، 5 تا 6 سال و 7 سال به بالا قرار گرفتند، سپس از هر راس گاو به میزان 7-6 میلی­لیتر شیر اخذ و در آزمایشگاه پس از سانتریفوژ و حذف چربی، در 20- درجه سانتی­گراد
نگه­داری شدند.

جهت جستجوی پادتن برعلیه هرپس ویروس 1 گاوی از روش الایزای غیرمستقیم و با استفاده از کیت تجارتی به نام Svanovir ساخت شرکت Svanova Biotech کشور سوئد و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت به شرح زیر صورت گرفت:

100 میکرولیتر از نمونه شیر به صورت دوتایی در دو حفره مجاور هم که یکی حاوی و دیگری  فاقد پادگن BHV-1 بودند، ریخته شد. چهار حفره آخرین ردیف پلیت جهت شیر مثبت و منفی استاندارد اختصاص داشت و پس از یک ساعت نگه­داری در گرمخانه 37 درجه سانتی­گراد و 3 بار شستشو، 100 میکرولیتر از کونژوگه پراکسیداز به هر حفره اضافه شد و دوباره پس از یک ساعت نگه­داری در گرمخانه 37 درجه و 3 بار شستشو، به هر حفره 100 میکرولیتر محلول سوبسترا ریخته و حدود 15 دقیقه در حرارت اتاق گذاشته شد. پس از مشاهده تغییر رنگ 50 میکرولیتر ماده متوقف کننده به هر حفره اضافه و    OD(optical density) آنها در 450 نانومتر خوانده و ثبت گردید. ارزش میانگین OD نمونه­ها و استاندارد با کاهش OD حفره کنترل آنتی ژن از OD حفره آنتی ژن BHV-1 محاسبه گردید. در این تحقیق نمونه­های شیر که ارزش میانگین OD آنها مساوی یا بزرگتر از5/2 برابر میانگین OD سرم منفی استاندارد بودند، مثبت در نظر گرفته شد (جدول 1).

جدول 1- میزان میانگین OD و دو برابر کنترل شیر منفی در نمونه­های دو منطقه ارومیه و ماکو

منطقه	ODنمونه	OD شاهد	OD متوسط	2×OD متوسط
ارومیه	399/0	353/0	376/0	752/0
ماکو	310/0	326/0	318/0	636/0

نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS ویرایش 16، روش­های آمار توصیفی، آزمون­های من ویتنی، مربع کای، کروسکال والیس و نرم افزار S- Plus 2000 با در نظر گرفتن سطح اطمینان 95 در صد مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند.

یافته­ها

    در این بررسی از مجموع 440 نمونه شیر اخذ شده (جدول 2)، 104 نمونه (23 درصد) واجد پادتن و 336 نمونه (77 درصد) فاقد پادتن ضد ویروس هرپس ویروس 1 گاوی بودند. از 104 نمونه مثبت، در منطقه ماکو 75 نمونه (08/34 درصد) مثبت و در منطقه ارومیه، 29 نمونه (04/13 درصد) مثبت شناخته شدند.

جدول 2–  تعداد نمونه­های اخذ شده در هر منطقه به تفکیک  گروه سنی

گروه سنی منطقه	4-3 سال	6-5 سال	7 سال به بالا
ارومیه	127	53	40
ماکو	145	48	27
جمع	272	101	67

 

با توجه به میزان آلودگی گزارش شده در این دو منطقه، به نظر می­رسد تفاوت معنی­داری بین میانگین میزان آلودگی وجود دارد. آزمون این فرضیه، درسطح اطمینان 95 درصد با نرم افزار SPSS ویرایش 16 انجام شد که مقدار احتمال آزمون، با آزمون من­ویتنی برابر 005/0p= شد که نشان­دهنده این موضوع است که میزان آلودگی در دو منطقه ارومیه و ماکو با هم برابر نیست و نیز با آزمون فرض یک طرفه مشاهده گردید که این میزان در منطقه ماکو بیشتر است که آزمون این فرضیه در سطح اطمینان 95 در صد با نرم افزار s-plus2000 انجام شد

(X-square = 25.5, df = 1, p-value= 0).

از طرفی میزان آلودگی در دو منطقه با هم 104  نمونه (23 درصد) می­باشد که از این میزان 86 نمونه از گروه سنی اول،14 نمونه از گروه سنی دوم و 4 نمونه از گروه سنی سوم گزارش شدند که از 100 درصد موارد آلوده به ترتیب 83 درصد، 13 درصد و 4 درصد آلودگی­ها را شامل می­شوند (جدول 3)، البته با قیاس این نسبت­ها با نسبت­های تخصیص یافته از حجم نمونه به هر گروه، قضاوت از روی این ارقام سخت بوده ولی با تحلیل ناپارامتری میزان  ODدرون گروه­ها با هم به­طور
معنی­داری متفاوت است. با استفاده از آزمون کروسکال والیس مقدار آمار خی دو برابر 21/18 و مقدار p_value برابر صفر گردید. برای اطمینان بیشتر، آزمون جانکر هم این نتیجه را تأیید کرد.

برابری نسبت موارد آلوده نیز مورد آزمون قرار گرفت. آزمون این فرضیه در سطح  اطمینان 95  درصد با نرم افزار
s-plus2000 انجام شد، که مشاهده شد نسبت موارد آلوده در بین سه گروه سنی برابر نیست. مقدار آمار خی دو آزمون برابر 5/26 و مقدار p_value برابر صفر شد. با مقایسه تکی گروه­ها و آزمون مقایسه جفت میانگین­ها، دریافت می­شود که نسبت موارد آلوده در گروه سنی اول به­صورت معنی­داری از دو گروه سنی دیگر بیشتر است. برآورد نمونه­ای برای نسبت موارد آلوده در گروه سنی اول 32 درصد، در گروه سنی دوم برابر 14 درصد و در گروه سنی سوم 6 درصد به­دست آمد p-value = 0)
  df = 2,   (X-square = 26.5,(جدول 4).

جدول 3- تعداد و در صد نمونه­های الایزا مثبت در هر منطقه به تفکیک  گروه سنی

گروه سنی منطقه	4-3 سال	6-5 سال	7 سال به بالا
ارومیه	26	3	-
ماکو	60	11	4
جمع	86 (83 %)	14(13%)	4 (4%)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 4 -  برخی ویژگی­هایOD در هر منطقه به تفکیک گروه­های سنی

گروه­های سنی   منطقه	4-3 سال (در مجموع با32% آلودگی)	6-5 سال (در مجموع با14% آلودگی)	7 سال به بالا (در مجموع با6% آلودگی)
ارومیه میانگین فاصله اطمینان 95% انحراف معیار Max Min	36/0 42/0- 32/0 29/0 46.1 03/0	29/0 36/0- 22/0 17/0 01/0 55/0	21/0 26/0 – 16/0 20/0 01/0 02/1
ماکو میانگین فاصله اطمینان 95% انحراف معیار Max Min	44/0 50/0- 38/0 35/0 46.1 05/0	37/0 44/0- 30/0 24/0 09/1 06/0	23/0 30/0- 17/0 16/0 06/0 77/0

 

 

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

    امروزه روش­های مختلف آزمایشگاهی برای تشخیص آلودگی به BHV-1 در گاو وجود دارد، اما آزمون الایزا به دلیل راحت­تر بودن مراحل انجام آن و نیاز به زمان حدود 3 ساعت برای اعلام نتیجه به عنوان یک تست غربالگر مطرح است. در بسیاری از کشورها، این روش به عنوان ابزاری قوی و مهم برای کنترل بیماری IBR به­کار گرفته شده است (12). آزمایش الایزا به­طور گسترده­ای برای تعیین آنتی­بادی­های BHV-1 در نمونه­های شیر به­کار رفته است (13). در ایران نیز کارهای سرولوژی در مورد BHV-1 در استان­ها و شهرستان­ها کم وبیش انجام شده است (1، 2، 3 و4).

Frankena و همکاران (1997) نشان دادند که در گله­های متوسط (حداقل با 45 رأس گاو) با استفاده از تست الایزا در شیر بین 25-10 درصد آلودگی در گله مشاهده شد و نتیجه گرفتند که مثبت بودن نمونه­های شیر از نظر BHV-1 نشانگر گسترش عفونت در گله است (7). در تحقیق دیگری که
به­وسیله Tekes و همکاران (1999) در کشور مجارستان با استفاده از تکنیک الایزا در شیر و سرم انجام شد، در الایزای شیر 79 درصد گله آلوده به BHV-1 بودند در حالی که در نمونه­های سرمی تست شده فقط 64 درصد مثبت گزارش گردید (16). در مطالعه دیگری که در اسلونی توسط Hostnik و Grom (1997) روی 835 نمونه سرم و شیر انجام گرفت، میزان آلودگی به BHV-1 در سرم 86 درصد و در شیر 80 درصد با استفاده از تکنیک الایزا به­دست آمد در حالی که فقط 79 درصد همین نمونه­های سرمی با استفاده از تست VN (Viral neutralization test) مثبت بودند (9). در بررسی دیگری در کشور دانمارک استفاده از شیر جمع­آوری شده از هر گله (Bulk tank) جهت تعیین وضعیت آلودگی به BHV-1 با الایزای شیر مناسب تشخیص داده شد (11). افشاری و همکاران در یک تحقیق که از پاییز 1384 تا تابستان 1385، بر روی 270 رأس گاو از 9 گاوداری شیری اطراف شهرستان کرج جهت بررسی میزان آلودگی به BHV-1 با استفاده از آزمون الایزا در نمونه­های شیر انفرادی انجام دادند، میزان آلودگی را 03/37 درصد (100 نمونه) گزارش کردند. همچنین در مقایسه میزان آلودگی در سه فصل بهار، تابستان و زمستان، بیشترین تعداد نمونه­های مثبت (45 مورد) در فصل پاییز گزارش گردید (1). در بررسی دیگری که توسط تاجیک در سال 1380 در پنج گاوداری صنعتی اطراف تهران (شهریار و کرج) جهت بررسی سرولوژیک ویروس BHV-1 با استفاده از تستVN  روی 208 نمونه سرمی انجام شد، از 101 نمونه اخذ شده از شهرستان کرج 17 نمونه (8/16 درصد) و از 107 نمونه اخذ شده از شهرستان شهریار 58 نمونه (7/54 در صد) مثبت بودند. میزان آلودگی در گاوهای بالای دو سال (گاوهای 3 تا 4 سال) در مجموع بیشتر از سایر گروه­های سنی بررسی شده گزارش گردید و شهرستان شهریار نسبت به شهرستان کرج آلوده­تر بود (2).

در تحقیق حاضر همان­طور که قبلاً نشان داده شده بود می­توان نمونه­های شیر را به جای سرم در آزمون الایزا جهت تعیین وضعیت آلودگی گله به BHV-1 به راحتی بکار برد، زیرا نمونه­برداری شیر از گله­ها آسان­تر انجام می­شود و می­تواند آلودگی­های بالا، متوسط و پایین را در گله نشان دهد به این شکل که آلودگی های بالاتر از 30 در صد آزمایش سرمی مثبت یا شیر مثبت را آلودگی بالا، کمتر از 10 درصد را آلودگی پایین و ما بین 10 تا 30 درصد را آلودگی متوسط قلمداد می­کنند (11). در این مطالعه که نمونه­ها از دو منطقه ارومیه و ماکو
جمع­آوری گردید، میزان آلودگی در منطقه ماکو 08/34 درصد و در منطقه ارومیه 04/13 درصد به­دست آمد که به ترتیب میزان آلودگی بالا و متوسط را نشان دادند و در بررسی آماری نتایج که به­وسیله آزمون­های من ویتنی، مربع کای با نرم افزار SPSS ویرایش 16 و نرم افزار S-Plus 2000 با سطح اطمینان 95 درصد انجام شد، نشان داده شد که میزان آلودگی در منطقه ماکو به­طور معنی­داری بیشتر از منطقه ارومیه می­باشد (005/0=p). شاید دلیل آن را بتوان به شرایط زیست ویروس نسبت داد که در دمای پایین­تر هوا بیشتر فراهم می­شود (6). با توجه به اینکه منطقه ماکو نسبت به ارومیه مرتفع­تر و دارای آب و هوای سردتری است، می­تواند تأییدی بر این نتیجه باشد. البته شاید عوامل دیگری نیز مانند عوامل مدیریتی در این اختلاف دخیل باشد. از طرفی در بررسی میزان آلودگی در بین سه گروه سنی انتخاب شده که به­وسیله آزمون­های کروسکال والیس، مربع کای به­وسیله نرم افزار S-Plus 2000  با سطح اطمینان 95 درصد انجام شد، نسبت موارد آلوده در گروه سنی اول (3 تا  4 سال) 32 درصد، در گروه سنی دوم (5 تا 6 سال) 14 درصد و در گروه سنی سوم (7 سال به بالا) 6 درصد به­دست آمد و نیز نشان داده شد که میزان آلودگی در گروه سنی اول به­صورت معنی­داری بیشتر از دو گروه سنی دیگر است. با نگاه کلی و ساده به جداول ارائه شده، رابطه معکوس بین میزان آلودگی با سن دام آشکار می­شود و این یافته با آنچه در متون آمده مطابقت دارد (13).

با توجه به نتایج مطالعات قبلی انجام یافته و نتایج حاصل از این تحقیق می­توان گفت که آزمون الایزای شیر با آزمون الایزای سرم و VNT که یک تست استاندارد است برابری کرده و می­تواند به جای آنها در تعیین آلودگی گله به­کار گرفته شود. از سوی دیگر الایزا بر خلاف  VNT نیاز به کشت سلول، ویروس زنده و صرف زمان طولانی نداشته و می­تواند در هر آزمایشگاهی انجام شود. اخیراً استفاده از شیر گاوان چه به طور انفرادی و چه به شکل مخلوط گله، به کمک آزمون الایزا در تشخیص گله­های آلوده به BHV-1 از گله­های عاری از عفونت در برنامه­های غربالگری در اکثر کشورها بکارگرفته شده است. 

مراجع

1. افشاری، غ.، باهنر، ع.، لطفی زاده، م. و موسی­خانی، ف. 1387. بررسی فراوانی حضور پادتن ضد هرپس ویروس 1 گاوی در شیر گاوداری های اطراف کرج به روش الایزا. مجله علوم دامپزشکی ایران ،دوره چهارم، شماره سوم، صفحات:94-89 .
2. تاجیک، س. 1380. بررسی سرولوژیکی هرپس ویروس تیپ 1 گاوی (IBR) در پنج گاوداری صنعتی اطراف تهران (کرج، شهریار). خلاصه مقالات دوازدهمین کنگره دامپزشکی ایران، تهران، صفحه: 198.
3. حاجی حاجیکلایی، م.ر. و صیفی آباد شاپوری، م.ر. 1385. بررسی سرواپیدمیولوژیکی آلودگی با هرپس ویروس تیپ 1 گاوی  (BHV-1) در گاوهای اهواز. مجله علوم دامپزشکی ایران، دوره دوم، شماره دوم، صفحات: 30-23.
4. همت زاده، ف.، ممتاز، ح.، تاجبخش، ا. و صفری، ح. 1381. بررسی سرولوژیک آلودگی به ویروس IBR در گاوهای استان چهار محال بختیاری. مجله پژوهش و سازندگی، دوره پانزدهم، شماره دوم، صفحات: 43-38.
5. Ata, A., Kala, M., Yavru, S., Bulut, O. and Buyukyoruk, U. 2006. The effect of subclinical bovine herpes virus 1 infection on fertility of cows and heifers. Acta veterinaria. 56(2-3):267-273.
6. Fenner, F., Bachman, P.A., Gibbs, E.P.J., Murphy, F.A., Studdert, M.J. and White, D.C. 1999. Veterinary Virology, Academic press, London, Third Edition. p:337-348.
7. Frankena, K., Franken, P., Vandehoek, J., Koskamp, G. and Kramps, J.A.1997. Probablity of detecting antibodies to bovine hepes virus 1 in bulk milk ofter the introduction of a positive animal on to a negative farm. Vet. Rec. 140:90-92.
8. Hage, J.J., schkken, Y.H., Dijkstra, Th., Barkema, H.W., Valkengoed, P.H.R. and Wentink, G.H. 1998. Milk production and reproduction during a subclinical bovine herpes virus 1 infection on a dairy farm. Preventive Veterinary Medicine. 34:97- 106.
9. Hostnik, P. and Grom, J. 1997. Laboratory diagnostic and control of IBR/IPV infectious. Zlrink Veterinarske Facultete univerza Ljubljana. 34:29-35.
10. Miller, J.M., Van Der Maaten, M.J. and Whetstone, C.A. 1988. Effects of a bovine herpes virus 1 isolate on reproductive function in heifers: classification as a type-2 infection pustular vulvovaginitis. Virus by restriction endonuclease analysis of viral DNA. American Journal of Veterinary. 49:1653-1656.
11. Nylin, B., Stroger, U. and Ronsholt, L. 2000. A retrospective evaluation of BHV-1 antibody ELISA on bulk milk samples for BHV-1 status of Danish dairy herds. Preventive Veterinary Medicine. 47:91-105.
12. Perrin, B., Bitsch, V., Cordioli, P., Edwards, S., Eliot, M., Guerin, B., et al. 1993. A European comparative study of serological methods for the diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis . Revue Scientifique et Technique. 12(3):969-984.
13. Radostits, O.M., Gay, C.C., Blood, D.C. and Hinchcliffe, K.W. 2007. Veterinary Medicine, A textbook of the disease of cattle, sheep, goats and horses. W.B. Saunders, Ninth Edition, p:1147-1185.
14. Rosskopf, M., Staub, E. and Ackremann, M. 1993. Comparison of two ELISA systems for the detection of antibodies against IBR/IPV and against enzootic bovine leukemia virus. Schweizer Archivfur Tierheilkunde. 136: 258-267.
15. Straub, O.C. 2001. Advances in BHV-1 (IBR) research. J.Vet. Diag. Invest. 10:43-48.
16. Tekes, L., Markos, B.,Mate, Z. and Kudron, E.1999. Prevalence of BHV-1 infection in Hungarian cattle herds. Acta Veterinaria Hungarian. 47:303-309.
17. Witte, K.H., Hanneman, N.P., Dopatka, H.D. and Giesendorf, B. 1989. Technical improvement of a commercial ELISA to detect antibodies against bovine herpes virus1. Medical Microbiology and Immunology. 178:9-20.